啤酒酵母可溶性1,3-β-D-葡聚糖的生物提煉及純化方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種啤酒酵母可溶性1,3-β-D-葡聚糖的生物提煉及純化方法。目前對酵母細胞壁中可溶性1,3-β-D-葡聚糖的提取，工藝不具備連續(xù)性。本發(fā)明在同一反應體系中，利用超聲波、中性蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶將酵母細胞進行降解，利用截留分子量在10-50kD超濾膜，對其中分子量的10-50kD的可溶性1,3-β-D-葡聚糖進行抽提，得到分子量在10-50kD的可溶性1,3-β-D-葡聚糖。本發(fā)明具有工藝流程短、生產安全性高、產品的分子量范圍固定的優(yōu)點，所獲產品具有溶解性高、穩(wěn)定性好、安全性高的特點，適用于食品、醫(yī)藥、化妝品、農藥、新材料、電子、環(huán)保等領域。
【專利說明】啤酒酵母可溶性1, 3- β -D-葡聚糖的生物提煉及純化方法【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種葡聚糖,具體涉及一種啤酒酵母可溶性I, 3-β-D-葡聚糖的生物提煉及純化方法。
【背景技術】
[0002]葡聚糖是一種完全由a-D-吡喃型葡萄糖單體組成的多糖，在植物、真菌、細菌中有著廣泛的分布，是細胞壁結構的主要骨架。酵母的細胞壁中的β_葡聚糖是人類發(fā)現(xiàn)的第一個具有免疫活性的葡聚糖，在隨后的研究中，人們又發(fā)現(xiàn)他還具有抗感染、抗腫瘤、抗輻射和促進傷口愈合等功能，是一種重要的生物效應應答劑。
[0003]酵母細胞壁中1，3_β-D-葡聚糖占到了葡聚糖的結構是在D-葡萄糖基C6位上由β_1，3糖苷鍵和另一個葡萄糖基相連，在β_1，3糖苷鍵連接的主鏈上具有小的β_1，6糖苷鍵連接分支，其中β-1，6糖苷鍵分支占總I，3-β-D-葡聚糖的3%。在酵母細胞壁中，1，3-β -D-葡聚糖隨著分子量的不同，空間構型呈單鏈梳狀結構、雙股螺旋和三股螺旋結構，溶解性和生物活性也有所不同?，F(xiàn)有的研究表明，分子量在240KDa左右的l，3-13-D-葡聚糖，具有最高的生物活性。但是大分子量的1，3-β-D-葡聚糖在水溶液中有著將分子結構向三股螺旋結構轉化的趨勢，溶解性也會減小，在制藥行業(yè)當中會造成制劑的溶解性不穩(wěn)定，限制了其在臨床上的使用。分子量在10-50KDa的水溶性小分子1，3-β -D-葡聚糖，在保持了大分子結構的生物活性同時，還具有很好的溶解性，分子結構也比較穩(wěn)定。
[0004]我國是啤酒生產大國，每年因啤酒生產而產生的啤酒酵母泥達到了 3-5萬噸(以干基計)。這些酵母泥被作為粗飼料廉價出售，甚至直接排放，對資源造成極大的浪費，也污染了環(huán)境。對其中l(wèi)，3-13_D-葡聚`糖進行提取利用，就可以延長啤酒行業(yè)的產業(yè)鏈，增加啤酒產業(yè)的附加值。
[0005]目前對酵母細胞壁中可溶性1，3_β-D-葡聚糖的提取，一般采用酸、堿制備不溶性葡聚糖，然后利用酶法或化學修飾法進行增溶，工藝不具備連續(xù)性。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種工藝具有連續(xù)性的啤酒酵母可溶性1，3_β -D-葡聚糖的生物提煉及純化方法。
[0007]本發(fā)明所采用的技術方案是:
啤酒酵母可溶性l，3-13_D-葡聚糖的生物提煉及純化方法，其特征在于:
由以下步驟實現(xiàn):
步驟一:發(fā)酵罐底取新鮮酵母泥120-890g，以過量蒸餾水反復洗滌，每分鐘4000轉離心20分鐘，直到上清液無色清澈、苯酚-硫酸法測不到糖為止；
步驟二:補水到5 L，攪拌，固形物含量為2-15%，把超聲波細胞粉碎儀的超聲波發(fā)生器置于混合液中，超聲功率400-600W，工作時間5-10秒，間隔時間10秒，總超聲時間20-30分鐘，進行破壁；步驟三:繼續(xù)補水5 L進行稀釋，調pH值6.0-8.0，煮沸后冷卻到50±2°C，按酵母干重的0.5-1.5%添加甘露聚糖酶，按200-250U /g添加中性蛋白酶，反應24-28小時；
步驟四:調PH5.0，按酵母干重的0.5-1.5%添加β-葡聚糖酶，反應4小時后取30%，離心分離，收集上清液，不溶物質返回最初反應體系中，同時補水到開始反應時的體積，此過程不斷循環(huán)，5-16小時后終止反應，合并上清液；
步驟五:上清液煮沸，降溫到40°C，在0.2MPa條件下，使料液先通過PES-10，30分鐘，截留分子量10kD，收集透過液，使之再通過PES-50，30分鐘，截留分子量50kD，在此過程中不斷補充上清液，采取外源冷循環(huán)水降溫的方法使溫度恒定在40°C ；
步驟六:收集PES-50的濃縮液直到膜通量低于25 L/m-1，將濃縮液真空回旋干燥，得到干粉狀可溶性1，3-β -D-葡聚糖。
[0008]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
本發(fā)明采用超聲波和多種生物酶進行酵母細胞的破壁和解鏈，利用超濾技術進行10-50kD分子量的可溶性1，3-β -D-葡聚糖提取，在實現(xiàn)提取工藝的連續(xù)生產的同時，控制產品的分子量。此工藝不破壞原料中其他有效成分，對工藝過程中的其他有利用價值成分可以再次利用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為本發(fā)明提取具有生物活性的10_50kD的可溶性1，3- β -D-葡聚糖工藝流程框圖。
【具體實施方式】
[0010]下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0011]本發(fā)明所述的酵母細胞，不僅指啤酒廠生產完成后剩余的啤酒酵母泥，亦包括啤酒酵母干燥后獲得的有生物活性和沒有生物活性的啤酒酵母干粉。
[0012]本發(fā)明所述的酵母調成乳狀，是指酵母干重占總體積的2-15 (優(yōu)選為2-10%)。中性蛋白酶按照每克酵母干重210U添加，甘露聚糖酶和葡聚糖酶均選取諾維信公司產品，按照酵母干重的千分之一添加。
[0013]本發(fā)明中選取的截留分子量為IOkD的超濾膜和截留分子量為50kD的超濾膜，是指以β葡聚糖為標準物質標示的超濾膜，工藝中涉及到的膜面壓力和液體溫度，以生產廠家推薦最佳條件為準。
[0014]本發(fā)明中所采用的酶制劑和啤酒酵母原料，均為食品級，所以安全無毒。
[0015] 本發(fā)明的提取原理為:通過對啤酒酵母原料，進行超聲波粉碎，增大酶促反應的接觸面積，然后利用蛋白酶和甘露聚糖酶對酵母細胞壁中和酵母細胞內的蛋白質和甘露聚糖進行分解，使之成為可溶性小分子物質，在超濾提純階段予以排除。通過β葡聚糖酶的使用，把大分子不溶性葡聚糖分解為小分子的可溶性葡聚糖，通過選取截留分子量為IOkD的超濾膜和截留分子量為50kD的超濾膜連用，抽提出分子量在10-50kD的可溶性1，3_ β -D-匍聚糖。
[0016]本發(fā)明的最終產品以水溶性的粉劑形式存在。該產品(經過精制后)可以作為添加劑應用在食品、醫(yī)藥、化妝品、新材料等領域。[0017]以下實施例中的原料和試劑均為食品級，其來源及規(guī)格如下:
組分規(guī)格產地
啤酒酵母食品級西安漢斯啤酒廠
甘露聚糖酶食品級諾維信公司
β -葡聚糖酶食品級諾維信公司
中性蛋白酶5萬/g江蘇銳陽生物科技有限公司
膜分離系統(tǒng)LABSTAR-UF5 北京安石環(huán)境工程有限公司
超聲波發(fā)生器 KQ-100DE昆山市超聲儀器有限公司
啤酒酵母可溶性l，3-13-D-葡聚糖的生物提煉及純化方法，其特征在于:
由以下步驟實現(xiàn):
啤酒酵母可溶性l，3-13-D-葡聚糖的生物提煉及純化方法，其特征在于:
由以下步驟實現(xiàn):
步驟一:發(fā)酵罐底取新鮮酵母泥120-890g，以過量蒸餾水反復洗滌，每分鐘4000轉離心20分鐘，直到上清液無色清澈、苯酚-硫酸法測不到糖為止；
步驟二:補水到5 L，攪拌，固形物含量為2-15%，把超聲波細胞粉碎儀的超聲波發(fā)生器置于混合液中，超聲功率400-600W，工作時間5-10秒，間隔時間10秒，總超聲時間20-30分鐘，進行破壁；
步驟三:繼續(xù)補水5 L進行稀釋，調pH值6.0-8.0，煮沸后冷卻到50 ±2 °C，按酵母干重的0.5-1.5%添加甘露聚糖酶，按200-250U /g添加中性蛋白酶，反應24-28小時；
步驟四:調PH5.0，按酵母干重的0.5-1.5%添加β-葡聚糖酶，反應4小時后取30%，離心分離，收集上清液，不溶物質返回最初反應體系中，同時補水到開始反應時的體積，此過程不斷循環(huán)，5-16小時后終止反應，合并上清液；
步驟五:上清液煮沸，降溫到40°C，在0.2MPa條件下，使料液先通過PES-10，30分鐘，截留分子量10kD，收集透過液，使之再通過PES-50，30分鐘，截留分子量50kD，在此過程中不斷補充上清液，采取外源冷循環(huán)水降溫的方法使溫度恒定在40°C ；
步驟六:收集PES-50的濃縮液直到膜通量低于25 L/π-1，將濃縮液真空回旋干燥，得到干粉狀可溶性1，3-β -D-葡聚糖。
[0018]實施例1:
步驟一:發(fā)酵罐底取新鮮酵母泥120g，以過量蒸餾水反復洗滌，每分鐘4000轉離心20分鐘，直到上清液無色清澈、苯酚-硫酸法測不到糖為止；
步驟二:補水到5 L，固形物含量為2%，攪拌，把超聲波細胞粉碎儀的超聲波發(fā)生器置于混合液中，超聲功率400W，工作時間5秒，間隔時間10秒，總超聲時間20分鐘，進行破壁；步驟三:繼續(xù)補水5 L進行稀釋，調pH值6.0，煮沸后冷卻到48 °C，按酵母干重的0.5%添加甘露聚糖酶，按200U /g添加中性蛋白酶，反應24小時；
步驟四:調PH5.0,按酵母干重的0.5%添加β -葡聚糖酶，反應4小時后取30%，離心分離，收集上清液，不溶物質返回最初反應體系中，同時補水到開始反應時的體積，此過程不斷循環(huán)，5小時后終止反應,合并上清液；
步驟五:上清液煮沸，降溫到40°C，在0.2MPa條件下，使料液先通過PES-10，30分鐘，截留分子量10kD，收集透過液，使之再通過PES-50，30分鐘，截留分子量50kD，在此過程中不斷補充上清液，采取外源冷循環(huán)水降溫的方法使溫度恒定在40°C ；
步驟六:收集PES-50的濃縮液直到膜通量低于25 L/m2--h—1，將濃縮液真空回旋干燥，得到干粉狀可溶性1，3-β -D-葡聚糖，經檢測，干粉含水量為18%，其中可溶性1，3-β -D-葡聚糖含量為63.2%，產品對酵母干重收率為6.38%。
[0019]實施例2:
步驟一:發(fā)酵罐底取新鮮酵母泥535g，以過量蒸餾水反復洗滌，每分鐘4000轉離心20分鐘，直到上清液無色清澈、苯酚-硫酸法測不到糖為止；
步驟二:補水到5 L，固形物含量為9%，攪拌，把超聲波細胞粉碎儀的超聲波發(fā)生器置于混合液中，超聲功率500W，工作時間7秒，間隔時間10秒，總超聲時間25分鐘，進行破壁；步驟三:繼續(xù)補水5 L進行稀釋，調pH值7.0，煮沸后冷卻到50°C，按酵母干重的1%添加甘露聚糖酶，按210U /g添加中性蛋白酶，反應26小時；
步驟四:調PH5.0，按酵母干重的1%添加β-葡聚糖酶，反應4小時后取30%，離心分離，收集上清液，不溶物質返回最初反應體系中，同時補水到開始反應時的體積，此過程不斷循環(huán)，8小時后終止反應,合并上清液；
步驟五:上清液煮沸，降溫到40°C，在0.2MPa條件下，使料液先通過PES-10，30分鐘，截留分子量10kD，收集透過液，使之再通過PES-50，30分鐘，截留分子量50kD，在此過程中不斷補充上清液，采取外源冷循環(huán)水降溫的方法使溫度恒定在40°C ；
步驟六:收集PES-50的濃縮液直到膜通量低于25 L/nT2--!!—1，將濃縮液真空回旋干燥，得到干粉狀可溶性1，3- β -D-葡聚糖5.73g，經檢測，干粉含水量為15%，其中可溶性
I,3- β -D-葡聚糖含量為64.3%，產品對酵母干重收率為6.51%。
[0020]實施例3:
步驟一:發(fā)酵罐底取新鮮酵母泥890g，固形物含量為15.84%，以過量蒸餾水反復洗滌，每分鐘4000轉離心20分鐘，直到上清液無色清澈、苯酚-硫酸法測不到糖為止；
步驟二:補水到5 L，使固形物含量15%，攪拌，把超聲波細胞粉碎儀的超聲波發(fā)生器置于混合液中，超聲功率600W，工作時間10秒，間隔時間10秒，總超聲時間30分鐘，進行破壁；
步驟三:繼續(xù)補水5 L進行稀釋，調pH值8.0，煮沸后冷卻到52°C，按酵母干重的1.5%添加甘露聚糖酶，按250U /g添加中性蛋白酶，反應28小時；
步驟四:調PH5.0,按酵母干重的1.5%添加β -葡聚糖酶，反應4小時后取30%，離心分離，收集上清液，不溶物質返回最初反應體系中，同時補水到開始反應時的體積，此過程不斷循環(huán)，16小時后終止反應,合并上清液；
步驟五:上清液煮沸，降溫到40°C，在0.2MPa條件下，使料液先通過PES-10，30分鐘，截留分子量10kD，收集透過液，使之再通過PES-50，30分鐘，截留分子量50kD，在此過程中不斷補充上清液，采取外源冷循環(huán)水降溫的方法使溫度恒定在40°C ；
步驟六:收集PES-50的濃縮液直到膜通量低于25 L/m-2--h—1，將濃縮液真空回旋干燥，得到干粉狀可溶性1，3-β -D-葡聚糖，經檢測，干粉含水量為14%，其中可溶性1，3-β -D-葡聚糖含量為62.1%，產品對酵母干重收率為6.16%。
[0021]本發(fā)明在同一體系內，利用超聲波和生物酶進行啤酒酵母中不溶性物質進行可溶性降解，利用超濾膜連用提取出溶解性穩(wěn)定的可溶性1，3-β -D-葡聚糖，在整個工藝流程中不引入其他化學成分，實現(xiàn)關鍵點上的連續(xù)操作。產品經過高壓液相色譜檢測(檢測方法出自《藥學學報》1989，24 (7)，“高效凝膠色譜法測定多糖純度及分子量”)，分子量為10-50kD的可溶性1，3-β -D-葡聚糖純度在60%以上。該工藝與現(xiàn)有的制備可溶性1，3-β-?-葡聚糖工藝相比，具有工藝流程短、條件溫和、原料利用率高、產品分子量確定的優(yōu)點。本工藝為提取具有生物活性的10_50kD的可溶性1，3-β -D-葡聚糖提供了一個新的途徑。
[0022]本發(fā)明的內容不限于實施例所列舉，本領域普通技術人員通過閱讀本發(fā)明說明書而對本發(fā)明技術方案采取的任何等效的變換， 均為本發(fā)明的權利要求所涵蓋。
【權利要求】
1.啤酒酵母可溶性1，3-β -D-葡聚糖的生物提煉及純化方法，其特征在于: 由以下步驟實現(xiàn): 步驟一:發(fā)酵罐底取新鮮酵母泥120-890g，以過量蒸餾水反復洗滌，每分鐘4000轉離心20分鐘，直到上清液無色清澈、苯酚-硫酸法測不到糖為止； 步驟二:補水到5 L，攪拌，固形物含量為2-15%，把超聲波細胞粉碎儀的超聲波發(fā)生器置于混合液中，超聲功率400-600W，工作時間5-10秒，間隔時間10秒，總超聲時間20-30分鐘，進行破壁； 步驟三:繼續(xù)補水5 L進行稀釋，調pH值6.0-8.0，煮沸后冷卻到50 ±2 °C，按酵母干重的0.5-1.5%添加甘露聚糖酶，按200-250U /g添加中性蛋白酶，反應24-28小時； 步驟四:調PH5.0，按酵母干重的0.5-1.5%添加β-葡聚糖酶，反應4小時后取30%，離心分離，收集上清液，不溶物質返回最初反應體系中，同時補水到開始反應時的體積，此過程不斷循環(huán)，5-16小時后終止反應，合并上清液； 步驟五:上清液煮沸，降溫到40°C，在0.2MPa條件下，使料液先通過PES-10，30分鐘，截留分子量10kD，收集透過液，使之再通過PES-50，30分鐘，截留分子量50kD，在此過程中不斷補充上清液，采取外源冷循環(huán)水降溫的方法使溫度恒定在40°C ； 步驟六:收集PES-50的濃縮液直到膜通量低于25 L/m-2--!!-1，將濃縮液真空回旋干燥，得到干粉狀可溶性1，3-β -D-葡聚糖。
【文檔編號】C12P19/04GK103468765SQ201310425105
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月18日 優(yōu)先權日:2013年9月18日
【發(fā)明者】李皎, 楊國武, 汪大敏, 鄧媛 申請人:陜西省微生物研究所