用于檢測hcv的雙重探針測定法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增和檢測樣品中的HCV靶核酸的方法，其中實(shí)施所述樣品中核酸的擴(kuò)增。此擴(kuò)增牽涉聚合酶、用于生成擴(kuò)增子的引物和至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針。通過檢測上文提及的探針與擴(kuò)增子的所述不同序列部分的雜交引起對所得擴(kuò)增子的檢測。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于擴(kuò)增和檢測HCV靶核酸的用途和試劑盒，其牽涉使用至少兩種對擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針。
【專利說明】用于檢測HCV的雙重探針測定法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于體外診斷學(xué)領(lǐng)域。在此領(lǐng)域內(nèi)，其關(guān)注使用至少兩種對擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的探針擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的靶核酸，且特別是擴(kuò)增和檢測包括具有序列變異和/或個別突變的亞組的靶核酸。本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有至少兩種對擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的探針的用途和試劑盒。
[0002]發(fā)明背景
[0003]在分子診斷學(xué)領(lǐng)域中，核酸的擴(kuò)增和檢測具有相當(dāng)大的意義。核酸擴(kuò)增和檢測的診斷性應(yīng)用的例子是病毒諸如人乳頭狀瘤病毒(HPV)、西尼羅病毒(WNV)的檢測或者針對人免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)和/或丙肝病毒(HCV)等的存在的獻(xiàn)血常規(guī)篩選。此外，所述擴(kuò)增技術(shù)適用于細(xì)菌性靶物，或?qū)δ[瘤學(xué)標(biāo)志物或其它靶物的分析。
[0004]在物種內(nèi)，微生物或病原體經(jīng)常基于核酸序列變異依照獨(dú)特的組、基因型或亞型分類(即，HCV、HIV、HPV、等)。不過，在體外診斷裝置中，應(yīng)當(dāng)檢出和/或正確量化所有組、基因型或亞型以避免假陰性診斷或錯誤滴度測定。這對用于例如檢測HIV和HCV的分子診斷測定法提出相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。此外，此類病原體的不斷突變和重組在其靶核酸內(nèi)產(chǎn)生越來越多的多樣性，其也必須由分子診斷測定法覆蓋。
[0005]最主要且廣泛使用的擴(kuò)增技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。其它擴(kuò)增反應(yīng)包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、聚合酶連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、缺口 -LCR、修復(fù)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、3SR、NASBA、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、和QP擴(kuò)增，等等。
[0006]用于基于PCR的分析的自動化系統(tǒng)經(jīng)常利用同一反應(yīng)容器中PCR過程期間產(chǎn)物擴(kuò)增的實(shí)時檢測。此類方法的關(guān)鍵是使用攜帶報(bào)告基團(tuán)或標(biāo)記物的經(jīng)修飾的寡核苷酸。
`[0007]生物學(xué)樣品中微生物核酸的檢測例如對于識別個體的感染是至關(guān)重要的。由此，例如，對于用于檢測病毒性感染的測定法的一項(xiàng)重要要求是包容性，其限定為使得必須避免由于病毒基因組上由突變引起的變異序列區(qū)所致的假陰性結(jié)果或滴度量化不足。與低病毒載量組合，相應(yīng)基因組內(nèi)可能不擴(kuò)增和/或檢出的突變或部分突變序列增強(qiáng)獲得假陰性或錯誤量化結(jié)果的可能性。
[0008]已經(jīng)發(fā)表了幾種選項(xiàng)以提高分子測定法的包容性。最近，建立了病原體基因組內(nèi)的兩種不同且不交疊的靶序列的共擴(kuò)增(US2010/0041040)。然而，若不能在病原體的基因組內(nèi)鑒定兩個適度保守的靶區(qū)域或若用于擴(kuò)增和檢測兩個獨(dú)立靶區(qū)域的寡核苷酸在主混合物中彼此干擾，則此方法一般不可適用。
[0009]在此背景中，例如，現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)提供了用于擴(kuò)增和檢測的方法，其牽涉超過一種基于同質(zhì)擴(kuò)增子序列的探針，目的是提高測定法靈敏度(Yip等，2005，Clin.Chem.51(10))。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明的一個方面是用于擴(kuò)增和檢測樣品中靶核酸的方法，所述靶核酸包含具有序列變異和/或個別突變的亞組，其中實(shí)施所述樣品中核酸的擴(kuò)增。此擴(kuò)增牽涉聚合酶、核苷酸單體、用于生成擴(kuò)增子的引物和至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針。通過檢測上文提及的探針與所述擴(kuò)增子的所述不同序列部分的雜交引起對所得擴(kuò)增子的檢測。
[0012]本發(fā)明還涉及至少兩種對同一擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的非交疊可檢測核酸探針的用途。
[0013]此外，提供了用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的靶核酸的試劑盒，所述靶核酸包括具有序列變異和/或個別突變的亞組。試劑盒包含擴(kuò)增試劑，該擴(kuò)增試劑包含聚合酶、核苷酸單體、用于生成擴(kuò)增子的引物和至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針。
[0014]發(fā)明詳述
[0015]在第一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的靶核酸的方法，所述靶核酸包括具有序列變異和/或個別突變的亞組，所述方法包括下列步驟:
[0016]a)使來自所述樣品的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑包含聚合酶、核苷酸單體、用于生成擴(kuò)增子的引物和至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針；
[0017]b)在一定條件下將所述核酸與所述擴(kuò)增試劑一起溫育一段時間，所述條件和時間足以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)；
[0018]c)通過檢測所述可檢測探針與所述擴(kuò)增子的所述不同序列部分的雜交來檢測所述擴(kuò)增子的存在或缺乏，
[0019]其中所述擴(kuò)增子的存在指示所述樣品中包括具有序列變異和/或個別突變的亞組的所述靶核酸的存在。
`[0020]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，上文描述的方法的一個或多個步驟是自動化的。在別的實(shí)施方案中，所有步驟是自動化的。與手動方法相比，自動化系統(tǒng)提供許多優(yōu)點(diǎn)，特別是在體外診斷學(xué)領(lǐng)域中。使技術(shù)人員能夠在啟動方法后離開系統(tǒng)，如此縮短動手時間，并且為在相對較短時間段中的高樣品通量提供基礎(chǔ)，同時還提高結(jié)果的可再現(xiàn)性。這尤其但不僅在要盡可能快速篩選大量臨床樣品(諸如例如在血液庫中)的情況中是一項(xiàng)重要的特征。
[0021]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“擴(kuò)增” 一般指自靶核酸生成多個核酸分子，其中引物與靶核酸分子上的特定位點(diǎn)雜交，以提供聚合酶延伸的啟動位點(diǎn)。可以通過本領(lǐng)域中一般已知的任何方法實(shí)施擴(kuò)增，諸如但不限于:標(biāo)準(zhǔn)PCR、實(shí)時PCR、長PCR、熱啟動PCR、qPCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR和等溫?cái)U(kuò)增。
[0022]可以有利的是，實(shí)時監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)，即在擴(kuò)增自身期間檢測靶核酸和/或其擴(kuò)增物。
[0023]如本文中使用的，術(shù)語“檢測”指以評估樣品中靶核酸的存在或缺乏為目的的測試。
[0024]“靶核酸”指核苷酸的聚合化合物，如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的?！鞍泻怂帷痹诒疚闹杏糜谥笜悠分袘?yīng)當(dāng)分析的核酸，即應(yīng)當(dāng)測定其在樣品中的存在、不存在和/或量。靶核酸可以是基因組序列，例如特定基因的部分，或RNA。在其它實(shí)施方案中，靶核酸可以是病毒的或細(xì)菌的。靶核酸可以包含在擴(kuò)增子區(qū)中具有獨(dú)特序列變異或獨(dú)特個別突變的亞組。這對于顯示由于高突變或重組率及缺乏修復(fù)機(jī)制所致的重大遺傳變異的病原體(如病毒)的核酸尤其如此。[0025]術(shù)語“擴(kuò)增子”指在擴(kuò)增特定靶核酸后生成的多核苷酸分子(或共同地多個分子)。用于生成擴(kuò)增子的擴(kuò)增方法可以是任何合適的方法，最通常，例如PCR方法。擴(kuò)增子通常但不排他是DNA擴(kuò)增子。擴(kuò)增子可以是單鏈的或雙鏈的，或者任何濃度比率的其混合物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增子由引物序列間具有異質(zhì)序列的亞群構(gòu)成。
[0026]上文所列的方法在一些實(shí)施方案中基于供體熒光模塊和接受體熒光模塊之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)。在這些實(shí)施方案中，對擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針是FRET探針。代表性的供體熒光模塊是熒光素，而代表性的相應(yīng)接受體熒光模塊包括LC-紅640、LC-紅705、CY5、和CY5.5。通常，檢測包括以供體熒光模塊吸收的波長激發(fā)樣品，并且顯現(xiàn)和/或測量由相應(yīng)的接受體熒光模塊發(fā)射的波長。在上文描述的方法中，檢測在一些實(shí)施方案中繼之以定量FRET。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“FRET”或“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”或“弗斯特(Foerster)共振能量轉(zhuǎn)移”可以互換使用，指至少兩種生色團(tuán)(即供體生色團(tuán)和接受體生色團(tuán)(稱為淬滅劑))之間的能量轉(zhuǎn)移。在通過具有合適波長的光照射激發(fā)供體時，供體通常將能量轉(zhuǎn)移至接受體。接受體通常以具有不同波長的光照射形式再發(fā)射轉(zhuǎn)移的能量。在接受體是“黑暗”淬滅劑時，它以與光不同的形式耗散轉(zhuǎn)移的能量。特定熒光團(tuán)是起供體還是接受體作用取決于FRET對的另一成員的特性。常用的供體-接受體對包括FAM-TAMRA對。常用的供體是例如熒光素、香豆素、花青和羅丹明。常用的淬滅劑是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗萍滅劑包括 BlackHole 萍滅劑 ? (BHQ) (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.)、1wa Black?(Integrated DNA Tech., Inc., Coralvilie, 1wa)、和 BlackBerry? 萍滅劑650 (BBQ-650)(Berry&Assoc., Dexter, Mich.)。
[0027]FRET技術(shù)的一種常見形式利用形成HybPiObe對的兩種雜交探針?？梢杂貌煌瑹晒饽K標(biāo)記每種探針。探針一般設(shè)計(jì)為在靶DNA分子(例如擴(kuò)增產(chǎn)物)中彼此極其接近地雜交。通過例如LIGHTCYCLER?儀的光源以470nm激發(fā)供體熒光模塊，如例如熒光素。在FRET期間，熒光素將其能量轉(zhuǎn)移至接受體熒光模塊，諸如例如LIGHTCYCLER? -紅640 (LC? -紅 640)或 LIGHTCYCLER?.-紅 705 (LC? -紅 705)。然后，接受體熒光模塊發(fā)射較長波長的光，H:通過LIGHTCYCLER?儀的光學(xué)檢測系統(tǒng)檢測。僅在熒光模塊在直接局部接近性中(通常約I至5個核苷酸的距離)時且在供體熒光模塊的發(fā)射光譜與接受體熒光模塊的吸收光譜交疊時可以發(fā)生有效的FRET。發(fā)射信號的強(qiáng)度可以與初始靶核酸分子的數(shù)目相關(guān)聯(lián)。在本發(fā)明的上下文中，如本領(lǐng)域技術(shù)人員也領(lǐng)會的，HybProbe對應(yīng)當(dāng)理解為功能性統(tǒng)一體及如此單一探針，因?yàn)榇祟悓Φ膬蓚€成員必須一起使用。因此，HybProbe對的獨(dú)特探針沒有形成“對擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針”，即使它們在結(jié)合擴(kuò)增子時不交疊。然而，例如兩種或更多種HybProbe對在本發(fā)明的意義中是“對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針”，因?yàn)槿缟衔拿枋龅?，HybPiObe對應(yīng)當(dāng)理解為單一探針。
[0028]在上文描述的方法的一個實(shí)施方案中，對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針是HybProbe對。
[0029]此實(shí)施方案賦予幾項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。例如，由于此檢測形式的探針不降解，可以通過監(jiān)測其雜交的溫度依賴性對每個HybProbe對實(shí)施解鏈曲線分析。如本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，解鏈曲線分析適合于確認(rèn)結(jié)果或者甚至可提供比監(jiān)測單一溫度的雜交可以產(chǎn)生的信息更為詳細(xì)的例如關(guān)于靶核酸身份的信息。
[0030]在cobas? TaqMan?系統(tǒng)上檢測擴(kuò)增子形成利用單鏈雜交探針(又稱作“5’ -核酸酶探針”)。術(shù)語“5’ -核酸酶探針”指包含至少一種光發(fā)射標(biāo)記模塊，并且在5’ -核酸酶反應(yīng)中使用以實(shí)現(xiàn)靶核酸檢測的寡核苷酸。在一些實(shí)施方案中，例如，5’ -核酸酶探針僅僅包含單一光發(fā)射模塊(例如熒光染料，等等)。在某些實(shí)施方案中，5’ -核酸酶探針包含自身互補(bǔ)性的區(qū)域，使得探針能夠在選定的條件下形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步例示，在一些實(shí)施方案中，5’-核酸酶探針包含至少兩種標(biāo)記模塊，并且在將兩種標(biāo)記物之一切割或以其它方式與寡核苷酸分開后發(fā)射升高強(qiáng)度的照射。在某些實(shí)施方案中，用兩種不同熒光染料(例如5’端報(bào)告物染料和3’端淬滅劑染料或模塊)標(biāo)記5’ -核酸酶探針。在一些實(shí)施方案中，在與末端位置不同的一個或多個位置處標(biāo)記5’ -核酸酶探針，或者在末端位置外還在一個或多個位置處標(biāo)記5’ -核酸酶探針。在探針完整時，能量轉(zhuǎn)移通常在兩種熒光團(tuán)間發(fā)生，使得至少部分淬滅來自報(bào)告物染料的熒光發(fā)射。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的延伸步驟期間，例如，通過例如Taq聚合酶或具有5’至3’核酸酶活性的另一種聚合物(如例如Z05聚合酶)的此活性切割與模板核酸結(jié)合的5’ -核酸酶探針，使得不再淬滅報(bào)告物染料的熒光發(fā)射。例不性的5’ -核酸酶探針記載于例如US5, 210，015。在一些實(shí)施方案中，可以用兩種或更多種不同報(bào)告物染料和3’端淬滅劑染料或模塊標(biāo)記5’-核酸酶探針。例如，以此形式使用的典型熒光染料是FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan500和CY5.5，等等。
[0031]在上文所描述的方法的一個實(shí)施方案中，對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針是5’ -核酸酶探針。
[0032]可檢測探針可以與雙鏈擴(kuò)增子的相同或不同鏈雜交。
[0033]在上文描述的方法的一些實(shí)施方案中，至少兩種可檢測探針與所述擴(kuò)增子的不同鏈雜交。
[0034]在此情況中，就選 擇引物和探針序列及如此相應(yīng)擴(kuò)增子上的結(jié)合位點(diǎn)而言給技術(shù)人員提供升高的靈活性。例如，在由于寡核苷酸內(nèi)的特定序列所致的二級結(jié)構(gòu)形成的情況中，可能重要的是能夠轉(zhuǎn)換成不同序列及如此所述擴(kuò)增子上的不同結(jié)合位點(diǎn)。此外，若可檢測探針結(jié)合不同鏈，諸如第一探針結(jié)合雙鏈擴(kuò)增子的有義鏈，而第二探針結(jié)合反義鏈，則降低那些探針在其相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)處彼此干擾的風(fēng)險(xiǎn)。
[0035]在上文描述的方法的別的實(shí)施方案中，至少兩種可檢測探針與所述擴(kuò)增子的相同鏈雜交。
[0036]在所述后一種實(shí)施方案中，有可能雜交對擴(kuò)增子中彼此極其接近的不同序列部分特異性的多種可檢測探針。這由于相應(yīng)外切核酸酶需要一些空間來結(jié)合和切割5’-核酸酶探針的情況而是令人驚訝的。但是，發(fā)明人已經(jīng)顯示了此類探針即使在彼此間距離僅幾個堿基處也能與擴(kuò)增子雜交。這使技術(shù)人員能夠使用超過一種對獨(dú)特序列部分特異性的可檢測探針，各自針對相對較短長度的擴(kuò)增子。依照上文描述的方法，即使靶核酸的短區(qū)段也能充當(dāng)多種探針的合適靶物，如此賦予上文描述的益處，諸如例如信號增強(qiáng)和升高的針對遺傳變異(如例如點(diǎn)突變)的耐受性。
[0037]如此，在上文描述的方法的一個實(shí)施方案中，對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針以彼此不超過100個堿基的距離，在一些實(shí)施方案中，彼此1、5、10、20、30、40或50個堿基至60、70、80、90、或100個堿基的距離與擴(kuò)增子雜交。在一些實(shí)施方案中，距離是40至80、或50至70、或55至60個堿基，或者它是58個堿基。在此背景中，“距離”意指擴(kuò)增子中在可檢測探針與相同鏈雜交的情況中位于與它們雜交的那些擴(kuò)增子堿基間的堿基數(shù)目。若它們與不同鏈雜交，則相應(yīng)計(jì)算距離，其中雙鏈擴(kuò)增子的一條鏈的每個堿基在另一條鏈上具有與其形成喊基對的相應(yīng)喊基。
[0038]在一些實(shí)施方案中，在基于循環(huán)的擴(kuò)增技術(shù)(諸如PCR)的每個循環(huán)步驟后實(shí)施檢測。在一些實(shí)施方案中，實(shí)時實(shí)施檢測。通過使用商品化實(shí)時PCR儀(例如LightCycler?
或TaqMan?)，PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測可以以縮短相當(dāng)大的循環(huán)時間在單個閉合小杯
中組合。由于檢測與擴(kuò)增同時發(fā)生，因此實(shí)時PCR方法消除對操作擴(kuò)增產(chǎn)物的需要，并且降低擴(kuò)增產(chǎn)物間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。在上文描述的兩種檢測形式中，發(fā)射信號的強(qiáng)度可以主要與初始靶核酸分子的數(shù)目相關(guān)聯(lián)。
[0039]“樣品”是可以進(jìn)行診斷測定法的任何材料，并且一般指可能含有靶核酸的介質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，“樣品”自生物學(xué)來源衍生。例如，樣品可以是臨床樣品。在一些實(shí)施方案中，所述樣品自人衍生，并且是體液。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，樣品是人全血或血清、血漿、尿液、痰、汗液、生殖器或口腔或鼻拭子、可移液的糞、溶解的組織樣品、或脊髓液，等等。可以將樣品移液或轉(zhuǎn)化成可移液形式，使得術(shù)語“樣品”包含同質(zhì)或均質(zhì)化液體，而且還有乳狀液、懸浮液，等等。例如，樣品也可以是進(jìn)行增溶處理以提取和純化核酸的最初固體樣品(即，組織樣品)。
[0040]如本文中使用的，“聚合酶”指能夠從較小元件諸如核苷酸合成核酸的酶。在一些實(shí)施方案中，聚合酶是熱穩(wěn)定性聚合酶。術(shù)語“熱穩(wěn)定性聚合酶”指對熱穩(wěn)定的，熱抗性的，并且保持足以實(shí)現(xiàn)隨后多核苷酸延伸反應(yīng)的活性，而且在受到升高的溫度處理達(dá)對于實(shí)現(xiàn)雙鏈核酸變性必需的時間時不被不可逆變性(失活)的酶。對于核酸變性必需的加熱條件是本領(lǐng)域中公知的，并且在例如美國專利N0.4，683，202,4, 683，195、和4，965，188中例示。如本文中使用的，熱穩(wěn)定性聚合酶適合于在溫度循環(huán)反應(yīng)(諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(“PCR”))中使用。出于本文中的目的的不可逆變性指酶活性的永久且完全的喪失。對于熱穩(wěn)定性聚合酶，酶活性指催化核苷酸的組合以正確的方式形成與模板核酸鏈互補(bǔ)的多核苷酸延伸產(chǎn)物。出于擴(kuò)增目的，所述核苷酸以單體形式存在，因此，它們在本發(fā)明的上下文中又稱為“核苷酸單體”。經(jīng)常，例如，聚合酶(諸如例如熱穩(wěn)定性DNA聚合酶)使用的此類核苷酸單體是核苷三磷酸、或核苷四磷酸，等等。來自嗜熱細(xì)菌的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶包括例如來自海棲熱袍菌(Thermotoga maritime)、水生棲熱菌(Thermus aquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、黃色棲熱菌(Thermus fIavus)、絲狀棲熱菌(Thermusfiliformis)、棲熱菌屬物種Spsl7、棲熱菌屬物種Z05、Thermus caldophilus、熱堅(jiān)芽抱桿菌(Bacillus caldotenax)、那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neopolitana)、和非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus)的 DNA 聚合酶。
[0041]術(shù)語“引物”在本文中如本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的那樣使用，指能夠引發(fā)由模板依賴性DNA聚合酶進(jìn)行的DNA合成的寡聚化合物，主要指寡核苷酸，但也指經(jīng)修飾的寡核苷酸，即引物的3’端提供游離的3’ -OH基團(tuán)，可以通過建立3’至5’磷酸二酯連接的模板依賴性DNA聚合酶對所述游離的3’ -OH基團(tuán)附著其它核苷酸，其中使用三磷酸脫氧核苷且其中釋放焦磷酸。
[0042]“探針”或“可檢測探針”也指天然的或經(jīng)修飾的寡核苷酸。如本領(lǐng)域中已知的，探針滿足檢測分析物或擴(kuò)增物的目的。在本發(fā)明的上下文中，例如，可以使用探針來檢測靶核酸和/或?qū)φ蘸怂岬臄U(kuò)增物。出于可檢測性的目的，探針通常攜帶標(biāo)記物。
[0043]在方法的一些實(shí)施方案中，至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針攜帶相同類型的標(biāo)記物，并且如此不能區(qū)別源自個別探針的信號。在其它實(shí)施方案中，它們攜帶發(fā)射不同波長信號的不同標(biāo)記物，從而可以用合適的儀器區(qū)別來自至少兩種探針的信號。
[0044]“標(biāo)記物”(經(jīng)常稱為“報(bào)告基團(tuán)”)一般是使與其結(jié)合的核酸，特別是寡核苷酸或經(jīng)修飾的寡核苷酸，以及任何核酸與樣品的剩余部分可區(qū)別的基團(tuán)。例如，在本發(fā)明的背景中有用的標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物，其可以是熒光染料諸如例如熒光素染料、羅丹明染料、花菁染料、或香豆素染料。例如，在本發(fā)明的背景中有用的熒光染料是？41、冊乂、從270、041^635、香豆素 343、Quasar705、Cyan500、CY5.5、LC-紅 640、LC-紅 705、TAMRA、或 CY5。
[0045]在本發(fā)明的上下文中，任何引物和/或探針都可以是經(jīng)過化學(xué)修飾的，即引物和/或探針包含經(jīng)修飾的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探針或引物是經(jīng)修飾的寡核苷酸。
[0046]如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，術(shù)語“特異性”在引物和探針的背景中指對獨(dú)特核酸“特異性”的引物或探針在嚴(yán)格條件下結(jié)合所述核酸。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明背景中使用的探針與擴(kuò)增子的不同序列部分是至少80%相同的。在另一個實(shí)施方案中，探針序列包含選自下組的序列的至少12個連續(xù)核苷酸或其相應(yīng)的互補(bǔ)核酸序列:SEQ ID NOl至8，而引物包含SEQ ID N09至15的至少12個連續(xù)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，選擇的探針和/或引物序列由12至60個核苷酸，或者20至60個核苷酸，或者選自所述SEQ ID NO的精確序列或其互補(bǔ)核酸序列組成。技術(shù)人員理解，在本發(fā)明的意義中，形成功能性實(shí)體的探針對(諸如例如以LightCycler?形式使用的Hybprobe對)不是“至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同
序列部分特異性的可檢測探針”。認(rèn)`為該對中的兩種HybpiObe是一個單元，并且僅可以一起檢出，而在本發(fā)明的背景中的至少兩種探針之每種單獨(dú)可檢出。
[0047]此外，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“交疊”意指兩種或更多種寡核苷酸(特別是上文提及的至少兩種可檢測探針)包含相同(在與相同鏈結(jié)合時)或互補(bǔ)(在與不同鏈結(jié)合時)序列區(qū)段。在一些實(shí)施方案中，上文描述的方法中使用的探針不交疊，并且如此在對擴(kuò)增子上的特定位點(diǎn)的結(jié)合中不競爭。在結(jié)合時，所述兩種或更多種探針與所述擴(kuò)增子的不同序列區(qū)段雜交。與交疊探針相比，本發(fā)明的上下文中使用的可檢測探針是有利的。
[0048]術(shù)語“雜交” 一般指其核苷酸序列一致的不同核酸分子間的堿基配對。術(shù)語“雜交”和“退火”可互換使用。
[0049]如在上文描述的方法中實(shí)施的，將兩種或更多種針對同一擴(kuò)增子的不同序列部分的探針導(dǎo)致顯著降低的在定性測定法中獲得假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。此外，在定量測定法中，降低對例如病毒滴度定量不足的風(fēng)險(xiǎn)。由于升高的測定法包容性和穩(wěn)健性，可以容易地使用最小數(shù)目的寡核苷酸檢測并量化給定生物體內(nèi)的多種不同基因型、亞型和突變體。在所述方面，情況可以是某種基因型、亞型或突變體不被所有至少兩種可檢測探針雜交。例如，在兩種探針的情況中，一種可以由于靶擴(kuò)增子的特定序列變體而不結(jié)合靶擴(kuò)增子，而另一種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的探針仍能夠與其相應(yīng)的靶序列雜交。這樣，擴(kuò)增子的檢測仍會是有可能的。在不同探針攜帶不同標(biāo)記物的實(shí)施方案中，也可以有可能測定哪些探針雜交而哪些探針不然。
[0050]基于上文描述的方法的測試的生命周期得到延長，因?yàn)樗軌蛏踔撂幚斫?jīng)由選擇壓力(例如由于新抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物所致)由微生物(諸如例如病毒)產(chǎn)生的新變體。鑒于病毒基因組內(nèi)的高度突變，在上文描述的方法的一個實(shí)施方案中，所述靶核酸是病毒核酸。
[0051]通過應(yīng)用上文描述的方法，定性測定法的總體包容性得到顯著提高，并且使定量測定法中的滴度測定變化性最小化。
[0052]如技術(shù)人員已知，包容性的測量是以與沒有顯著偏離共有序列的標(biāo)準(zhǔn)隔離群等同的靈敏度檢測攜帶突變的病毒亞組和隔離群。測定法的靈敏度是LOD (檢測限)，指樣品中最低可檢出的核酸量或濃度。低“L0D”對應(yīng)于高靈敏度，且反之亦然?！癓0D”通常依靠單位“cp/ml”(特別是在核酸是病毒核酸時)，或者以IU/ml表述。“Cp/ml”意指“每毫升的拷貝”，其中“拷貝”是相應(yīng)核酸的拷貝。IU/ml代表“國際單位/ml ”，指WHO標(biāo)準(zhǔn)品。WHO標(biāo)準(zhǔn)品一般自具有與共有序列接近的基因組的標(biāo)準(zhǔn)隔離群建立。
[0053]一種用于計(jì)算LOD的廣泛使用的方法是“Probit (概率單位)分析”，其是一種分析刺激物(劑量)和可數(shù)性(quantal)(全有或全無)響應(yīng)之間關(guān)系的方法。在典型的可數(shù)性響應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，對動物組給予不同劑量的藥物。記錄每個劑量水平的百分比瀕死。然后，可以使用Probit分析來分析這些數(shù)據(jù)。Probit模型假定百分比響應(yīng)與對數(shù)劑量的關(guān)系呈累積正態(tài)分布。也就是說，可以使用對數(shù)劑量作為變量來從累積法線(cumulative normal)中讀出百分比瀕死。使用正態(tài)分布而不是其它概率分布，影響在可能的劑量的高和低末端處的預(yù)測響應(yīng)率，但是接近中間具有很少的影響。
[0054]Probit分析可以以獨(dú)特的“命中率”應(yīng)用。如本領(lǐng)域中已知的，“命中率”通常以百分比[%]表示，并且指示在特定濃度的分析物時陽性結(jié)果的百分比。如此，例如，LOD可以以95%命中率測定，這意味著對真陽性樣品的95%有效結(jié)果測定呈陽性的背景計(jì)算L0D。
[0055]上文描述的方法在檢測丙肝病毒(HCV)的測定法中是特別有利的。如此，在上文描述的方法的一個實(shí)施方案中，靶核酸是HCV的核酸。
[0056]表述“丙肝病毒類型”指基于其基因組構(gòu)造(例如系統(tǒng)發(fā)生分析)將丙肝病毒分類。將HCV隔離群分類成特定類型的范疇反映其與其它HCV隔離群的基因組相關(guān)性及其與其它HCV隔離群的相對較小的相關(guān)性。本文中使用的HCV分型命名與由Simmonds等(2005) “Consensus Proposals for a Unified System of Nomenclature of HepatitisC Virus Genotypes” , Hepatology42, N0.4:962-973 修改并提出的廣泛采用的命名一致。Simmonds等(2005)的系統(tǒng)將已知的HCV隔離群放入六(6)種HCV基因型之一，即基因型I到6。每種基因型進(jìn)一步細(xì)分成稱作亞型的分組，其反映相同基因型的株間的相關(guān)性。HCV亞型以基因型后的小寫羅馬字母書寫，例如亞型la、亞型lc、亞型6a，等等。個別隔離群內(nèi)找到的遺傳變體稱作準(zhǔn)種。全世界已知涵蓋所有六種基因型的約100種HCV亞型。亞型的數(shù)目不是靜態(tài)的，即隨著對更多的HCV隔離群研究和測序，可能的是可以識識額外的亞型(及可能基因型)。[0057]由于HCV是RNA病毒，本領(lǐng)域技術(shù)人員在實(shí)際擴(kuò)增前通常將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA。在此類情況中，擴(kuò)增試劑包含逆轉(zhuǎn)錄酶或具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶。
[0058]適合于與RNA模板退火的引物也可能適合于PCR擴(kuò)增。對于PCR，與逆轉(zhuǎn)錄的cDNA鏈互補(bǔ)的第二引物為延伸產(chǎn)物的合成提供啟動位點(diǎn)。
[0059]在通過DNA聚合酶擴(kuò)增RNA分子中，第一延伸反應(yīng)是使用RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄，并且生成DNA鏈。使用DNA模板的第二延伸反應(yīng)生成雙鏈DNA分子。如此，通過DNA聚合酶自RNA模板合成互補(bǔ)的DNA鏈為擴(kuò)增提供起始材料。
[0060]可以在偶聯(lián)的單酶逆轉(zhuǎn)錄/擴(kuò)增反應(yīng)中使用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。在此上下文中，術(shù)語“一步實(shí)時PCR”可以指在靶核酸是DNA時沒有逆轉(zhuǎn)錄步驟的反應(yīng)或在靶核酸是RNA時包含逆轉(zhuǎn)錄步驟的反應(yīng)。“一步實(shí)時PCR”意指在逆轉(zhuǎn)錄(RT)步驟之后，在擴(kuò)增步驟前不需要打開反應(yīng)容器或以其它方式調(diào)節(jié)反應(yīng)組分。在非一步實(shí)時PCR反應(yīng)中，在逆轉(zhuǎn)錄后且在擴(kuò)增前，例如，調(diào)節(jié)、添加、或稀釋一種或多種反應(yīng)組分諸如擴(kuò)增試劑，對此，必須打開反應(yīng)容器，或者至少必須操作其內(nèi)容物。本發(fā)明的范圍包括一步實(shí)時PCR和非一步實(shí)時PCR實(shí)施方案兩者。
[0061]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，防止源自早期PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物諸如擴(kuò)增子和高分子量產(chǎn)物(聚合的擴(kuò)增子)的遺留物污染。通用的且有效的防止遺留物污染的方式牽涉使用尿嘧啶-DNA糖基化酶或尿嘧啶-N-糖基化酶，縮寫為“UDG”或“UNG” (EC3.2.2.3)。這些包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶識別存在于單鏈或雙鏈DNA中的尿嘧啶，并且切割尿嘧啶堿基和脫氧核糖之間的N-糖苷鍵，留下無堿基位點(diǎn)，參見例如US6.713.294。如本文中的例子顯示，在采用包含至少兩種選自下組的序列或由該序列組成的探針時實(shí)現(xiàn)在檢測HCV核酸中的特別良好的性能:SEQ ID NOl至8或其相應(yīng)的互補(bǔ)物。因此，本發(fā)明的一個方面是用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的HCV靶核酸的方法，所述方法包括下列步驟: [0062]a)使來自所述樣品的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑包含聚合酶、核苷酸單體、用于生成擴(kuò)增子的引物和至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針，其中所述至少兩種可檢測探針包含至少兩種選自下組的序列:SEQ ID NOl至8或其相應(yīng)的互補(bǔ)物；
[0063]b)在一定條件下將所述核酸與所述擴(kuò)增試劑一起溫育一段時間，所述條件和時間足以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)；
[0064]c)通過檢測所述可檢測探針與所述擴(kuò)增子的所述不同序列部分的雜交來檢測所述擴(kuò)增子的存在或缺乏，
[0065]其中所述擴(kuò)增子的存在指示所述樣品中HCV的存在。
[0066]在上文描述的方法的別的實(shí)施方案中，所述至少兩種可檢測探針包含SEQ ID N06和8，在又一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增試劑不含除SEQ ID N06和8外的別的HCV特異性探針。
[0067]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，上文提及的方法中的引物包含至少一種選自下組的序列:SEQ ID N09至15。所述引物特別可用于創(chuàng)建用上文提及的探針可檢出的擴(kuò)增子。在另一個實(shí)施方案中，上文提及的方法中的引物由SEQ ID N09、10、和11組成。
[0068]還有，本發(fā)明的一個方面是上文描述的方法，其中所述引物包含超過一種正向和/或反向引物。在這些引物生成通過上文提及的探針可檢出的變異的交疊擴(kuò)增子時，此類排列可以是特別有用的。在超過一種正向和/或反向引物的情況中，在一些實(shí)施方案中，相應(yīng)的正向和/或反向引物是交錯的，即它們就與其雜交的模板序列而言交疊。此類交錯的格局進(jìn)一步促成升高的對遺傳變體諸如HCV基因型和/或亞型的覆蓋。
[0069]上文提及的引物和探針在上文所列方法中的組合特別可用于檢測相當(dāng)多的HCV基因型。在一個實(shí)施方案中，上文描述的方法是用于同時檢測可能存在于樣品中的HCV基因型1、2、3、4、5、和6的方法。在別的實(shí)施方案中，上文描述的方法是用完全匹配的第一探針檢測基因型1、2、3、和5 (子集I)及用完全匹配的第二探針檢測基因型1、2、4、和6 (子集2)的方法。在別的實(shí)施方案中，所述方法是用于檢測亞型la、lb、2a、2b及在一些實(shí)施方案中別的亞型的方法。在又一個實(shí)施方案中，上文描述的方法是用于同時檢測可能存在于樣品中的HCV的基因型1、2、3、4、5、和6及亞型la、lb、2a、2b及在一些實(shí)施方案中別的亞型的方法。
[0070]本發(fā)明的別的方面是上文描述的方法，其進(jìn)一步包括在步驟a)前的下列步驟:
[0071]i)在一定條件下將固體支持物和所述樣品組合在一起一段時間，所述條件和時間足以容許包含所述靶核酸的核酸在所述固體支持物上固定化；
[0072]ii)在分離站中將所述固體支持物與樣品中存在的其它材料分離；
[0073]iii)通過將樣品與固體支持物分開，并用清洗緩沖液將固體支持物清洗一次或多次在分離站中純化核酸。
[0074]在本發(fā)明的背景中，如本文中使用的，術(shù)語“固體支持物”指能夠通過吸附直接且非特異性，或者間接且特異性與分析物結(jié)合的任何類型的固體支持物。間接結(jié)合可以是分析物與固體支持物上固定化的抗體的結(jié)合，或者標(biāo)簽與標(biāo)簽結(jié)合化合物的結(jié)合，例如6xHis標(biāo)簽與Ni螯合物的結(jié)合。在分析物是核酸時，此類間接結(jié)合可以通過結(jié)合與感興趣核酸的靶序列同源的捕捉核酸探針進(jìn)行。如此，使用固體支持物上附著的捕捉探針，可以將靶分析物或靶核酸與非靶材料或非靶核酸分開。在固體支持物上固定化此類捕捉探針。固體支持物材料可以是聚合物，或聚合物的組合物。其它類型的固體支持物材料包括磁性硅土顆粒、金屬顆粒、磁性玻璃顆粒、玻璃纖維、玻璃纖維濾器、濾紙，等等，而固體支持物材料不限于這些材料。
[0075]“固定化”在本發(fā)`明的上下文中意指以可逆或不可逆的方式捕捉對象諸如核酸。具體地，“在固體支持材料上固定化”意指出于將其與任何周圍介質(zhì)分開的目的，使一種或多種對象與固體支持材料結(jié)合，并且可以例如通過在后來的點(diǎn)時與固體支持材料分開來回收。在此上下文中，“固定化”可以例如包括將核酸吸附至玻璃或固體材料的其它合適的表面，如上文所描述的。此外，可以通過結(jié)合捕捉探針來特異性“固定化”核酸，其中核酸通過堿基配對而結(jié)合附著于固體支持物的、基本上互補(bǔ)的核酸。在后一種情況中，這類特異性固定化導(dǎo)致靶核酸的優(yōu)勢結(jié)合。
[0076]“分離站”是分析系統(tǒng)中允許固體支持物自樣品中存在的其它材料分離的一種裝置或組件。這類分離站可以例如包括但它不限于這些組件，離心機(jī)、過濾管架、磁體、或其它合適的組件。在一些實(shí)施方案中，分離站包含一個或多個磁體。在某些實(shí)施方案中，使用一個或多個磁體來分離作為固體支持物的磁性顆粒，諸如例如磁性玻璃顆粒。如果例如樣品和固體支持材料在多孔板的孔中組合在一起，那么分離站包含的一個或多個磁體可以例如通過將磁體引入孔中來與樣品自身接觸，或者可以使所述一個或多個磁體靠近孔的外壁以吸引磁性顆粒，隨后將它們與周圍液體分開。
[0077]在本發(fā)明的意義中，核酸的“純化”、“分離”或“提取”指如下的情況:可以在診斷測定法中例如通過擴(kuò)增分析核酸前，通常必須從含有不同組分的復(fù)雜混合物的生物學(xué)樣品中將它們純化、分離或提取。對于第一步，可以使用允許核酸富集的方法。[0078]“清洗緩沖液”是設(shè)計(jì)為除去不期望的組分(尤其在純化規(guī)程中)的流體。這類緩沖液是本領(lǐng)域中公知的。在核酸純化背景中，清洗緩沖液適于清洗固體支持材料以將固定化的核酸與任何不想要的組分分開。清洗緩沖液可以例如在如上文所描述的具有酸性PH且沒有乙醇和/或離液劑的一種或多種緩沖溶液中含有乙醇和/或離液劑。清洗溶液或其它溶液經(jīng)常以儲備溶液提供，所述儲備溶液在使用前必須稀釋。
[0079]總之，通過應(yīng)用上文描述方法的步驟i)至iii)，分開可能存在于樣品中的包含靶核酸的核酸與樣品的剩余部分，使得降低所述樣品中任何潛在的干擾性物質(zhì)抑制隨后步驟的風(fēng)險(xiǎn)。
[0080]對于下游分析，隨后，可以例如依靠合適的洗脫緩沖液自固體支持物洗脫核酸。此類洗脫緩沖液可以例如是蒸餾或去離子水或水性鹽溶液，諸如例如Tris緩沖液，如TrisHC1、或HEPES、或熟練技術(shù)人員已知的其它合適的緩沖液。
[0081]在一些實(shí)施方案中，固體支持物在擴(kuò)增和在一些實(shí)施方案中還有檢測期間存在于擴(kuò)增反應(yīng)混合物中。
[0082]在上文描述的方法的一些實(shí)施方案中，將對照核酸添加至樣品和/或純化的核酸。
[0083]所述對照核酸在一些實(shí)施方案中是定性對照核酸，而在其它實(shí)施方案中是定量對照核酸，或這兩者。
[0084]樣品中核酸的定性檢測對于例如識別個體感染是至關(guān)重要的。由此，用于檢測例如病毒性感染的測定法的一個重要的要求是避免假陰性或假陽性結(jié)果，因?yàn)檫@類結(jié)果幾乎會不可避免地導(dǎo)致就相應(yīng)患者的治療而言的嚴(yán)重后果。因此，特別是在基于PCR的方法中，向檢測混合物添加定性內(nèi)部對照核酸。所述對照對于確定測試結(jié)果的有效性是特別重要的:至少在就相應(yīng)的靶核酸而言陰性結(jié)果的情況中，定性內(nèi)部對照反應(yīng)在特定背景內(nèi)必須表現(xiàn)為反應(yīng)性的，即必須檢測出定性內(nèi)部`對照，否則認(rèn)為該測試自身是無效的。然而，在定性設(shè)置中，在陽性結(jié)果的情況中沒有必要必須檢出所述定性內(nèi)部對照。對于定性測試，特別重要的是，保證反應(yīng)的靈敏度，并且因此對其嚴(yán)格控制。因此，定性內(nèi)部對照的濃度必須相對較低，從而即使在例如略微抑制的情況中，沒有檢測出定性內(nèi)部對照，并且因此該測試是無效的。
[0085]如此，在上文描述的方法的一個實(shí)施方案中，即使在缺乏所述靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的情況中，所述對照核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的存在指示在反應(yīng)混合物中發(fā)生擴(kuò)增。
[0086]另一方面且在僅檢測樣品中核酸的存在或缺乏外，經(jīng)常重要的是測定所述核酸的數(shù)量。舉例而言，可以基于病毒載量評估病毒性疾病的階段和嚴(yán)重性。此外，監(jiān)測任何療法需要關(guān)于個體中存在的病原體數(shù)量的信息以評估療法的成功與否。
[0087]因此，本發(fā)明的一個方面是上文描述的方法，其進(jìn)一步包括如下步驟，即在步驟c)后和/或期間測定包含具有序列變異和/或個別突變的亞組的靶核酸的數(shù)量。
[0088]例如，使用HCV RNA病毒載量測試作為管理慢性丙肝患者中的輔助，其通過評估治療響應(yīng)并做出臨床決定(例如關(guān)于治療持續(xù)時間)進(jìn)行。針對慢性丙肝的療法的主要目的是通過實(shí)現(xiàn)持續(xù)的病毒學(xué)響應(yīng)根除HCV，例如在單獨(dú)或與別的藥物諸如利巴韋林(ribavirin)和/或博賽潑維(boceprevir)或特拉普韋(telaprevir)組合用藥物如PEG干擾素α-2治療的情況中。上文描述的方法提供了病毒載量測定法，其可靠檢測并量化HCV RNA,導(dǎo)致改善的治療上(on-treatment)監(jiān)測。
[0089]對于定量測定法，有必要引入定量標(biāo)準(zhǔn)核酸，其充當(dāng)用于測定靶核酸的絕對數(shù)量的參照物。如此，將定量內(nèi)部對照核酸添加至檢測混合物。所述對照對于量化測試結(jié)果，而且對于確認(rèn)測試結(jié)果的有效性是特別重要的:就相應(yīng)的靶核酸而言在陰性和陽性結(jié)果的情況中必須檢出定量內(nèi)部核酸。定量內(nèi)部對照反應(yīng)在給定背景中必須表現(xiàn)為反應(yīng)性的或者否則認(rèn)為測試自身是不起作用的?？梢酝ㄟ^參照外部校準(zhǔn)或者通過執(zhí)行內(nèi)部定量標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)現(xiàn)定量。
[0090]下文中描述了如何基于充當(dāng)定量標(biāo)準(zhǔn)品核酸的內(nèi)部對照核酸實(shí)施在cobas_? TaqMan?系統(tǒng)上生成的信號的定量結(jié)果計(jì)算的例子:從來自整個PCR運(yùn)行的、經(jīng)
儀器校正的熒光值的輸入數(shù)據(jù)計(jì)算滴度。含有靶核酸和充當(dāng)定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的內(nèi)部對照核酸的一組樣品在熱循環(huán)儀上使用規(guī)定溫度概況經(jīng)歷PCR。在PCR概況期間選定的溫度和時間，通過過濾光照明樣品，并且對每份樣品針對靶核酸和內(nèi)部對照核酸收集過濾熒光數(shù)據(jù)。在完成PCR運(yùn)行后，處理熒光讀數(shù)以產(chǎn)生內(nèi)部對照核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)和靶核酸的一組染料濃度數(shù)據(jù)。以相同方式處理每組染料濃度數(shù)據(jù)。在數(shù)次似真性檢查后，對內(nèi)部對照核酸和祀核酸計(jì)算肘值(elbow value) (CT)。肘值定義為祀核酸或內(nèi)部對照核酸的突光與預(yù)定閾值(熒光濃度)相交的點(diǎn)。滴度測定基于如下的假定，即靶核酸和內(nèi)部對照核酸以相同的效率擴(kuò)增，且在計(jì)算的肘值，擴(kuò)增并檢測相等量的靶核酸和內(nèi)部對照核酸擴(kuò)增子拷貝。因此，(ctQS - ct靶物)對對數(shù)(靶物濃度/QS濃度)呈線性。在此上下文中，QS表示充當(dāng)定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的內(nèi)部對照核酸。然后，可以例如通過使用如下述等式中的多項(xiàng)式校正式計(jì)算滴度T:
[0091]濃度靶物=濃度QS.10(a.(ctQS-ct_)2+b.(ctQS-ct_)+c)
[0092]已知多項(xiàng)式常數(shù)和定量標(biāo)準(zhǔn)核酸的濃度，因此該等式中唯一的變量是差(ctQS -Ct革巴物)O
[0093]如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，用于表征良好定量測定法的重要數(shù)值是例如測定法的線性或線性范圍(通過定量靶材料的稀釋系列及隨后所得曲線的線性回歸確定)、準(zhǔn)確度(名義和實(shí)驗(yàn)測定/分配數(shù)值之間的關(guān)聯(lián))、包容性(基因型/亞型/突變體/隔離群的等同且精確量化)和精確性(使用自線性研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)通過方差分量分析確定的1glO轉(zhuǎn)化濃度結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
[0094]對于定量和定性測試兩者，如分析靈敏度(上文在LOD的背景中描述)或特異性(避免由于非特異性檢測所致的假陽性結(jié)果)等特性也是重要的參數(shù)。在本文中的例子中顯示了上文描述的方法就包容性而言展現(xiàn)改善的特性，如上文討論的。
[0095]與如上文討論的方法的優(yōu)點(diǎn)一致，本發(fā)明的另一個方面是至少兩種可檢測核酸探針用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的靶核酸的用途，所述靶核酸包含具有序列變異和/或個別突變的亞組，其中所述可檢測核酸探針對同一擴(kuò)增子的不同序列部分是特異性的。
[0096]在上文描述的用途的一些實(shí)施方案中，所述可檢測探針不交疊。
[0097]在別的實(shí)施方案中，上文描述的用途是至少兩種可檢測核酸探針用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的HCV靶核酸的 用途，其中所述可檢測核酸探針對同一擴(kuò)增子的不同序列部分是特異性的，且其中所述可檢測探針包含至少兩種選自下組的序列:SEQ ID NOl至8或其相應(yīng)的互補(bǔ)物。[0098]在上文描述的用途的別的實(shí)施方案中，所述至少兩種可檢測探針包含SEQ ID N06和8，在又一個實(shí)施方案中，試劑盒不含除SEQ ID N06和8外的別的HCV特異性探針。
[0099]本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的靶核酸的試劑盒，所述靶核酸包含具有序列變異和/或個別突變的亞組，所述試劑盒包含擴(kuò)增試劑，其包含聚合酶、核苷酸單體、用于生成擴(kuò)增子的引物和至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針。
[0100]在上文描述的試劑盒的一些實(shí)施方案中，所述可檢測探針不交疊。
[0101]在一個實(shí)施方案中，上文提及的試劑盒是用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的HCV靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含擴(kuò)增試劑，其包含聚合酶、核苷酸單體、用于生成擴(kuò)增子的引物和至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針，其中所述可檢測探針包含至少兩種選自下組的序列:SEQ ID NOl至8或其相應(yīng)的互補(bǔ)物。
[0102]在上文描述的試劑盒的別的實(shí)施方案中，所述至少兩種可檢測探針包含SEQ IDN06和8，在又一個實(shí)施方案中，試劑盒不含除SEQ ID N06和8外的別的HCV特異性探針。
[0103]上文描述的試劑盒的可檢測探針可以與雙鏈擴(kuò)增子的相同或不同鏈雜交。
[0104]在上文描述的方法的一些實(shí)施方案中，至少兩種可檢測探針與所述擴(kuò)增子的不同鏈雜交。在別的實(shí)施方案中，至少兩種可檢測探針與所述擴(kuò)增子的相同鏈雜交。
[0105]在上文描述的試劑盒的另一個實(shí)施方案中，對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針以彼此不超過100個堿基的距離，在一些實(shí)施方案中，彼此1、5、10、20、30、40或50個堿基至60、70、80、90、或100個堿基的距離與擴(kuò)增子雜交。在一些實(shí)施方案中，距離是40至80、或50至70、或55至60個堿基，或者它是58個堿基。在此背景中，“距離”意指擴(kuò)增子中在可檢測探針與相同鏈雜交的情況中位于與它們雜交的那些擴(kuò)增子堿基間的堿基數(shù)目。若它們與不同鏈雜交，則相應(yīng)計(jì)算距離，其中雙鏈擴(kuò)增子的一條鏈的每個堿基在另一條鏈上具有與其形成堿基對的相應(yīng)堿基。
[0106]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，上文描述的試劑盒的引物包含超過一種正向和/或反向引物。
[0107]在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，上文提及的試劑盒中的引物包含至少一種選自下組的元件:SEQ ID N09至15。所述引物特別可用于創(chuàng)建用上文提及的探針可檢出的擴(kuò)增子。在另一個實(shí)施方案中，上文提及的試劑盒中的引物由SEQ ID N09、10、和11組成。
[0108]所述用途和所述試劑盒的優(yōu)點(diǎn)類似于上文在依照本發(fā)明的方法的背景中進(jìn)一步描述的。
[0109]附圖簡述
[0110]圖1:測試的探針的概述
[0111]圖2:使用HCV基因型Ia和天然存在的突變體隔離群(Lindauer)的HCV RNA轉(zhuǎn)錄物評估探針SEQ ID NOl至5
[0112] 圖3:使用HCV基因型Ia和4a血漿樣品評估非交疊探針SEQ ID N03、4、7和8
[0113]圖4:使用HCV基因型Ia(共有)和兩種天然存在的突變體隔離群(Jody，Lindauer)的轉(zhuǎn)錄物RNA評估非交疊探針SEQ ID N03、4、7和8
[0114]圖5:使用HCV基因型Ia和7種不同天然存在的突變體隔離群的HCV RNA轉(zhuǎn)錄物相對于沒有第二探針的主混合物(RL1.1)最終評估探針SEQ ID N08。[0115]圖6:使用一份患者HCV GTla和三份GT4a樣品相對于參照主混合物RLl.1對探針SEQ ID N08 (35%、50%和65%添加)的濃度優(yōu)化。
[0116]附圖詳述
[0117]圖1:為補(bǔ)充初始探針SEQ ID N06而測試的探針的示意性概述。具有SEQ ID N06、
9、10和11的引物和探針屬于參照主混合物RLl.1，并且存在于所有實(shí)驗(yàn)中。
[0118]圖2:用含有10%額外的或50%額外的第二探針(相對于RLl.1中標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ IDN06的濃度)的主混合物對兩種HCV RNA轉(zhuǎn)錄物(即HCV基因型Ia的對照轉(zhuǎn)錄物和在擴(kuò)增子的探針結(jié)合區(qū)中具有兩處天然存在的突變的轉(zhuǎn)錄物(Lindauer))評估滴度(cp/mL)。對于參照主混合物RLl.1，條形I和2及條形3和4代表相同的實(shí)驗(yàn)，只是主混合物中不含額外的探針。第二參照物是具有增加濃度的標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06 (10%和50%)，但沒有第二探針的RLl.1。SEQ ID N02、3、4、和5的添加提高對錯配轉(zhuǎn)錄物測定的濃度。注意SEQ IDNOl和I*、2和2*、3和3*及5和5*分別序列相同的，但是含有不同標(biāo)記物(還可見圖1)。
[0119]圖3a:用含有50%額外的第二探針(相對于RLl.1中標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06的濃度)的主混合物評估HCV GTla和HCV GT4a血漿樣品的靶物ct值。參照主混合物RLl.1僅含有一種探針SEQ ID N06。第二參照物是具有50%增加濃度的標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06，但沒有第二探針的RLl.1。低靶物ct指示早期樣品識別；ACt值3.3指示10倍滴度差異。探針SEQ ID N03、4、和7的添加略微降低在GTla和/或GT4a中的性能，因?yàn)閏t值增加。對SEQID N08觀察到最佳的性能。
[0120]圖3b:用 含有50%額外的第二探針(相對于RLl.1中標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06的濃度)的主混合物對HCV GTla和HCV GT4a血漿樣品評估最后一次PCR循環(huán)時的熒光信號。參照主混合物RLl.1僅含有一種探針SEQ ID N06。第二參照物是具有50%增加濃度的標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06，但沒有第二探針的RLl.1。高相對熒光指數(shù)(RFI)指示有效的擴(kuò)增和信號產(chǎn)生。SEQ ID N04和7的添加降低在GTla和GT4a中的性能，因?yàn)镽FI降低。對SEQ ID N08觀察到最佳的性能。
[0121]圖4a:用含有50%額外的第二探針(相對于RLl.1中標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06的濃度)的主混合物對三種HCV RNA轉(zhuǎn)錄物，即HCV基因型Ia的對照轉(zhuǎn)錄物和2種在擴(kuò)增子的探針結(jié)合區(qū)中具有天然存在的突變的轉(zhuǎn)錄物評估靶物ct值。參照主混合物RLl.1僅含有一種探針SEQ ID N06。第二參照物是具有50%增加濃度的標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06，但沒有第二探針的RLl.1。低靶物ct指示樣品的早期識別；Ct值的差異3.3指示10倍滴度差異。SEQ IDN03、4和7的添加顯示針對突變體轉(zhuǎn)錄物的性能略微升高，因?yàn)閏t值降低。對SEQ ID N08觀察到最佳的性能。
[0122]圖4b:用含有50%額外的第二探針(相對于RLl.1中標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06的濃度)的主混合物對三種HCV RNA轉(zhuǎn)錄物(即HCV基因型Ia的對照轉(zhuǎn)錄物和2種在擴(kuò)增子的探針結(jié)合區(qū)中具有天然存在的突變的轉(zhuǎn)錄物)評估最后一次PCR循環(huán)時的熒光信號。參照主混合物RLl.1僅含有一種探針SEQ ID N06。第二參照物是具有50%增加濃度的標(biāo)準(zhǔn)探針SEQID N06，但沒有第二探針的RLl.1。高相對熒光指數(shù)(RFI)指示有效的擴(kuò)增和信號產(chǎn)生。SEQID N03、4和7的添加沒有顯示關(guān)于突變體轉(zhuǎn)錄物中RFI的改善。對SEQ ID N08觀察到明顯的改善。
[0123]圖5:用含有50%額外的第二探針(相對于RLl.1中標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06的濃度)的主混合物對9種HCV RNA轉(zhuǎn)錄物(即HCV基因型Ia的對照轉(zhuǎn)錄物和在擴(kuò)增子的探針結(jié)合區(qū)中具有天然存在的突變的轉(zhuǎn)錄物)評估滴度(cp/mL)。參照主混合物RLl.1僅含有一種探針SEQ ID N06。與參照物RLl.1相比，SEQ ID N08的添加將所有錯配轉(zhuǎn)錄物的濃度(具有標(biāo)準(zhǔn)探針下的錯配)提高多至大于100倍。
[0124]圖6a:用含有35%、50%和65%額外探針SEQ ID N08 (相對于RLl.1中標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06的濃度)的主混合物對1份HCV GTla和3份HCV GT4a血漿樣品評估靶物ct值。參照主混合物RLl.1僅含有一種探針SEQ ID N06。低靶物ct指示早期樣品識別；Λ Ct值3.3指示10倍滴度差異。SEQ ID Ν08的所有三種濃度類似運(yùn)行。
[0125]圖6b:用含有35%、50%和65%額外探針SEQ ID N08 (相對于RLl.1中標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06的濃度)的主混合物對1份HCV GTla和3份HCV GT4a血漿樣品評估最后一次PCR循環(huán)時的熒光信號。參照主混合物RLl.1僅含有一種探針SEQ ID N06。高相對熒光指數(shù)(RFI)指示有效的擴(kuò)增和信號產(chǎn)生。對添加50%第二探針SEQ ID N08獲得最好的結(jié)果。
實(shí)施例
[0126]通用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0127]在等同的實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)施所有實(shí)驗(yàn)。包含標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06的基本主混合物組合物在所有實(shí)驗(yàn)中是相同的，并且稱作主混合物RLl.1。給RLl.1補(bǔ)充額外的50%初始探針SEQ ID N06或額外探針之一(SEQ ID N01_5、7、或8)，依照本發(fā)明，一次評估一種。以相同濃度(初始探針SEQ ID N06的10%或50%)個別添加并評估每種探針。不同第二探針與標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06部分交疊或者不交疊。一些探針與標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06在同一條鏈上定位，一些在相反鏈上定位。
[0128]在所有實(shí)驗(yàn)中，測試沒有第二探針的主混合物RLl.1作為參照物(對照I)及具有10%或50%增加濃度的初始探`針SEQ ID N06的主混合物(對照2)。使用相同樣品制備概況、熱循環(huán)概況和結(jié)果解讀參數(shù)來評估不同主混合物。作為樣品，在各10個重復(fù)中使用并測試天然的HCV GTla和GT4a樣品，或者在4至6倍重復(fù)中測試HCV5’非翻譯區(qū)的轉(zhuǎn)錄物。圖中呈現(xiàn)了重復(fù)間的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0129]在初始實(shí)驗(yàn)中，使用代表標(biāo)準(zhǔn)GTla的HCV轉(zhuǎn)錄物和代表探針區(qū)中錯配隔離群的轉(zhuǎn)錄物評估探針SEQ ID N01-5。SEQ ID N02、3、4、和5顯示最好的初始性能。與另外設(shè)計(jì)的探針SEQ ID N07和8 —起進(jìn)一步評估SEQ ID N03和4。SEQ ID N08在所有實(shí)驗(yàn)中顯示最好的性能。使用9種不同轉(zhuǎn)錄物的最終評估表明第二探針的添加對攜帶錯配的轉(zhuǎn)錄物將觀察到的滴度顯著提高多至大于100倍，所述9種不同轉(zhuǎn)錄物代表HCV基因型Ia的對照轉(zhuǎn)錄物和在擴(kuò)增子的探針結(jié)合區(qū)中具有天然存在的突變的轉(zhuǎn)錄物。
[0130]實(shí)施例1:
[0131]樣品材料:
[0132]測試HCV亞型Ia (其代表標(biāo)準(zhǔn)HCV樣品)和HCV亞型4a (其代表在標(biāo)準(zhǔn)探針結(jié)合區(qū)中具有可能的序列變異的HCV樣品)的HCV患者樣品以檢查將第二探針添加至主混合物的效果。使用代表HCV GTla共有序列的HCV RNA轉(zhuǎn)錄物和擴(kuò)增子區(qū)中天然存在的HCV隔離群的5’非翻譯區(qū)的轉(zhuǎn)錄物來評估不同的第二探針。
[0133]核酸提取:[0134]使用每個反應(yīng)Iml患者血漿樣品材料進(jìn)行核酸提取。若使用轉(zhuǎn)錄物，則將約500cp/ml (對于圖2、3a和3b中顯示的實(shí)驗(yàn))或約50000cp/ml (對于圖4a、4b和5中顯示的實(shí)驗(yàn))添加至含有硫氰酸胍的緩沖液以使RNA酶失活，然后以與正常樣品相同的方式加工Iml0在每個實(shí)驗(yàn)中測試患者樣品的5至10個重復(fù)和轉(zhuǎn)錄物樣品的4至6個重復(fù)。
[0135]核酸提取方法是現(xiàn)有技術(shù)，并且是熟練技術(shù)人員已知的(參見例如Sambrook等，第 2 版 1989，部分 1-3，Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor, New York;Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait編，1984))。或者，可以使用商品化核酸提取試劑盒，即高純病毒核酸試劑盒(RocheDiagnostics)或C.0bas? AmpliPrep 總核酸分離試劑盒(TNAI) (Roche Diagnostics)。
[0136]在本文描述的實(shí)驗(yàn)中，核酸提取基于cobas? AmpliPrep總核酸分離試劑盒(TNAI) (Roche Diagnostics)。標(biāo)本制備試劑由磁性玻璃顆粒懸浮液、裂解試劑、蛋白酶試劑、洗脫緩沖液和清洗試劑組成。在核酸提取前將定量標(biāo)準(zhǔn)品RNA添加至標(biāo)本。通過與蛋白酶和離液序列高的(chaotiOpic)裂解/結(jié)合緩沖液一起溫育裂解裝甲的HCV顆粒和定量標(biāo)準(zhǔn)品RNA裝甲顆粒，這釋放核酸，并且保護(hù)釋放的HCV RNA免于血清或血漿中的RNA酶。隨后，將HCV RNA和定量標(biāo)準(zhǔn)品RNA結(jié)合至磁性玻璃顆粒。通過清洗磁性顆粒除去未結(jié)合的物質(zhì)諸如鹽、蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞雜質(zhì)。于升高的溫度用水性緩沖液洗脫吸附的核酸。
[0137]PCR反應(yīng)混合物:
[0138]評估的主混合物由補(bǔ)充有不同探針的參照主混合物RLl.1組成。大批準(zhǔn)備參照主混合物RLl.1。對于每個實(shí)驗(yàn)，此主混合物補(bǔ)充有額外的10%或50%的標(biāo)準(zhǔn)探針SEQ ID N06或額外的10%或50% 的要評估的個別第二探針，如圖2-6中規(guī)定的。
[0139]主混合物組合物RLl.1:
[0140]
【權(quán)利要求】
1.一種用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的HCV靶核酸的方法，所述方法包括下列步驟: a)使來自所述樣品的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑包含聚合酶、核苷酸單體、用于生成擴(kuò)增子的引物和至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針，其中所述可檢測探針包含至少兩種選自下組的序列:SEQ ID NOl至8或其相應(yīng)的互補(bǔ)物； b)在一定條件下將所述核酸與所述擴(kuò)增試劑一起溫育一段時間，所述條件和時間足以發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)； c)通過檢測所述可檢測探針與所述擴(kuò)增子的所述不同序列部分的雜交來檢測所述擴(kuò)增子的存在或缺乏， 其中所述擴(kuò)增子的存在指不所述樣品中HCV的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測探針不交疊。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述引物包含超過一種正向和/或反向引物。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述引物包含至少一種選自下組的元件:SEQID N09 至 15。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述引物是SEQID N09、10和11。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在任何步驟將對照核酸添加至樣品和/或純化的核酸。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括在步驟c)之后和/或期間測定HCV靶核酸的數(shù)量的步驟。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針是5’ -核酸酶探針或HybProbe對。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針以彼此不超過100個堿基的距離與所述擴(kuò)增子雜交。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針攜帶相同標(biāo)記物或不同標(biāo)記物。
11.至少兩種可檢測核酸探針用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的HCV靶核酸的用途，其中所述可檢測核酸探針對同一擴(kuò)增子的不同序列部分是特異性的，且其中所述可檢測探針包含至少兩種選自下組的序列:SEQ ID NOl至8或其相應(yīng)的互補(bǔ)物。
12.一種用于擴(kuò)增和檢測可能存在于樣品中的HCV靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含擴(kuò)增試劑，該擴(kuò)增試劑包含聚合酶、核苷酸單體、用于生成擴(kuò)增子的引物和至少兩種對所述擴(kuò)增子的不同序列部分特異性的可檢測探針，其中所述可檢測探針包含至少兩種選自下組的序列:SEQ ID NOl至8或其相應(yīng)的互補(bǔ)物。
13.權(quán)利要求12的試劑盒，其中所述可檢測探針不交疊。
14.權(quán)利要求12至13中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述引物包含超過一種正向和/或反向引物。
15.權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的試劑盒，其中所述引物包含至少一種選自下組的元件:SEQ ID N09 至 15。
16.權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述引物是SEQID N09U0和11。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773894SQ201310475705
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月18日
【發(fā)明者】F.伯格曼, D.西茲曼, H.齊澤 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司