一種高效代謝油脂的大腸桿菌及其在生物基化學品生產中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效代謝油脂的大腸桿菌及其在生物基化學品生產中的應用，是在大腸桿菌中引入來自真氧產堿桿菌的油脂代謝途徑得到的重組菌，在大腸桿菌經過遺傳修飾引入了外源高活性的油脂代謝降解酶系，提高了大腸桿菌對油脂的利用率。應用本發(fā)明構建大腸桿菌發(fā)酵生產甲羥戊酸，具有轉化過程溫和，轉化率高的優(yōu)點，有效的降低了生產成本，該方法為生物合成甲羥戊酸和異戊二烯的工業(yè)化應用打下了堅實的基礎。
【專利說明】一種高效代謝油脂的大腸桿菌及其在生物基化學品生產中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效代謝油脂的大腸桿菌及其在生物基化學品生產中的應用。
【背景技術】
[0002]甲羥戊酸途徑在自然界中廣泛存在，甲羥戊酸和其下游衍生物如異戊二烯和類異戊二烯化合物可以通過在工程菌中表達外源的甲羥戊酸途徑的重組酶獲得，如Tabata等利用工程大腸發(fā)酵生產甲輕戍酸(Tabata et al., 2004BiotechnologyLetters, 26:1487-1491),美國的Genencor公司利用工程大腸桿菌發(fā)酵生產異戍二烯(Whited et al., 2010Industrial Biotechnology, 6:152)，Piteta 等利用工程大腸桿菌合成類異戍二烯化合物(Piteta et al., 2007Metabolic Engineering, 9:193-207);盡管上述研究利用不同的宿主和不同的酶進行甲羥戊酸和下游衍生物類異戊二烯化合物的發(fā)酵，但是均有一個共同點，就是以糖為原料進行發(fā)酵。理論上來講1.5分子的糖通過甲羥戊酸途徑只能生成I分子的甲羥戊酸，因此理論質量轉化率只有52%，并且至甲羥戊酸下游途徑產物如類異戊二烯化合物的發(fā)酵得率更低。由于采用糖為原料通過工程菌發(fā)酵生產類異戊二烯化合物的產率較低，限制了其商業(yè)化應用。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明提供了一種高效代謝油脂的大腸桿菌，是在大腸桿菌中引入來自真氧產堿桿菌的油脂代謝途徑得到的重組菌。
[0004]所述來自真氧產堿桿菌的油脂代謝途徑是真氧產堿桿菌Ralstonia eutrophaH16基因組(NCBI登陸號:NC_008313.1)內編號為H16_A0460至H16_A0464的五個基因(NCBI 中 NC_008313.1 基因組 Locus tag 編號:H16_A0460, H16_A0461, H16_A0462, H16_A0463, H16_A0464)o
[0005]優(yōu)選將上述真氧產堿桿菌Ralstonia eutropha H16基因組內編號為H16_A0460至H16_A0464的五個基因導入敲除了 FadR基因的大腸桿菌。
[0006]所述大腸桿菌為任意已知大腸桿菌，優(yōu)選標準菌株BL21 (DE3)或者JM109 (DE3)。
[0007]本發(fā)明還提供了一種高效 代謝油脂的大腸桿菌的構建方法，是在大腸桿菌中引入來自真氧產堿桿菌的油脂代謝途。
[0008]更進一步，所述大腸桿菌為敲除了 FadR基因的大腸桿菌，優(yōu)選敲除了 FadR基因的BL21 (DE3)或者 JM109 (DE3)。
[0009]具體而言，所述高效代謝油脂的大腸桿菌的構建方法如下:
[0010]I) FadR基因的敲除，根據已有的大腸桿菌標準菌株JM109 (DE3)基因組信息，找到FadR基因上下游各500個堿基的基因序列合并為I千個堿基的序列，并且在5’端和3’端分別加入15bp和質粒pRE112多克隆位點兩端相同的同源臂；根據序列信息化學合成線性DNA片段如SEQ ID N0.1所示；將通用自殺質粒pRE112和合成的線性DNA片段重組為新質粒pjzi，將pJZl通過熱激轉化法轉入大腸桿菌X7213，通過細菌轉導的方式將PJZl通過大腸桿菌X7213導入JM109 (DE3)進行FadR基因敲除；
[0011] 2)工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇，提取真養(yǎng)產堿桿菌Ralstoniaeutropha H16的基因組(NCBI登陸號:NC_008313.1)，根據已經公布的真養(yǎng)產堿桿菌Ralstonia eutropha H16基因組信息，設計引物從真養(yǎng)產喊桿菌Ralstonia eutropha H16的基因組擴增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段，合成時分別在序列的兩端分別加上15bp和質粒pBBRlMCS-2相同的同源臂序列；將重組基因簇片段和通用表達質粒pBBRlMCS-2的部分序列，重組為新表達載體pBBR_H16HZl，序列如SEQ ID N0.2所示；
[0012]3)將表達載體pBBR-H16HZl轉入步驟I)構建的重組大腸桿菌得到大腸桿菌ZMl。
[0013]上述大腸桿菌可高效代謝油脂。
[0014]本發(fā)明還提供了一種發(fā)酵生產甲羥戊酸的方法，具體步驟如下:
[0015]I)從大腸桿菌標準菌株BL21 (DE3)或者JM109 (DE3)出發(fā)，敲除其基因組上的FadR基因；
[0016]2)將真氧產喊桿菌Ralstonia eutropha H16基因組內編號為H16_A0460至H16_A0464的五個基因導入大腸桿菌進行表達；
[0017]3)將合成甲羥戊酸的酶基因導入步驟2)得到的大腸桿菌；
[0018]4)利用步驟3)得到的大腸桿菌以植物油或脂肪酸為碳源發(fā)酵生產甲羥戊。
[0019]更進一步，本發(fā)明構建的大腸桿菌能夠高效的轉化油脂類底物生成甲羥戊酸，更進一步的用于發(fā)酵生產異戊二烯，該轉化過程在溫和的條件下(30-37 0C )進行，且碳源至甲羥戊酸和下游衍生物異戊二烯的轉化率較高，有效的降低了生產成本，該方法為生物合成甲羥戊酸和異戊二烯的工業(yè)化應用打下了堅實的基礎。
【具體實施方式】
[0020]實施例1:針對大腸桿菌標準菌株JM109 (DE3)基因組的遺傳修飾，即FadR基因的敲除和表達來自真養(yǎng)產堿桿菌H16基因組內編號為H16_A1526至H16_A1531基因的基因簇。
[0021]FadR基因的敲除。大腸桿菌標準菌株JM109 (DE3)被用作基本菌株來進一步進行遺傳修飾。根據已有的大腸桿菌標準菌株JM109 (DE3)基因組信息，找到FadR基因上下游各500個堿基的基因序列合并為I千個堿基的序列，并且在5’端和3’端分別加入15bp和質粒PRE112多克隆位點兩端相同的同源臂；根據序列信息化學合成約I千堿基的線性DNA片段(SEQ ID N0.1)。利用In-Fusion HD試劑盒(Takara，貨號639648)將通用自殺質粒PRE112 (Addgene公司)和合成的線性DNA片段重組為新質粒pJZl，將pJZl通過傳統(tǒng)的熱激轉化法轉入大腸桿菌X7213(來自德國微生物菌種保藏中心)。而后通過細菌轉導的方式將PJZl通過大腸桿菌X7213導入JM109 (DE3)進行FadR基因敲除，該操作步驟和使用自殺質粒進行基因敲除的標準方法一致(Edwards et al.，1998Gene, 207:149)。
[0022]工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇。敲除FadR基因的JM109(DE3)被用作出發(fā)菌株來進一步進行遺傳修飾。提取真養(yǎng)產堿桿菌Ralstonia eutropha H16的基因組(NCBI登陸號:NC_008313.1 )，根據已經公布的真養(yǎng)產堿桿菌Ralstonia eutropha H16基因組信息，設計引物(上游引物CAGGAAACAGCTATGTCCAATTTCATCGTCAAGAAGG ;下游引物AAATATTAACGCTTACTCGAACTTCGTAAAATCCGGC)從真養(yǎng)產堿桿菌 Ralstonia eutropha H16 的基因組擴增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段(總長度5551bp)，合成時分別在序列的兩端分別加上15bp和質粒pBBRlMCS-2相同的同源臂序列。然后利用In-Fusion HD試劑盒(Takara，貨號639648)重組基因簇片段和通用表達質粒pBBRlMCS-2 (荷蘭菌種保藏中心，編號NCCB3434)的部分序列(不含IacZ基因的序列)，重組為新表達載體pBBR_H16HZl(SEQ ID N0.2)。
[0023]將表達載體pBBR-H16HZl通過傳統(tǒng)的熱激轉化法轉入敲除FadR基因的JM109(DE3)來構建能夠高效代謝油脂的工程大腸桿菌ZMl。
[0024]細胞生長實驗證明遺傳修飾的工程大腸桿菌ZMl具備比出發(fā)菌株JM109 (DE3)更強的油脂代謝能力:將ZMl和JM109 (DE3)分別挑取單克隆接入IOml搖管進行菌種細胞生長實驗，發(fā)酵溫度32°C，pH值控制在7.0，培養(yǎng)基組分見表1 (ZMl的培養(yǎng)基不加氯霉素，JM109 (DE3)的培養(yǎng)基不加氯霉素和卡那霉素)，以花生油為唯一碳源進行菌體生長，搖管放入微生物培養(yǎng)箱，220轉培養(yǎng)12小時后，ZMl的菌體密度0D_達到0.6，對照菌的菌體密度0D_只有0.1，證明以油脂為唯一碳源時，ZMl的生長顯著強于對照菌JM109 (DE3)，擁有更聞的油脂代謝能力。
[0025]實施例2:構建產甲羥戊酸的工程大腸桿菌和產異戊二烯的工程大腸桿菌。
[0026]根據已經公布的糞腸球菌(Enterococcus faecalis)輕甲基戍二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)合成酶基因和羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因的全長序列信息(Tabata etal., 2004Biotechnology Letters, 26:1487-1491),和我實驗室在前期研究中已公布的質粒構建方法(Yang et al., 2012PL0S ONE, 7: e33509)，構建表達質粒pACY-mva。將表達載體pACY-mva通過傳統(tǒng)的熱激轉化法轉入重組有H16_A1526至H16_A1531基因的大腸桿菌ZMl來構建利用油脂底物產甲 羥戊酸的工程大腸桿菌ZM2。
[0027]實施例3:利用構建的工程大腸桿菌以植物油或中長鏈脂肪酸(碳鏈長度CS至C18)為碳源發(fā)酵生產甲羥戊酸。
[0028]使用工程菌株ZM2以植物油(花生油或橄欖油)為碳源發(fā)酵生產甲羥戊酸。使用該菌株發(fā)酵甲羥戊酸的條件為:使用該菌株發(fā)酵甲羥戊酸的條件為:在500毫升搖瓶體系中使用100毫升裝液量，接種量5%，發(fā)酵溫度32°C，pH值控制在7.0，培養(yǎng)基組分見表1，初始植物油添加量為2克/升，攪拌速度為300至600rpm，溶氧控制在20%至40%，發(fā)酵60小時后，以不同植物油為碳源發(fā)酵甲羥戊酸的產量見表2。
[0029]使用工程菌株ZM2以脂肪酸(月桂酸，肉豆蘧酸，棕櫚酸)為碳源發(fā)酵生產甲羥戊酸。使用該菌株發(fā)酵甲羥戊酸的條件為:在500毫升搖瓶體系中使用100毫升裝液量，接種量5%，發(fā)酵溫度32°C，pH值控制在7.0，培養(yǎng)基組分見表1，初始脂肪酸添加量為2克/升，攪拌速度為300至600rpm，溶氧控制在20%至40%，發(fā)酵60小時后，以不同植物油為碳源發(fā)酵甲羥戊酸的產量見表2。
[0030]表1工程大腸桿菌ZM2發(fā)酵甲羥戊酸培養(yǎng)基組分表
[0031]
【權利要求】
1.一種高效代謝油脂的大腸桿菌，是在大腸桿菌中引入來自真氧產堿桿菌的油脂代謝途徑得到的重組菌。
2.如權利要求1所述的大腸桿菌，其特征在于，所述來自真氧產堿桿菌的油脂代謝途徑是真氧產喊桿菌Ralstonia eutropha H16基因組內編號為H16_A0460至H16_A0464的五個基因。
3.如權利要求2所述的大腸桿菌，其特征在于，將上述真氧產堿桿菌Ralstoniaeutropha H16基因組內編號為H16_A0460至H16_A0464的五個基因導入敲除了 FadR基因的大腸桿菌。
4.如權利要求3所述的大腸桿菌，其特征在于，所述大腸桿菌為BL21(DE3)或JM109(DE3)。
5.權利要求1所述大腸桿菌的構建方法，是在大腸桿菌中引入來自真氧產堿桿菌的油脂代謝途徑，所述大腸桿菌為敲除了 FadR基因的大腸桿菌。
6.如權利要求5所述方法，其特征在于，所述高效代謝油脂的大腸桿菌的構建方法如下: I )FadR基因的敲除，根據已有的大腸桿菌標準菌株JM109(DE3)基因組信息，找到FadR基因上下游各500個堿基的基因序列合并為I千個堿基的序列，并且在5’端和3’端分別加入15bp和質粒pRE112多克隆位點兩端相同的同源臂；根據序列信息化學合成線性DNA片段如SEQ ID N0.1所示；將通用自殺質粒pRE112和合成的線性DNA片段重組為新質粒pJZl，將pJZl通過熱激轉化法轉入大腸桿菌X7213，通過細菌轉導的方式將pJZl通過大腸桿菌X7213導入JM109 (DE3)進行FadR基因敲除；· 2)工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇，提取真養(yǎng)產堿桿菌Ralstoniaeutropha H16的基因組,根據已經公布的真養(yǎng)產堿桿菌Ralstonia eutropha H16基因組信息，設計引物從真養(yǎng)產堿桿菌Ralstonia eutropha H16的基因組擴增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段，合成時分別在序列的兩端分別加上15bp和質粒pBBRlMCS_2相同的同源臂序列；將重組基因簇片段和通用表達質粒PBBR1MCS-2的部分序列，重組為新表達載體pBBR-H16HZl，序列如SEQ ID N0.2所示； 3)將表達載體PBBR-H16HZ1轉入步驟I)構建的重組大腸桿菌得到大腸桿菌ZMl。
7.一種發(fā)酵生產生物基化學品的方法，其特征在于，將與合成生物基化學品的外源基因導入權利要求1所述的大腸桿菌，利用重組菌利用油脂發(fā)酵生產生物基化學品。
8.如權利要求7所述方法，其特征在于，所述生物基化學品為甲羥戊酸，具體步驟如下: O從大腸桿菌標準菌株BL21 (DE3)或者JM109 (DE3)出發(fā)，敲除其基因組上的FadR基因; 2)將真氧產喊桿菌Ralstoniaeutropha H16基因組內編號為H16_A0460至H16_A0464的五個基因導入大腸桿菌進行表達； 3)將合成甲羥戊酸的酶基因導入步驟2)得到的大腸桿菌； 4)步驟3)得到的大腸桿菌利用油脂發(fā)酵生產甲羥戊酸。
9.如權利要求8所述方法，其特征在于，具體步驟如下: I )FadR基因的敲除，根據已有的大腸桿菌標準菌株JM109(DE3)基因組信息，找到FadR基因上下游各500個堿基的基因序列合并為I千個堿基的序列，并且在5’端和3’端分別加入15bp和質粒pRE112多克隆位點兩端相同的同源臂；根據序列信息化學合成線性DNA片段如SEQ ID N0.1所示；將通用自殺質粒pRE112和合成的線性DNA片段重組為新質粒pJZl，將pJZl通過熱激轉化法轉入大腸桿菌X7213，通過細菌轉導的方式將pJZl通過大腸桿菌X7213導入JM109 (DE3)進行FadR基因敲除； 2)工程菌株中引入H16_A1526至H16_A1531基因簇，提取真養(yǎng)產堿桿菌Ralstoniaeutropha H16的基因組,根據已經公布的真養(yǎng)產堿桿菌Ralstonia eutropha H16基因組信息，設計引物從真養(yǎng)產堿桿菌Ralstonia eutropha H16的基因組擴增含有H16_A0460至H16_A0464基因的DNA片段，合成時分別在序列的兩端分別加上15bp和質粒pBBRlMCS_2相同的同源臂序列；將重組基因簇片段和通用表達質粒PBBR1MCS-2的部分序列，重組為新表達載體pBBR-H16HZl，序列如SEQ ID N0.2所示； 3)將表達載體PBBR-H16HZ1轉入步驟I)構建的重組大腸桿菌得到大腸桿菌ZMl，將表達載體pACY-mva導入ZMl得到大腸桿菌ZM2 ； 4)大腸桿菌ZM2利用油脂發(fā)酵生產甲羥戊酸。
10.如權利要求8或9所述方法，其特征在于，所述油脂為:花生油、橄欖油、月桂酸、肉豆蘧酸和棕櫚酸中任一一 種。
【文檔編號】C12R1/19GK103571787SQ201310475345
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月12日 優(yōu)先權日:2013年10月12日
【發(fā)明者】咸漠, 鄒慧斌, 劉輝, 孫超 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所