一種檢測七種雞艾美耳球蟲的引物及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，公開了一種檢測七種雞艾美耳球蟲的引物及檢測試劑盒。所述引物是根據(jù)柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲7種艾美耳球蟲的IGS和ITS特異序列設(shè)計得到。將這7對引物用于制備得到的熒光定量PCR試劑盒可以準(zhǔn)確、客觀并定量檢測出以上7種雞艾美耳球蟲，而且，檢測試劑盒的特異性和靈敏性非常高。
【專利說明】一種檢測七種雞艾美耳球蟲的引物及檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測技 術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種檢測七種雞艾美耳球蟲的引物及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]雞球蟲病是由艾美耳屬球蟲引起的一種常見的寄生蟲病。該病危害極為嚴(yán)重，每年全球因球蟲病的感染造成大約30億美元的損失，是雞病中引起經(jīng)濟損失最為嚴(yán)重的疾病之一?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)并公認的雞艾美耳球蟲有7種，即柔嫩艾美耳球蟲、毒害艾美耳球蟲、巨型艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲、早熟艾美耳球蟲和布氏艾美耳球蟲，所有的球蟲均有一定的致病性。該病分布很廣，感染時常表現(xiàn)兩種或兩種以上的混合感染，發(fā)病率高達50%-70%，死亡率為20%-30%，嚴(yán)重者高達80%。病愈的雞生長發(fā)育受阻，增重緩慢，成年雞多為帶蟲者，對養(yǎng)雞業(yè)危害極大，據(jù)統(tǒng)計每年給中國養(yǎng)雞業(yè)造成數(shù)十億元損失。其中，致病力最強的是柔嫩艾美耳球蟲，分布也最為廣泛，其主要寄生于盲腸。其次是毒害艾美耳球蟲，主要寄生于小腸。在集約化雞場中，雞大多情況下混合感染多種球蟲，因此球蟲種類的診斷鑒別更為復(fù)雜和困難。
[0003]長期以來，球蟲的分類和鑒定主要依賴于卵囊和孢子囊的形態(tài)特征(即形狀和大小)、腸道中寄生部位、最短潛在期、最短孢子化時間、腸道病變、致病性和免疫原性等生物學(xué)特征。然而各個蟲種之間的特征性指標(biāo)不是十分明顯，而且球蟲又多是混合感染，有些鑒定指標(biāo)還依賴于實驗操作人員的主觀判斷，不同的操作人員很有可能得出不一樣的結(jié)論。因此盡管這些鑒定指標(biāo)迄今仍然用于雞球蟲的流行病學(xué)研究中，但臨床上急需更為準(zhǔn)確和操作方便的鑒定方法。
[0004]自1985年Mullis等創(chuàng)立聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)以來，它已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域最為常見的方法之一。并且以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，經(jīng)過不斷的探索和完善，研究者們已發(fā)展出多種相關(guān)技術(shù)應(yīng)用于寄生蟲遺傳變異和種類鑒定的分子生物學(xué)方法研究，包括特異PCR、DNA序列分析、多重PCR、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)連接的限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP )、隨機擴增多態(tài)性DNA (RAPD )、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCR)以及熒光定量PCR等，為分子寄生蟲學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展提供了有利的工具。
[0005]熒光定量PCR原理是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)，在反應(yīng)體系中加入熒光探針或熒光染料，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR的反應(yīng)過程。熒光染料可以結(jié)合在DNA雙鏈的小溝中，當(dāng)DNA擴增時，熒光染料可以與dsDNA結(jié)合，發(fā)出熒光信號，并且隨著dsDNA的逐漸增多，熒光信號逐漸增強，當(dāng)信號達到閾值時，熒光信號即可被熒光定量PCR儀器檢測到。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系。通過對不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品做熒光定量PCR，即可做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對未知樣品進行定性和定量檢測。常用的熒光染料有Pico Green和SYBR Green，熒光染料法相對于熒光探針優(yōu)勢在于檢測方法簡單，檢測成本低。實時熒光定量PCR技術(shù)不僅實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有靈敏度高，特異性強，自動化程度高等優(yōu)點，并且能有效解決PCR污染問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)球蟲種類的診斷鑒別技術(shù)不準(zhǔn)確和復(fù)雜的缺陷，提供一種檢測七種雞艾美耳球蟲的引物。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供一種定量檢測七種雞艾美耳球蟲的熒光定量PCR試劑盒。
[0008]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)上述目的:
一種檢測七種雞艾美耳球蟲的引物,核苷酸序列如下:
Tn引物對序列如SEQ ID NO:1-2所示；
Ne引物對序列如SEQ ID NO:3-4所示；
Mx引物對序列如SEQ ID NO:5-6所示；
Ac引物對序列如SEQ ID NO:7-8所示；
Mt引物對序列如SEQ ID NO:9-10所示；
Pr引物對序列如SEQ ID NO: 11-12所示；
Br引物對序列如SEQ ID NO: 13-14所示；
其中，Tn引物對用于檢測柔嫩艾美耳球蟲；Ne引物對用于檢測毒害艾美耳球蟲；Mx引物對用于檢測巨型艾美耳球蟲.Μ引物對用于檢測堆型艾美耳球蟲；Mt引物對用于檢測和緩艾美耳球蟲；Pr引物對用于檢測早熟艾美耳球蟲；Br引物對用于檢測布氏艾美耳球蟲。
[0009]以上引物對是發(fā)明人通過對來自于不同流行區(qū)的雞艾美耳球蟲分離株的核糖體DNA進行遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)核糖體IGS序列和ITS序列在同種不同株艾美耳球蟲間差異很小，而在不同種間的差異非常大。因此本 申請人:根據(jù)7種艾美耳球蟲的IGS和ITS特異序列設(shè)計了上述引物對。
[0010]一種定量檢測七種雞艾美耳球蟲的熒光定量PCR反應(yīng)體系，如上所述7對引物各自配制一個反應(yīng)體系，共配制7個反應(yīng)體系；每個反應(yīng)體系為SYBR GREEN I反應(yīng)混合液8μl，引物各1μl，雙蒸水10μl，待檢測樣品DNA模板5μl。
所述每個反應(yīng)體系的熒光定量PCR擴增條件為95°C預(yù)變性30s ;95°C變性5 s,60°C退火1min,80°C延伸I min,在此處采集突光,共40個循環(huán)。
[0011]一種定量檢測七種雞艾美耳球蟲的熒光定量PCR試劑盒，所述試劑盒含有如下成分:待檢測糞便樣品DNA提取液，SYBR GREEN I反應(yīng)混合液；終濃度為50 ρπιο?/μ?的如上所述的各引物對。
[0012]所述試劑盒還含有I mm的玻璃珠和Inhibit Ex Tablet。
[0013]所述待檢測糞便樣品DNA提取液含有ASL Buffer、proteinase K、Buffer AL、Buffer AffUBuffer Aff2,Buffer AE、96%-100%酒精、10%次氯酸鈉；以上每種溶劑單獨存放于一溶劑瓶中。其中，ASL Buffer、proteinase K、Buffer AL、Buffer AWl、Buffer Aff2和Buffer AE來源于天根的DNA提取試劑盒，當(dāng)然，本發(fā)明所述待檢測糞便樣品DNA的提取也可以采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的糞便DNA的提取方法。
[0014]所述SYBR GREEN I反應(yīng)混合液是從TaKaRa公司購買的試劑，其組成為:TaKaRaEx Taq HS、dNTP Mixture、Mg2+和 SYBR?Green I。
[0015]優(yōu)選地，所述試劑盒的容量規(guī)格一般為50個反應(yīng)的量，因此，所述試劑盒含有的待檢測糞便樣品DNA提取液組分為:50個反應(yīng)的140 mL的ASL BufferU.4 mL的proteinase K、33 mL 的 Buffer AL、19 mL 的 Buffer Affl>13 mL 的 Buffer AW2>12 mL 的Buffer AEUO mL的96%-100%酒精和100 mL的10%次氯酸鈉；
熒光定量PCR反應(yīng)液:為400個反應(yīng)的SYBR GREEN I反應(yīng)混合液、終濃度為50 pmol/uL的七種艾美耳球蟲特異性引物。
[0016]本發(fā)明同時提供所述試劑盒的使用方法，包括以下步驟:
S1.待測糞便DNA的提取:待測糞便DNA的提取方法可參照QIAamp DNA Stool MiniKit的使用說明；當(dāng)然也可以采用本領(lǐng)域其它常規(guī)的糞便DNA的提取方法。下面以QIAampDNA Stool Mini Kit試劑盒來介紹糞便DNA的提取。
[0017](I)稱取200 mg糞便放置在2 mL的離心管，糞便用1.5 mL的10%次氯酸鈉在冰上漂白10 min，漂白完后糞便用水洗兩次。
[0018](2)加入 1.4 mL ASL Buffer 和 0.4 g 玻璃珠(I mm)，震蕩 I -2 h。
[0019](3)將懸浮液放置 70°C，5 min。
[0020](4)鏇潤震蕩15 s,然后離心樣品20000 rpm, I min。
[0021](5)吸取1.2 mL懸浮液到2 mL離心管中。
[0022](6)加入I個InhibitEx Tablet到離心管中，立即游潤震蕩I min,直到InhibitExTablet完全懸浮,室溫下靜置I min。
[0023](7)離心樣品 20000 rpm, 3 min。
[0024](8)吸取所有上清液到新的1.5 mL離心管中，離心樣品20000 rpm, 3 min。
[0025](9)吸取 15 μ L proteinase K 到新的 1.5 mL 離心管中。
[0026](10)吸取步驟(8)中的200 KL上清液到盛有proteinase K的1.5 mL離心管中。
[0027](11)加入 200 μ? Buffer AL，漩渦震蕩 15 S。
[0028](12)瞬時離心，70°C水浴 10 min。
[0029](13)加入200 μ? 96-100%的酒精，漩渦震蕩混勻，瞬時離心。
[0030](14)小心地將步驟13中的液體加入到QiAamp Mini Spin Column中，蓋上蓋子，離心 20000 rpm, I min。將 QiAamp Spin Column 放入一個新的 2 mL 的 Collection Tube。(注:如果離心完后，看到QiAamp Spin Column中仍有液體,再離心一次。)
(15)小心打開 QiAamp Spin Column，加入 500 μ L Buffer AWl，蓋上蓋子，離心 20000rpm, I min。將 QiAamp Spin Column 放入新的 2 mL Collection Tube。
[0031](16)小心打開蓋子，加入500 μ? Buffer AW2。蓋上蓋子離心20000 rpm, 3 min。
[0032]建議:將QiAampSpin Column放入一個新的 2 mL 的 Collection Tube,離心 20000rpm,I min。
[0033](17)將QiAamp Spin Column放入一個新的1.5 mL離心管中，小心打開QiAampSpin Column蓋子,加入50 ? Buffer AE在QiAamp Spin Column膜上。蓋上蓋子,在室溫下靜置I min,然后離心20000 rpm, I min,離心管里即為DNA。
[0034]S2.熒光定量PCR擴增:如上所述7對引物各自配制一個反應(yīng)體系，共配制7個反應(yīng)體系；每個反應(yīng)體系為=SYBR GREEN I反應(yīng)混合液8 μ?，引物各I μ?，雙蒸水10 μ?，模板DNA 5 μ?。按照擴增樣品數(shù)η (η=η+1)取PCR反應(yīng)液，根據(jù)引物的不同混于7個離心管中，混勻，分裝。取各樣品DNA加入對應(yīng)反應(yīng)管中,各反應(yīng)管標(biāo)記后混勻離心,置于熒光定量PCR儀上反應(yīng)。
[0035]每個反應(yīng)體系的熒光定量PCR擴增條件為:95°C預(yù)變性30 s ;95°C變性5 s，60°C退火I min，80°C延伸I min共40個循環(huán)。
[0036]S3.熒光定量PCR結(jié)果分析:從終端電腦上讀取熒光定量PCR擴增結(jié)果。
[0037]本發(fā)明的有益效果:
1、本發(fā)明通過對來自于不同流行區(qū)的雞艾美耳球蟲分離株核糖體DNA的遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)核糖體IGS和ITS序列在同種不同株艾美耳球蟲間差異很小，而在不同種間的差異非常大。在此基礎(chǔ)上本 申請人:根據(jù)7種艾美耳球蟲的IGS和ITS特異序列設(shè)計七對特異引物，建立了用于定量檢測7種雞艾美耳球蟲熒光定量PCR檢測方法。
[0038]2、本發(fā)明通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，研制出一種基于熒光染料法的定量檢測7種雞艾美耳球蟲熒光定量PCR試劑盒，試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強，敏感性高，結(jié)果判定客觀。該方法可實 現(xiàn)對雞球蟲病的流行病學(xué)調(diào)查、隱性感染的檢測和臨床診斷，為雞球蟲的診斷和防治技術(shù)等進一步研究奠定了基礎(chǔ)。
[0039]說明書附圖
圖1.柔嫩艾美耳球蟲的熒光定量PCR特異性擴增圖。
[0040]圖2.毒害艾美耳球蟲的熒光定量PCR特異性擴增圖。
[0041]圖3.巨型艾美耳球蟲的熒光定量PCR特異性擴增圖。
[0042]圖4.堆型艾美耳球蟲的熒光定量PCR特異性擴增圖。
[0043]圖5.緩艾美耳球蟲的熒光定量PCR特異性擴增圖。
[0044]圖6.早熟艾美耳球蟲的熒光定量PCR特異性擴增圖。
[0045]圖7.布氏艾美耳球蟲的熒光定量PCR特異性擴增圖。
[0046]圖8.柔嫩艾美耳球蟲的熒光定量PCR擴增曲線(左)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(右)。
[0047]圖9.毒害艾美耳球蟲的熒光定量PCR擴增曲線(左)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(右)。
[0048]圖10.巨型艾美耳球蟲的熒光定量PCR擴增曲線(左)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(右)。
[0049]圖11.堆型艾美耳球蟲的熒光定量PCR擴增曲線(左)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(右)。
[0050]圖12.緩艾美耳球蟲的熒光定量PCR擴增曲線(左)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(右)。
[0051]圖13.早熟艾美耳球蟲的熒光定量PCR擴增曲線(左)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(右)。
[0052]圖14.布氏艾美耳球蟲的熒光定量PCR擴增曲線(左)及標(biāo)準(zhǔn)曲線(右)。
[0053]圖15.20株艾美耳球蟲中柔嫩艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0054]圖16.20株艾美耳球蟲中毒害艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0055]圖17.20株艾美耳球蟲中巨型艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0056]圖18.20株艾美耳球蟲中堆型艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0057]圖19.20株艾美耳球蟲中緩艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0058]圖20.20株艾美耳球蟲中早熟艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0059]圖21.20株艾美耳球蟲中布氏艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0060]圖22.19份臨床樣品中柔嫩艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0061]圖23.19份臨床樣品中毒害艾美耳球蟲檢測結(jié)果。[0062]圖24.19份臨床樣品中巨型艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0063]圖25.19份臨床樣品中堆型艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0064]圖26.19份臨床樣品中緩艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0065]圖27.19份臨床樣品中早熟艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
[0066]圖28.19份臨床樣品中布氏艾美耳球蟲檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0067]下面結(jié)合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，實施例中采用的試劑和方法為本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑和方法。
[0068]實施例1
7對特異引物的設(shè)計:本研究對來自于不同流行區(qū)的雞艾美耳球蟲分離株的核糖體DNA進行遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)核糖體IGS序列和ITS序列在同種不同株艾美耳球蟲間差異很小，而在不同種間的差異非常大。發(fā)明人根據(jù)7種艾美耳球蟲的IGS和ITS特異序列設(shè)計7種特異引物如下表1:
表I七種艾美耳球蟲熒光定量PCR特意性引物
【權(quán)利要求】
1.檢測七種雞艾美耳球蟲的引物，其特征在于，核苷酸序列如下: Tn引物對序列如SEQ ID NO:1-2所示； Ne引物對序列如SEQ ID NO:3-4所示； Mx引物對序列如SEQ ID NO:5－6所示； Ac引物對序列如SEQ ID NO:7－8所示； Mt引物對序列如SEQ ID NO:9-10所示； Pr引物對序列如SEQ ID NO: 11-12所示； Br引物對序列如SEQ ID NO: 13-14所示； 其中，Tn引物對用于檢測柔嫩艾美耳球蟲；Ne引物對用于檢測毒害艾美耳球蟲；Mx引物對用于檢測巨型艾美耳球蟲.Μ引物對用于檢測堆型艾美耳球蟲；Mt引物對用于檢測和緩艾美耳球蟲；Pr引物對用于檢測早熟艾美耳球蟲；Br引物對用于檢測布氏艾美耳球蟲。
2.一種定量檢測七種雞艾美耳球蟲的熒光定量PCR反應(yīng)體系，其特征在于，權(quán)利要求1所述7對引物各自配制一個反應(yīng)體系，共配制7個反應(yīng)體系；每個反應(yīng)體系為SYBR GREENI反應(yīng)混合液8μ?，引物各WL，雙蒸水ΙΟμ?，待檢測樣品DNA模板5μ?。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述熒光定量PCR反應(yīng)體系，其特征在于，所述每個反應(yīng)體系的熒光定量PCR擴增條件為95°C預(yù)變性30 s;95°C變性5 s，60°C退火I min，80°C延伸I min，在此處采集熒光，共40個循環(huán)。
4.一種定量檢測七種雞艾美耳球蟲的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有如下成分:待檢測糞便樣品DNA提取液；SYBR GREEN I反應(yīng)混合液；終濃度為50 pmol/μ?的權(quán)利要求1所述的各引物對。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還含有Imm的玻璃珠和Inhibit Ex Tablet。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述SYBRGREEN I反應(yīng)混合液含有TaKaRa Ex Taq HS、dNTP M　ixture、Mg2+和 SYBR? Green I。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述待檢測糞便樣品DNA提取液含有10% 次氯酸鈉溶液、ASL Buffer>Proteinase K、Buffer AL、96% -100% 酒精、Buffer Affl>Buffer AW2 和 Buffer AE。
【文檔編號】C12N15/11GK103451288SQ201310382748
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月28日
【發(fā)明者】翁亞彪, 劉國昌, 林瑞慶, 袁子國, 吳林林, 王新秋, 段雯方 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)