一種用于微量細胞培養(yǎng)的微流控芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于微量細胞培養(yǎng)的微流控芯片。本發(fā)明人優(yōu)化了細胞培養(yǎng)工藝，并提供一種用于微量細胞培養(yǎng)的微流控芯片。所述的微流控芯片制作簡單，采用微流控裝置，可應用于批量細胞高效培養(yǎng)，以及應用于微量細胞培養(yǎng)及藥敏實驗，神經(jīng)元和干細胞的培養(yǎng)。
【專利說明】一種用于微量細胞培養(yǎng)的微流控芯片

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)容器；更具體地，本發(fā)明涉及一種用于微量細胞培養(yǎng)的微流控芯片。

【背景技術(shù)】
[0002]微流控芯片在細胞研究方面具有獨特的優(yōu)勢。例如可以在芯片上對分離的少量細胞直接進行DNA和蛋白質(zhì)分析；芯片通道直徑一般介于10?50 μ m之間，與體內(nèi)微血管和細胞大小相近，且采用灌流培養(yǎng)方式，模擬細胞在體內(nèi)生長的復雜微環(huán)境，因此少至20?40個量細胞乃至單細胞也可培養(yǎng)，因此有望成為神經(jīng)元、干細胞培養(yǎng)，稀少循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)藥敏培養(yǎng)分析的一個理想平臺。
[0003]微加工和微流控技術(shù)為細胞研究提供了強有力的工具，包括單細胞觀察，微環(huán)境模擬以及高通量藥物篩選。哺乳動物細胞可在微流小室內(nèi)灌注培養(yǎng)，傳統(tǒng)研究技術(shù)難以解決的各種細胞的生物學問題，如三維細胞培養(yǎng)、細胞共培養(yǎng)和對細胞生長調(diào)控都可以通過微流控技術(shù)得以實現(xiàn)。
[0004]在所有這些研究中，從細胞加樣開始，就需要對細胞加載、細胞粘附和細胞存活率進行控制和觀察。即便如此，液體剪切力仍然影響了細胞的存活以及基因表達。細胞培養(yǎng)室高寬比，微米柱或微孔的設(shè)計能夠降低剪切力，在微流控芯片上長期培養(yǎng)細胞可以通過不同的芯片設(shè)計得以實現(xiàn)。然而，液體流動會使參與細胞通信的因子流失。
[0005]以往的細胞培養(yǎng)芯片，所需細胞加載數(shù)量較多，不能達到微量細胞培養(yǎng)的要求，限制其在微量細胞培養(yǎng)方面的應用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種微流控芯片及其在微量細胞培養(yǎng)中的用途。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供一種用于微量細胞培養(yǎng)的裝置，所述裝置包括:
[0008]細胞進樣入口(I)；
[0009]細胞進樣通道(2)，其與進樣入口(I)相連通，且從細胞進樣入口(I)起呈發(fā)散狀向外延伸；且細胞進樣通道(2)的端部(8)是封閉的；
[0010]細胞培養(yǎng)小室(3)，其排列于細胞進樣通道⑵的兩側(cè)，且與細胞進樣通道(2)連通；
[0011]側(cè)通道(4)，其與培養(yǎng)小室(3)連通，且其直徑小于細胞直徑；
[0012]排液通道(5)，其與側(cè)通道(4)連通，且排液通道(5)的端部(7)不與進樣入口(I)相連；和
[0013]排液出口 ￠)，其與排液通道(5)連通，且位于排液通道(5)的末端。
[0014]在一個優(yōu)選例中，所述的進樣入口(I)的截面積是100000-1000000 μ m2 ;較佳地為196250-441562.5 μ m2 ;較佳地，進樣入口 (I)是圓形，其直徑是0.5-0.75mm。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的進樣通道(2)的橫截面積是2000-10000 μ m2 ;較佳地為4000-8000 μ m2 ;更佳地為 5000-7000 μ m2)。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的細胞培養(yǎng)小室(3)容納1-10個；更佳地2-7個，如3、4、5、6個細胞；較佳地，所述的培養(yǎng)小室(3)的體積是0.002-0.0lmm3 ;較佳地為0.003-0.009mm3 ;更佳地為 0.006-0.008mm3 ;如 0.0035mm3、如 0.007mm3。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的側(cè)通道⑷的橫截面積為1-100 μ m2 ;更佳地9_100 μ m2 ；如 80 μ m2、60 μ m2、50 μ m2、36 μ m2、25 μ m2、16 μ m2。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的排液通道(5)的橫截面積大于側(cè)通道⑷；較佳地，所述的排液通道(5)的橫截面積與細胞進樣通道(2)相當。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述的細胞進樣通道(2)的數(shù)量為4-12條；較佳地為5-10條；如 6、7、8、9 條。
[0020]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的裝置的用途，用于微量細胞培養(yǎng)。
[0021]在一個優(yōu)選例中，所述的細胞包括:腫瘤細胞，干細胞和神經(jīng)元等。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的裝置采用聚二甲基硅氧烷制作；較佳地，通過注塑成形來制備。
[0023]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于微量細胞培養(yǎng)的試劑盒，所述試劑盒中包括:所述的裝置；以及細胞培養(yǎng)液。
[0024]在本發(fā)明的另一方面，提供一種微量細胞培養(yǎng)的方法，所述的方法包括:
[0025](I)提供所述的裝置；
[0026](2)將包含細胞的培養(yǎng)液從細胞進樣入口⑴加樣入所述裝置，細胞經(jīng)由細胞進樣通道(2)，進入到細胞培養(yǎng)小室(3)中；多余培養(yǎng)液經(jīng)側(cè)通道(4)進入排液通道(5)后從排液出口(6)流出；
[0027](3)將加樣完畢的裝置浸沒于細胞培養(yǎng)液中，進行細胞培養(yǎng)。
[0028]在另一優(yōu)選例中，應用注射泵低速加樣。較佳地，加樣速度為0.8mL/h-1.5mL/h。
[0029]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1、微量細胞培養(yǎng)芯片的整體結(jié)構(gòu)示意圖。
[0031]圖2、圖1的芯片的部分結(jié)構(gòu)的放大圖。
[0032]圖3、微量細胞培養(yǎng)芯片的裝配過程示意圖(呈現(xiàn)該裝置的部分結(jié)構(gòu))，為了呈現(xiàn)培養(yǎng)室結(jié)構(gòu)，A中的蓋片底面以透視結(jié)構(gòu)顯示。
[0033]圖中，I為細胞進樣入口 ；
[0034]2為細胞進樣通道；
[0035]3為細胞培養(yǎng)小室；
[0036]4為側(cè)通道；
[0037]5為排液通道；
[0038]6為排液出口 ；
[0039]7為排液通道5的端部。

【具體實施方式】
[0040]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，優(yōu)化了細胞培養(yǎng)工藝，并提供一種用于微量細胞培養(yǎng)的微流控芯片。所述的微流控芯片制作簡單，采用微流控裝置，可應用于批量細胞高效培養(yǎng)，以及應用于微量細胞培養(yǎng)及藥敏實驗。
[0041]本發(fā)明提供了一種細胞培養(yǎng)裝置，其是整體多邊形的蜘蛛網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包括細胞進樣入口、細胞進樣通道、細胞培養(yǎng)小室、側(cè)通道、排液通道、排液出口。
[0042]所述的細胞進樣入口位于整個裝置的中心位置，用于將細胞(通常包含在細胞培養(yǎng)液或緩沖液中)加樣到所述裝置中。較佳地，應用注射泵從細胞進樣入口進行低速加樣。
[0043]所述的細胞進樣通道與進樣入口相連通，且從細胞進樣入口起呈發(fā)散狀向外延伸，且細胞進樣通道的端部是封閉的。所述的細胞進樣通道的大小設(shè)置為可以容許從細胞進樣口加樣進來的細胞液通過，根據(jù)腫瘤細胞直徑以及培養(yǎng)小室與進樣通道相交開口處尺寸。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，其橫截面積是2000-10000 μ m2 ;較佳地為4000-8000 μ m2 ;更佳地為 5000-7000 μ m2。
[0044]可以根據(jù)細胞培養(yǎng)的需要來設(shè)置細胞進樣通道的數(shù)量。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細胞進樣通道的數(shù)量為4-12條；較佳地為5-10條，如6、7、8、9條。
[0045]所述的細胞培養(yǎng)小室排列在進樣通道兩側(cè)，所述的細胞培養(yǎng)小室的大小根據(jù)細胞培養(yǎng)的需要以及細胞的大小來設(shè)置，較佳地與排液通道呈放射狀相間排列。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細胞培養(yǎng)小室容納1-10個；更佳地2-7個，如3、4、5、6個細胞；較佳地，所述的培養(yǎng)小室的體積是0.002-0.0lmm3 ;較佳地為0.005-0.009mm3 ;更佳地為0.006-0.008mm3 ;如 0.17mm3、如 0.2mm3。
[0046]所述的側(cè)通道與培養(yǎng)小室連通，其是較為狹窄的通道，用于將多余的液體引流到排液通道，其截面設(shè)置為不容許細胞通過，從而將細胞截留在細胞培養(yǎng)小室中。因此，所述的側(cè)通道的大小可以視所欲培養(yǎng)的細胞的大小而定。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的側(cè)通道的橫截面積為 1-100 μ m2 ;更佳地 9-100 μ τα ;如 80 μ m2、60 μ m2、50 μ m2、36 μ m2、25 μ m2、16 μ m2。
[0047]所述的排液通道與側(cè)通道連通，且排液通道的端部不與進樣入口相連，從而可將多余的液體排出。由于通常排液通道與多條側(cè)通道連接，因此，其大小顯著大于側(cè)通道，以使得液體順利流出。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的排液通道的橫截面積與細胞進樣通道相當。
[0048]根據(jù)本發(fā)明人上述指導，所述的微流控裝置可以通過各種可行的方式進行制造，例如可以通過一次注塑成形、模壓成形等。作為一種可選擇的方式，根據(jù)本發(fā)明上述所提供的結(jié)構(gòu)以及參數(shù)，可以分別制備微流控裝置的蓋片和底面，再將兩者密封鍵合，制得本發(fā)明的微流控裝置。
[0049]用于制作本發(fā)明的微流控裝置的材料沒有特別的限制，任何常規(guī)應用于制備玻片、芯片、微流控芯片的材料都是可用的。所述的材料包括但不限于:石英、玻璃、二甲基硅氧燒(Polydimethylsiloxane ；PDMS)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚酰胺(PA)、丙烯腈、丁二烯、苯乙烯的合成物(ABS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚苯乙烯(PS)等。
[0050]此外，也可以采用兩種以上的材料來制作所述的微流控裝置，比如可以采用二甲基硅氧烷制作蓋片，以玻璃制作底片，將蓋片與底片密閉鍵合，獲得本發(fā)明的微流控裝置。
[0051]本發(fā)明的微流控裝置制作簡單，可完成批量細胞高效培養(yǎng)，以及微量(如I個)細胞培養(yǎng)及藥敏實驗。
[0052]應用本發(fā)明的微流控裝置，無需持續(xù)的培養(yǎng)基供給，避免培養(yǎng)基流動對細胞生長繁殖造成的損傷。
[0053]本發(fā)明的芯片的最主要特點是能夠最大程度的截留定量體積液體里的全部細胞，細胞數(shù)量可多可少。
[0054]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0055]實施例1、微量細胞培養(yǎng)裝置
[0056]如圖1-2所示，本發(fā)明所述微量細胞培養(yǎng)芯片，包含一個細胞進樣入口 1，以細胞進樣入口 I為中心放射狀分散排列的8條細胞進樣通道2和8條排液通道5，進樣通道2兩側(cè)各設(shè)培養(yǎng)小室若干(可依據(jù)培養(yǎng)細胞密度而定)，培養(yǎng)小室與排液通道5通過側(cè)通道4相連，排液通道5不與細胞進樣入口 I連接，每個排液通道末端有排液出口 6。細胞進樣通道2的端部8是封閉的。
[0057]其中，進樣入口 I的截面積是196250 μ m2 (直徑500 μ m的圓形入口)；進樣通道2的橫截面積是2500 μ m2 (長50 μ mX寬50 μ m的方形)；培養(yǎng)小室3的體積是0.0048mm3 ；側(cè)通道4的橫截面積是80μπι2(長8μπιΧ寬10 μ m的長方形)；排液通道5的橫截面積是2500 μ m2 (長 50 μ mX 寬 50 μ m 的方形)。
[0058]該裝置制造方法為:
[0059](I)首先使用高聚物聚二甲基娃氧燒(Polydimethylsiloxane ；PDMS)材料注塑，制作包括細胞進樣通道2、細胞培養(yǎng)小室3、側(cè)通道4及排液通道5的微量細胞培養(yǎng)芯片的蓋片;
[0060](2)分別在細胞進樣入口 1，與排液出口 6位置處打孔；
[0061](3)將制作完畢的蓋片與玻璃質(zhì)地的底片相鍵合。其裝配過程如圖3 (呈現(xiàn)該裝置的部分結(jié)構(gòu))，將帶有立體結(jié)構(gòu)的蓋片A扣在玻璃底片B上，形成鍵合后的C。
[0062]在使用時，將低密度細胞液通過注射泵經(jīng)進樣入口 I低速(速度是1.5mL/h)注入進樣通道2，細胞停留在細胞培養(yǎng)小室3，多余液體經(jīng)側(cè)通道4進入排液通道5，最后經(jīng)排液出口 6流出。
[0063]實施例2、細胞培養(yǎng)實例
[0064](I)用于密度為I X 15個/mL細胞培養(yǎng)液中細胞培養(yǎng)
[0065]應用實施例1制備的細胞培養(yǎng)裝置，設(shè)置進樣通道2兩側(cè)細胞培養(yǎng)小室3的個數(shù)，每側(cè)各12個，將0.2ml細胞培養(yǎng)液(含有密度為I X 15個/mL細胞)通過進樣入口 I低速注入。待細胞培養(yǎng)液完全注入后，浸沒于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0066](2)用于密度為IX 13個/mL細胞培養(yǎng)液中細胞培養(yǎng)
[0067]應用實施例1類似的細胞培養(yǎng)裝置，設(shè)置進樣通道2兩側(cè)細胞培養(yǎng)小室3的個數(shù)，每側(cè)各6個，將0.2ml細胞培養(yǎng)液(含有密度為I X 13個/mL細胞)通過進樣入口 I注入。待細胞培養(yǎng)液完全注入后，浸沒于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0068](3)用于循環(huán)腫瘤細胞培養(yǎng)
[0069]應用實施例1制備的細胞培養(yǎng)裝置，設(shè)置進樣通道2兩側(cè)細胞培養(yǎng)小室3的個數(shù)，每側(cè)各12個，芯片內(nèi)部包被多聚賴氨酸。抽取5ml癌癥病人外周血，分離得到單核細胞層懸浮液，將單核細胞層細胞層懸浮液注入培養(yǎng)芯片代細胞貼壁，注入細胞培養(yǎng)液，浸沒于培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0070]經(jīng)鑒定，本芯片可用于循環(huán)腫瘤細胞培養(yǎng)，細胞截留效率高，細胞培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，完成少量細胞群的培養(yǎng)，并可用于藥物篩選。該芯片用于截留定量體積液體里的幾乎全部細胞，細胞數(shù)量可多可少。
[0071]在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種用于微量細胞培養(yǎng)的裝置，其特征在于，所述裝置包括: 細胞進樣入口⑴； 細胞進樣通道(2)，其與進樣入口(I)相連通，且從細胞進樣入口(I)起呈發(fā)散狀向外延伸；且細胞進樣通道(2)的端部(8)是封閉的； 細胞培養(yǎng)小室(3)，其排列于細胞進樣通道(2)的兩側(cè)，且與細胞進樣通道(2)連通； 側(cè)通道(4)，其與培養(yǎng)小室(3)連通，且其直徑小于細胞直徑； 排液通道(5)，其與側(cè)通道(4)連通，且排液通道(5)的端部(7)不與進樣入口(I)相連；和 排液出口出)，其與排液通道(5)連通，且位于排液通道(5)的末端。
2.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述的進樣入口(I)的截面積是100000-1000000 μ m2。
3.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述的進樣通道(2)的橫截面積是2000-10000 μ m2。
4.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述的細胞培養(yǎng)小室(3)容納1-10個細胞；較佳地，所述的培養(yǎng)小室(3)的體積是0.002-0.01mm3。
5.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述的側(cè)通道(4)的橫截面積為1-100μ m2 ；更佳地9-100 μ m2，長寬高均控制在10 μ m以內(nèi)。
6.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述的排液通道(5)的橫截面積大于側(cè)通道(4);較佳地，所述的排液通道(5)的橫截面積與細胞進樣通道(2)相當。
7.如權(quán)利要求1所述的裝置，其特征在于，所述的細胞進樣通道(2)的數(shù)量為4-12條；較佳地為5-10條。
8.權(quán)利要求1-7任一所述的裝置的用途，其特征在于，用于微量細胞培養(yǎng)。
9.一種用于微量細胞培養(yǎng)的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括:權(quán)利要求1-7任一所述的裝置；以及細胞培養(yǎng)液。
10.一種微量細胞培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述的方法包括: (1)提供權(quán)利要求1-7任一所述的裝置； (2)將包含細胞的培養(yǎng)液從細胞進樣入口(I)加樣入所述裝置，細胞經(jīng)由細胞進樣通道(2)，進入到細胞培養(yǎng)小室(3)中；多余培養(yǎng)液經(jīng)側(cè)通道(4)進入排液通道(5)后從排液出口 (6)流出； (3)將加樣完畢的裝置浸沒于細胞培養(yǎng)液中，進行細胞培養(yǎng)。
【文檔編號】C12N5/0797GK104513798SQ201310447486
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】殷正豐, 張妤, 張孝峰 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學