一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒、構建方法、重組工程菌及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒、構建方法、重組工程菌及應用，所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入煙草葉綠體rrn16基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列、煙草葉綠體rps16基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌聚磷激酶基因ppk和假單胞菌K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構建而成。本發(fā)明通過merT-merP將廢水中的有機汞和無機汞轉運到細菌細胞內(nèi)，通過merB1和merB2將有機汞降解為二價汞，通過ppk將二價汞螯合在細胞內(nèi)，降低汞對細菌細胞的毒性，將廢水中的汞積累在細菌細胞內(nèi)，通過收集重組工程菌菌體清除廢水中的汞污染。
【專利說明】—種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒、構建方法、重組工程菌及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒，同時還涉及該重組質粒的構建方法、包含該重組質粒的重組工程菌及該重組工程菌的應用，屬于基因工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]土壤是人類賴以生存的主要自然資源之一，也是人類生態(tài)環(huán)境的重要組成部分。隨著工業(yè)、城市污染的加劇和農(nóng)用化學物質種類、數(shù)量的增加，土壤重金屬污染日益嚴重。汞是其中一種主要的重金屬污染物。農(nóng)用土壤重金屬污染主要來自于污水灌溉。據(jù)我國農(nóng)業(yè)部進行的全國污灌區(qū)調查，在約140萬公頃的污水灌區(qū)中，遭受重金屬污染的土地面積占污水灌區(qū)面積的64.8%，其中輕度污染的占46.7%，中度污染的占9.7%，嚴重污染的占
8.4%。因此，在廢水排出工廠前進行去汞處理，對于保障人類身體健康非常重要。
[0003]廢水中的汞主要有三種形態(tài):金屬汞、無機汞和有機汞,其中有機汞的毒性最大。運用生物方法對被汞污染的廢水進行處理能夠將對周圍環(huán)境的影響降低到最小程度。在目前已知的對萊具有耐受性的生物中，假單胞菌(Pseudomonas) K_62菌株對萊的耐受性最強，其對汞的耐受性比大腸桿菌高1000倍左右。該菌具有對汞極強的耐受能力主要起因于該菌細胞內(nèi)的兩個質粒:pmr26和pmr28。pmr26含有兩個抗萊操縱子mer,這兩個操縱子之間相隔Ikb左右，其中一個操縱子使該菌對無機汞和有機汞都具有抗性，而另一個操縱子對有機萊則非常敏感。將這兩個操縱子分別插入到質粒pBluescript II,并命名為pmral7和pmrbOl。測序后發(fā)現(xiàn)操縱子pmral7含有6個開放閱讀框,其中5個分別被鑒定為merR、merT、merP、merA、merBl。操縱子pmrbOl含有三個開放閱讀框，分別被鑒定為merR、merB2、merDo MerR是一個調芐基因,對結構基因的轉錄進行正向調控或負向調控；merD與轉錄共調控的功能相關；merT、merP、merA、merB分別編碼二價萊離子轉運蛋白、二價萊離子外周胞質結合蛋白、汞離子還原酶和有機汞裂解酶。在多數(shù)情況下，merB緊挨著位于merA的下游。PseudomonasK-62對有機萊的抗性主要源于merBl和merB2編碼的裂解酶。MerBl負責將甲基汞轉化為二價汞，merB2負責將苯基汞轉化為二價汞，merA負責將二價汞還原為零價汞。轉運蛋白merT和merP負責將有機汞和無機汞運輸?shù)郊毎麅?nèi)，并將零價汞從外周胞質中清除出去。MerG位于merA和merB I之間,其預測的氨基酸序列含有一個引導序列,該引導序列包含一個親水區(qū)域和一個信號肽剪切位點；該信號序列與已知的外胞周質蛋白的引導序列同源。MerG位于外胞周質上；將merG刪除以后，細菌對二價汞的抗性并沒有發(fā)生改變，但是對苯基汞的抗性變?nèi)趿?；刪除掉merG對于merA和merB編碼的酶的活性也沒有影響。表明merG只參與了對苯基汞的抗性，其機理可能是降低了細胞對苯基汞的通透性。
[0004] 綜上所述，Pseudomonas K_62對汞具有極強抗性的機理是它能夠將細胞內(nèi)的有機
汞轉化為二價汞，然后將二價汞轉化為零價汞，如下:
[0005]
【權利要求】
1.一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒，其特征在于，所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入煙草葉綠體rrnl6基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列、煙草葉綠體rpsl6基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)聚憐激酶基因ppk和假單胞菌(Pseudomonas) K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構建而成。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒，其特征在于，包含有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3.一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒的構建方法，其特征在于，包括以下步驟: (O根據(jù)假單胞菌K-62菌株質粒pmr26和pmr28，合成人工操縱子merT-merP-merBl-merB2,將其與質粒pET28a進行連接,連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a,篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為Pl ； (2)以產(chǎn)氣腸桿菌DNA為模板，設計引物，擴增ppk基因；將ppk基因和質粒pi酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為p2 ； (3)設計引物，擴增含有煙草葉綠體rrnl6基因強啟動子和大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’ UTR序列中的核糖體結合位點保守序列； (4)將含有煙草葉綠體rrnl6基因強啟動子和大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列和質粒pET28a酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為p3 ； (5)以質粒p2為模板，設計引物，擴增人工操縱子merT-merP-merBl-merB2-ppk;將merT-merP-merBl-merB2-ppk和質粒p3酶切后進行連接,連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a,篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒，命名為P4 ； (6)以煙草葉綠體DNA為模板，設計引物，擴增rpsl63’端非編碼區(qū)基因序列；將rpsl63’端非編碼區(qū)基因與質粒p4酶切后進行連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a，篩選陽性克隆過夜培養(yǎng)，提取質粒，酶切和測序鑒定結果與預期相符的質粒即為用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組質粒。
4.一種用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組工程菌，其特征在于，所述重組質粒是在質粒pET28a的基礎上插入煙草葉綠體rrnl6基因強啟動子、大腸桿菌T7噬菌體基因10的5’UTR序列中的核糖體結合位點保守序列、煙草葉綠體rpsl6基因的3’端非編碼區(qū)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)聚憐激酶基因ppk和假單胞菌(Pseudomonas) K-62菌株去掉merA、merG后的mer操縱子構建而成。
5.根據(jù)權利要求4所述的用于清除工業(yè)廢水汞污染的重組工程菌，其特征在于，所述重組工程菌的宿主為大腸桿菌BL21。
6.一種如權利要求4所述的重組工程菌在清除工業(yè)廢水汞污染方面的應用。
【文檔編號】C12N15/66GK103525849SQ201310507408
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月24日 優(yōu)先權日:2013年10月24日
【發(fā)明者】舒海燕, 常勝合 申請人:舒海燕, 常勝合