一種海洋食品中g(shù)ii型諾如病毒nasba檢測引物、探針和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種海洋食品中GII型諾如病毒NASBA檢測引物、探針和檢測方法，正向引物序列為SEQ?ID?NO1，反向引物序列為SEQ?ID?NO2，GII型諾如病毒檢測用分子信標(biāo)探針引物序列為SEQ?ID?NO3，檢測方法，包括下列步驟：(一)GII諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)cRNA的構(gòu)建，(二)實時NASBA反應(yīng)，(三)定性定量分析。本發(fā)明設(shè)計的引物和探針對GII諾如病毒的檢測有高度的特異性，本發(fā)明的檢測方法操作步驟簡單，檢測時間短，可以進(jìn)行定性定量分析，特異性和靈敏度高。
【專利說明】—種海洋食品中Gl I型諾如病毒NASBA檢測引物、探針和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于實時核酸序列依賴性擴增(Nucleic acid sequence-basedamplification, NASBA)技術(shù)的快速檢測海洋食品中GII型諾如病毒技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]諾如病毒(NOTovirus，NVs)是一種存在于海洋食品中，又可導(dǎo)致成人和兒童急性胃腸炎的病毒。諾如病毒基因組是單股正鏈RNA，全長7642nt，包括3個開放閱讀框(openreading frames, ORFs) 0RFsl、0RFs2和0RFs3。ORFsl編碼保守的具有RNA多聚酶活性的非結(jié)構(gòu)蛋白；0RFs2編碼分子量約為56Kda的衣殼蛋白；0RFs3編碼一種分子量約為22.5Kda的強堿性微小結(jié)構(gòu)蛋白，部分區(qū)域與衣殼蛋白發(fā)生交互作用，共同形成衣殼。人們感染諾如病毒主要是通過接觸污染的是食物和水源等引發(fā)感染，尤其是海洋食品是諾如病毒的重要污染源。盡管諾如病毒引起的急性胃腸炎癥狀(嘔吐、腹瀉和腹部痙攣等)呈自限性，但若治療不及時仍會導(dǎo)致死亡，因此，一種簡便快速、特異性強的檢測海洋食品中諾如病毒方法，有利于提高我國海洋食品質(zhì)量安全水平，也有利于保障消費者的身體健康。
[0003]諾如病毒根據(jù)其RNA多聚酶區(qū)(RDRP)和衣殼蛋白編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列特征，可被分為5個遺傳組(GGI~V)，其中G1、GII和GIV型可以感染人類。依據(jù)病毒部分衣殼及RNA聚合酶(RDRP)區(qū)序列的不同，GI又可分為14個基因型，GII分為17個基因型，GIV有I個基因型。20世紀(jì)90年代中期，研究人員確定GII型可以在世界范圍內(nèi)流行，直到現(xiàn)在，GII型NVs—直是世界范圍內(nèi)NVs最主要的感染性基因型。我國感染的諾如病毒也以GII為主，GGI及GGIV型較為罕見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種基于NASBA檢測技術(shù)對GII型諾如病毒基因組具有特異性檢測作用的引物和分子信標(biāo)探針，同時提供一種快速、方便、實用的利用上述引物和分子信標(biāo)探針檢測GII型諾如病毒的NASBA檢測方法。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0006]一種GII型諾如病毒檢測引物，其特征在于:
[0007]正向引物序列為SEQ ID NOl:5’ -TGGAATTCCATCGCCCACT-3’ ；
[0008]反向引物序列為SEQ ID N02:
[0009]5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATTTCATCATCACCATA-3’。
[0010]一種GII型諾如病毒檢測用分子信標(biāo)探針，其特征在于，引物序列為SEQ ID N03:[0011 ] 5 ’ -FAM-CACGCCCTGTCCCCTGACATTATTCAGGCGCGTG-DABCYL-3，；
[0012]所述分子信標(biāo)探針在5’端標(biāo)記熒光報告基團FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團DABCYL。
[0013]一種定量檢測GII型諾如病毒的方法，包括下列步驟:[0014](一)GII諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)cRNA的構(gòu)建
[0015]利用所述的引物，通過常規(guī)RT-PCR對GII諾如病毒擴增并優(yōu)化，特異性產(chǎn)物片段大小為119bp ;然后分別進(jìn)行目的片段的克隆、質(zhì)粒提取、酶切線性化、體外轉(zhuǎn)錄與cRNA準(zhǔn)確性驗證、CopyRNA濃度的測定與拷貝數(shù)計算；將GII諾如病毒RAN進(jìn)行10倍梯度稀釋后，分裝作為標(biāo)準(zhǔn)品于_80°C保存；
[0016](二)實時 NASBA 反應(yīng)
[0017](I)對步驟(一)中保存的標(biāo)準(zhǔn)品共做9個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品cRNA，分別為IO8, IO7, IO6, IO5, IO4, IO3, IO2, IO1,10°拷貝；并提取待測樣品中RNA，其中RNA的濃度為50_100ng/μ L；
[0018]反應(yīng)體系如下:
【權(quán)利要求】
1.一種海洋食品中GII型諾如病毒檢測引物，其特征在于: 正向引物序列為 SEQ ID NOl:5’ -TGGAATTCCATCGCCCACT-3’ ； 反向引物序列為SEQ ID N02: . 5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAACAATTTCATCATCACCATA-3’。
2.一種海洋食品中GII型諾如病毒檢測用分子信標(biāo)探針，其特征在于，引物序列為SEQID N03:5’ -FAM-CACGCCCTGTCCCCTGACATTATTCAGGCGCGTG-DABCYL-3’ ； 所述分子信標(biāo)探針在5’端標(biāo)記熒光報告基團FAM，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團DABCYL。
3.一種定量檢測海洋食品中GII型諾如病毒的方法，包括下列步驟: (一)GII諾如病毒標(biāo)準(zhǔn)cRNA的構(gòu)建 利用權(quán)利要求1所述的引物，通過常規(guī)RT-PCR對GII諾如病毒擴增并優(yōu)化，特異性產(chǎn)物片段大小為U9bp ;然后分別進(jìn)行目的片段的克隆、質(zhì)粒提取、酶切線性化、體外轉(zhuǎn)錄與cRNA準(zhǔn)確性驗證、CopyRNA濃度的測定與拷貝數(shù)計算；將GII諾如病毒RAN進(jìn)行10倍梯度稀釋后，分裝作為標(biāo)準(zhǔn)品于_80°C保存； (二 )實時NASBA反應(yīng) (1)對步驟(一)中保存的標(biāo)準(zhǔn)品共做9個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品cRNA，分別為108，107，.106，10104,101101,10°拷貝；并提取待測樣品中RNA，其中RNA的濃度為50_100ng/μ L ； 反應(yīng)體系如下:
【文檔編號】C12Q1/70GK103525947SQ201310404375
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】周德慶, 趙峰, 馬麗萍, 蘇來金, 劉慧 , 姚琳, 孟松松 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所