一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆及功能表達(dá)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種花生逆境脅迫AhROLP1基因的克隆及功能表達(dá)方法，通過材料的準(zhǔn)備與處理、RNA的提取和cDNA的合成、使用RT-PCR進(jìn)行克隆合成出了逆境脅迫AhROLP1基因，該基因開放閱讀框為1620bp，共編碼540個氨基酸；基因氨基酸序列與與鷹嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果堿氧化酶同源性均達(dá)到了70%以上。通過熒光定量PCR驗證了AhROLP1在低溫，鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明該基因在三種非生物逆境脅迫下轉(zhuǎn)錄水平均有明顯升高，并且此后一直維持在較高的水平。將該基因通過轉(zhuǎn)基因手段導(dǎo)入擬南芥中，轉(zhuǎn)基因植株比對照具有明顯的耐冷、耐鹽和抗旱特性。
【專利說明】一種花生逆境脅迫AhROLPI基因的克隆及功能表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種花生逆境脅迫AhROLPl基因的克隆及功能表達(dá)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]花生為豆科落花生屬作物，富含油脂和蛋白，是我國重要的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。花生的產(chǎn)量和品質(zhì)受干旱、鹽堿等脅迫影響非常嚴(yán)重，全國每年因干旱引起的花生減產(chǎn)率達(dá)20%以上。但由于花生品種資源遺傳基礎(chǔ)狹窄，缺少高度抗旱、耐寒、耐鹽的基因源，利用常規(guī)育種方法難以培育出高抗品種。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，近年來利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物脅迫耐受能力的研究取得了顯著成果，對脅迫相關(guān)基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也有了更深入的了解。
[0003]牛心果堿氧化酶是催化芐基異喹啉(類)生物堿合成過程中的關(guān)鍵酶，催化牛心果堿生成斯氏紫堇堿(Liscombe and Facchini, 2008)。目前有關(guān)該基因功能的研究較少，其在非生物脅迫中的功能研究尚未見報道。本研究通過芯片雜交發(fā)現(xiàn)該基因在花生鹽處理芯片中表達(dá)上調(diào)明顯，隨后對該基因進(jìn)行了基因克隆及功能研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了提高花生生長的抗逆境能力，增強(qiáng)其耐鹽、抗旱、耐低溫能力，本發(fā)明提供了一種花生逆境脅迫基因AhROLPl的克隆及功能表達(dá)方法。
[0005]技術(shù)方案
[0006]一種花生逆境脅迫AhROLPl基因的克隆方法，其特征在于，主要包括以下步驟:
[0007](I)材料的準(zhǔn)備與處理:材料選擇花生花育33，花生種子在營養(yǎng)土和蛭石以2:1混合的土中萌發(fā)，萌發(fā)后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗，溫度為22-28°C，生長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續(xù)的非生物脅迫處理；
[0008]材料的低溫處理，將三葉期花生幼苗置于4°C光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，取處理時間分別為0h，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生葉片和根作為材料；對于耐鹽用NaCl處理；對于抗旱，用PEG6000處理；將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡在200mM NaCl或重量濃度20%PEG6000溶液中，在處理時間為0h，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h分別取花生的葉片和根作為材料，所有材料均保存于_80°C超低溫冰箱中備用；
[0009](2) RNA的提取和cDNA的合成
[0010]按照試劑盒操作手冊的方法用天根的RNeasy Mini Kit分離提取花生幼苗RNA。RQl RNase-free DNaseI將得到的RNA去除DNA污染后再進(jìn)行cDNA的合成。用M-MLVReverseTranscriptase 進(jìn)行 cDNA 的合成，25- μ L 反應(yīng)體系中包含 2 μ gRNA。在 42°C條件下經(jīng)過60min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上放置5min，之后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫籟0011](3)基因克隆
[0012]通過RT-PCR進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增所用的聚合酶為LA Taq?DNA polymerase，在25-yL 體系中加入以下成分:含 MgCl2 的2.5“1^ 10XPCR buffer ；2.5μ L IOmMdNTPs ；I μ L cDNA 模板；0.5yL LA polymerase 和 17.5 μ L (IdH2OtjPCR 反應(yīng)條件為:(a)94°C,5min ；
(b)94°C，45s ；55°C, 45s ；72°C, 90s ;共 35cycles ； (c) 72°C，IOmin0
[0013]擴(kuò)增基因全長所用弓I物為 AhROLPl-S: 5，-TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3，和 AhROLP1-A: 5 ’ -TAATTTTGAATGATGATTACCC-3，；
[0014]PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接pMD18_T Easy vector 并測序；
[0015]本發(fā)明的AhROLPl基因開放閱讀框為1620bp，共編碼540個氨基酸。
[0016]本發(fā)明的AhROLPl基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上通過Blast分析后發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列與鷹嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果堿氧化酶同源性均達(dá)到了 70%以上。
[0017]本發(fā)明的AhROLPl基因的核苷酸序列是序列表中序列I。
[0018]本發(fā)明的AhROLPl基因的氨基酸序列是序列表中序列2。
[0019]用熒光定量Real-time RT-PCR對AhROLPl基因逆境下的功能表達(dá)進(jìn)行分析，其方法如下:`
[0020]熒光定量PCR所用cDNA模板稀釋到8ng μ L—1，用的聚合酶是SYBR Premix ExTaqpolymerase,用的儀器是 LightCycler 2.0instrument system,每反應(yīng)體系加 2 μ L 稀釋的cDNA。
[0021]PCR 反應(yīng)程序如下:(l)95°C,10s ； (2) 95°C, 5s,40cycles ; (3)60。。，30s ；(4)72°C,IOs ;PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每10秒增加0.5°C。actinll為實驗的內(nèi)參基因；
[0022]AhROLPl熒光定量驗證用的引物序列為:QAhROLP 1-S:5’ -GTTGTGTTATTAGTTTCCTTAGCA-3’ 和 QAhROLPl-A:5’ -GGTGAGAAGAATCTGAATGGT-3’。
[0023]內(nèi)參基因actinll 所用引物序列為:QACT11_S:5’ -TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’和 QACTll-A:5’ -AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
[0024]本發(fā)明的有益效果:
[0025]通過熒光定量PCR驗證了 AhROLPl在低溫，鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明該基因在三種非生物逆境脅迫下轉(zhuǎn)錄水平均有明顯升高(圖2)。從圖2可以看出，AhROLPl在低溫處理的葉片和鹽處理的根中表達(dá)量均有明顯提高，并且此后一直維持在較高的水平(圖2A，B’)，在干旱處理的葉片和根中表達(dá)量均明顯增高，在葉片中增高倍數(shù)最高達(dá)到了 200倍以上(圖2C，C’)。以上結(jié)果表明AhROLPl可能在花生對逆境脅迫的適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。將該基因通過轉(zhuǎn)基因手段導(dǎo)入擬南芥中，轉(zhuǎn)基因植株比對照具有明顯的耐冷、耐鹽和抗旱特性。說明AhROLPl基因能顯著提高植物的抗逆性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1花生AhROLPl蛋白與其它植物牛心果堿氧化酶蛋白氨基酸序列比較NCBI上蛋白編號:VvR0LP，XP_002269462 ；CaROLP, XP_004486494 ；[0027]CsROLP, XP_004135723 ；GmROLP, XP_003546286 ；FvROLP, XP_004295451 ；S1R0LP,XP_004233150 ；MtR0LP,XP_003594610。
[0028]圖2AhR0LPl在低溫，NaCl，PEG6000處理下表達(dá)模式分析A, A’:
[0029]AhROLPl在低溫處理的花生葉片和根中表達(dá)變化；B，B’ =AhROLPl在200mMNaCl處理下的花生葉片和根中表達(dá)變化；c，C’ =AhROLPl在20%PEG6000處理下的花生葉片和根中
表達(dá)變化。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖與具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的進(jìn)一步限定。
[0031]本發(fā)明的具體實施過程為:
[0032]I實驗材料與方法
[0033]1.1實驗材料
[0034]實驗材料為花生花育33 (Arachis hypogaea L.cultivar Huayu33)?；ㄉN子在營養(yǎng)土和蛭石以2:1混合的土中萌發(fā)，萌發(fā)后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗，溫度為22-28°C，生長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續(xù)的非生物脅迫處理實驗。
[0035]對于低溫處理，將三葉期花生幼苗至于4°C光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，分別于處理的0h，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h取花生葉片和根作為實驗材料；對于耐鹽用NaCL處理；對于抗旱，用PEG6000處理。將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡在200mM NaCl或20%PEG6000溶液中，在處理的0h，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h分別取花生的葉片和根作為實驗材料。所有材料均保存于-80°C超低溫冰箱中備用。
1.2RNA的提取和cDNA的合成
[0036]本實驗用天根的RNeasyMiniKit分離提取花生幼苗RNA。RQl RNase-free DNaseI將得到的RNA去除DNA污染后再進(jìn)行cDNA的合成。用M-MLV Reverse Transcriptase進(jìn)行cDNA的合成，25-μ L反應(yīng)體系中包含2μ g RNA。在42 °C條件下經(jīng)過60min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上放置5min，之后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0037]1.3基因克隆
[0038]通過RT-PCR進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增所用的聚合酶為LATaq?DNApo lymerase (TaKaRa),在 25- UL 體系中加入以下成分:含 MgCl2 的 2.5 μ L10XPCR buffer ；2.5μ L IOmM dNTPs ；1 μ L cDNA 模板；0.5yL LA polymerase 和 17.5 μ LddH20。PCR 反應(yīng)條件為:(l)94°C,5min ；(2)94°C,45s ；55°C,45s ；72°C,90s ;共 35cycles ；(3) 72°C，lOmin。擴(kuò)增基因全長所用引物為 AhROLPl-S: 5’-TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3’和AhR0LPl-A:5’ -TAATTTTGAATGATGATTACCC-3’。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接pMD18-TEasyvector并測序。
[0039]1.4 熒光定量 Real-timeRT-PCR
[0040]熒光定量PCR所用cDNA模板稀釋到8ng μ L—1，用的聚合酶是SYBRPremix Ex Taqpolymerase (Takara)，用的儀器是 LightCycler 2.0 instrument system (Roche, Germany)，每反應(yīng)體系加2 μ L稀釋的cDNA。PCR反應(yīng)程序如下:(I) 95°C, 10s ； (2) 95°C, 5s, 40cycles ；(3)60°C，30s ; (4)72°C，10s。PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每10秒增加0.5°C。actinll為實驗的內(nèi)參基因。
[0041]AhROLPl熒光定量驗證用的引物序列為:QAhROLP 1-S:5’ -GTTGTGTTATTAGTTTCCTTAGCA-3’ 和 QAhROLPl-A:5’ -GGTGAGAAGAATCTGAATGGT-3’。
[0042]內(nèi)參基因actinll 所用引物序列為:QACT11_S:5’ -TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3’和 QACTll-A:5’ -AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
[0043]2實驗結(jié)果
[0044]2.1AhROLPl核苷酸全長及其編碼的氨基酸序列
[0045]通過PCR擴(kuò)增及測序，得到了目的基因，該基因開放閱讀框為1620bp，共編碼540個氨基酸。將該基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上通過Blast分析后發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列與鷹嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果堿氧化酶(reticulineoxidase-likeprotein)同源性均達(dá)到了 70%以上(圖1)，故將該基因命名為AhROLPl(Arachis hypogaea Reticuline Oxidase-Like Protein I)。
[0046]2.2AhR0LPl在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析
[0047]通過熒光定量PCR驗證了 AhROLPl在低溫，鹽脅迫和干旱脅迫下的表達(dá)模式，結(jié)果表明該基因在三種非生物逆境脅迫下轉(zhuǎn)錄水平均有明顯升高(圖2)。從圖2可以看出，AhROLPl在低溫處理的葉片和鹽處理的根中表達(dá)量均有明顯提高，并且此后一直維持在較高的水平(圖2A，B’)，在干旱處理的葉片和根中表達(dá)量均明顯增高，在葉片中增高倍數(shù)最高達(dá)到了 200倍以上(圖2C，C’)。以上結(jié)果表明AhROLPl在花生對逆境脅迫的適應(yīng)性中發(fā)揮重要作用。將該基因通過轉(zhuǎn)基因手段導(dǎo)入擬南芥中，轉(zhuǎn)基因植株比對照具有明顯的耐冷、耐鹽和抗旱特性。說明AhROLPl基因能顯著提高植物的抗逆性。
[0048]序列IAhROLPl核苷酸序列
【權(quán)利要求】
1.一種花生逆境脅迫AhROLPl基因的克隆方法，其特征在于，主要包括以下步驟: (1)材料的準(zhǔn)備與處理:材料選擇花生花育33，花生種子在營養(yǎng)土和蛭石以2:1混合的土中萌發(fā)，萌發(fā)后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗，溫度為22-28°C，生長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續(xù)的非生物脅迫處理； 材料的低溫處理，將三葉期花生幼苗置于4°C光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理，取處理時間分別為0h，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生葉片和根作為材料；對于耐鹽用NaCl處理；對于抗旱，用PEG6000處理；將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡在200mMNaCl或重量濃度20%PEG6000溶液中，在處理時間為Oh，lh，3h，6h，12h，24h，48h和72h分別取花生的葉片和根作為材料，所有材料均保存于_80°C超低溫冰箱中備用； (2)RNA的提取和cDNA的合成 按照試劑盒操作手冊的方法用天根的RNeasyMiniKit分離提取花生幼苗RNA, RQlRNase-free DNaseI將得到的RNA去除DNA污染后再進(jìn)行cDNA的合成，用M-MLV ReverseTranscriptase進(jìn)行cDNA的合成,25- μ L反應(yīng)體系中包含2 μ gRNA,在42 °C條件下經(jīng)過60min的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于冰上放置5min，之后將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫? (3)基因克隆 通過RT-PCR進(jìn)行克隆，PCR擴(kuò)增所用的聚合酶為LA Taq? DNA polymerase，在25-μ L體系中加入以下成分:含 MgCl2 的 2.5μ L IOXPCRbuffer ；2.5μ L IOmMdNTPs ；1 μ L cDNA模板；0.5yL LA polymerase 和 17.5 μ L ddH20。PCR 反應(yīng)條件為:(a) 94°C，5min ; (b) 94°C，45s ；55°C,45s ；72°C, 90s ;共 35cycles ； (c) 72°C, IOmin ； 擴(kuò)增基因全長所用引物為 AhROLPl-S: 5’ -TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA-3’ 和 AhROLPl-A:5’ -TAATTTTGAATGATGATTACCC-3’ ； PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物連接pMD18-TEasy vector 并測序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生逆境脅迫AhROLPl基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLPl基因開放閱讀框為1620bp，共編碼540個氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生逆境脅迫AhROLPl基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLPl基因的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上通過Blast分析后發(fā)現(xiàn)該基因氨基酸序列與鷹嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果堿氧化酶同源性均達(dá)到了 70%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生逆境脅迫AhROLPl基因的克隆方法，其特征在于，所述的AhROLPl基因的核苷酸序列是序列表中序列I。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種花生逆境脅迫AhROLPl基因的克隆及功能表達(dá)方法，其特征在于，所述的AhROLPl基因的氨基酸序列是序列表中序列2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5所述的任意一種花生逆境脅迫AhROLPl基因的功能表達(dá)方法，用熒光定量Real-timeRT-PCR對AhROLPl基因逆境下的功能表達(dá)進(jìn)行分析，其方法如下: 熒光定量PCR所用cDNA模板稀釋到8ng μ L—1，用的聚合酶是SYBR Premix Ex Taqpolymerase,用的儀器是LightCycler 2.0 instrument system,每反應(yīng)體系加 2 μ L稀釋的cDNA ；PCR 反應(yīng)程序如下:(I) 95°C，IOs ； (2) 95 V，5s,40cycles ； (3) 60°C，30s ； (4) 72°C，IOs ；PCR反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線，溫度增加梯度為每10秒增加0.50C ；actinll為實驗的內(nèi)參基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的花生逆境脅迫AhROLPI基因的功能表達(dá)方法，其特征在于，所述的AhROLPl熒光定 量驗證用的引物序列為=QAhROLPl-S:5’ -GTTGTGTTATTAGTTTCCTTAGCA -3’ 和 QAhROLPl-A:5’ -GGTGAGAAGAATCTGAATGGT-3’。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的花生逆境脅迫AhROLPl基因的功能表達(dá)方法，其特征在于，所述的內(nèi)參基因actinll所用引物序列為:QACT11_S:5’-TTGGAATGGGTCAGAA GGATGC-3’和QACTll-A:5’ -AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3’。
【文檔編號】C12N15/10GK103555738SQ201310513641
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】陳娜, 禹山林, 楊慶利, 遲曉元, 潘麗娟, 陳明娜, 王通, 王冕, 楊珍 申請人:山東省花生研究所