八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供了一種八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)，其特征在于，所述八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)為發(fā)夾型分子，包括由核苷酸序列組成的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、熒光團(tuán)F和淬滅團(tuán)Q、在帶有熒光團(tuán)F的一端有一個萘和/或其衍生物官能團(tuán)、在帶有淬滅團(tuán)Q的一端有一個紫晶和/或其衍生物官能團(tuán)、所述萘和/或其衍生物官能團(tuán)及紫晶和/或其衍生物官能團(tuán)通過靜電吸引共同進(jìn)入到八元瓜環(huán)的空腔內(nèi)。本發(fā)明的分子信標(biāo)可最大限度消除背景熒光，提高檢測靈敏度，特別地，即使發(fā)生核酸酶降解，其熒光團(tuán)F和淬滅團(tuán)Q仍將被八元瓜環(huán)“鎖定”，不會產(chǎn)生假陽性信號，為分子信標(biāo)性能優(yōu)化提供了一種創(chuàng)新思路，對分子生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要意義?！緦＠f明】八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)及其制備方法和應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種八元瓜環(huán)(CB[8])自組裝型分子信標(biāo)及其制備方法和應(yīng)用?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]1996年，Tyagi和Krammer設(shè)計了一種可以特異性識別核苷酸序列的新型突光探針-分子信標(biāo)(MolecularBeacon,MB),它是由寡核苷酸形成的發(fā)夾型分子,分子的一端標(biāo)記熒光染料，另一端標(biāo)記淬滅團(tuán)。該探針與核苷酸靶分子雜交后發(fā)生構(gòu)象變化而發(fā)出熒光，沒有識別靶序列的MB不發(fā)熒光，可以不必從檢測體系中分離出來，大大簡化了操作。莖環(huán)結(jié)構(gòu)使MB對靶序列的識別有很強(qiáng)的特異性，甚至可以區(qū)分單堿基錯配。由于其獨特的性質(zhì)和多功能性，MB在短時間內(nèi)即得到了迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于實時定量PCR監(jiān)測、核苷酸動態(tài)定量測定、活細(xì)胞成像以及DNA/蛋白質(zhì)相互作用研究等，臨床醫(yī)學(xué)上用于SARS病毒、乙肝病毒及癌癥診斷等，并且其應(yīng)用領(lǐng)域仍在不斷拓展。[0003]隨著MB應(yīng)用研究的深入開展，特別是后基因組時代的到來，對細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)、折疊、運輸和亞細(xì)胞定位的了解顯得愈發(fā)重要，尤其是在單個活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行mRNA追蹤，對于廣大生物學(xué)家和化學(xué)家來說更是一個富有挑戰(zhàn)性的課題。要想實現(xiàn)MB對活體mRNA的高靈敏檢測，必須面對以下二個方面的挑戰(zhàn):第一是核苷酸酶對MB骨架的降解和破壞，其不可避免地產(chǎn)生假陽性信號(MB包括一段核苷酸片斷，普通MB在細(xì)胞中穩(wěn)定存在的時間大概為45分鐘，隨后細(xì)胞內(nèi)核苷酸酶的酶切使熒光團(tuán)與淬滅團(tuán)分開，背景信號顯著增強(qiáng))；第二是靈敏度，盡管MB已經(jīng)具有其他核苷酸探針無可比擬的靈敏度，但在不進(jìn)行擴(kuò)增的情況下，要實時監(jiān)測單細(xì)胞內(nèi)低豐度目標(biāo)物，其靈敏度仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。[0004]為解決上述問題，研究者開展了大量的工作。首先，為避免核苷酸酶降解，提高M(jìn)B在細(xì)胞中的穩(wěn)定性，嘗試對MB的結(jié)構(gòu)進(jìn)行各種改造修飾。如采用2’-氧-甲基化堿基修飾MB、硫代修飾MB、肽核苷酸MB(PNA)等。但遺憾的是，2’-氧-甲基化堿基修飾的MB與蛋白質(zhì)可以進(jìn)行非特異性結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)背景信號很強(qiáng)；硫代化MB本身毒副作用比較大；肽核苷酸MB受限于其溶解度和團(tuán)聚現(xiàn)象，使其應(yīng)用受到了限制。[0005]提高靈敏度的研究則主要集中在增強(qiáng)熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度和提高淬滅團(tuán)的淬滅效率兩個方面。在熒光團(tuán)的改進(jìn)方面，Tan研究組將具有高量子產(chǎn)率的水溶性聚電解質(zhì)PPEs(Poly(phenyleneethynylene))通過聚合反應(yīng)聯(lián)結(jié)到DNA的末端作為分子信標(biāo)的熒光團(tuán)，雖然增強(qiáng)了分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合后的熒光信號強(qiáng)度，一定程度上提高了檢測靈敏度，但其合成相對復(fù)雜(HuangH.,etal.Designofamodular-basedfluorescentconjugatedpolymerforselectivesensing.AngewandteChemieInternationalEdition,2004，43:5635-5638)。Kim等設(shè)計了一種用疏基乙酸包覆的量子點作為熒光團(tuán)的分子信標(biāo)，但其靈敏度還有待提高(KimJ.H.,etal.Adaptationofinorganicquantumdotsforstablemolecularbeacons.SensorsandActuatorsB:Chemical，2004，102:315-319)。在提高淬滅團(tuán)的淬滅效率方面，Tan研究組將多個淬滅團(tuán)同時修飾在分子信標(biāo)上形成超淬滅分子信標(biāo)，與帶有單個淬滅團(tuán)的分子信標(biāo)相比，其靈敏度提高了將近14倍，但其合成難度及加工成本顯著增加(YangC.J.，etal.Molecularassemblyofsuperquenchersinsignalingmolecularinteractions.JournaloftheAmericanChemicalSociety，2005，127:12772-12773)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]目前對分子信標(biāo)性能的改進(jìn)都是圍繞其莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，以及對熒光團(tuán)、淬滅團(tuán)進(jìn)行修飾和調(diào)整，但現(xiàn)有方法都不能同時解決核苷酸酶切帶來的假陽性和提高靈敏度兩個難題。其根本原因是，現(xiàn)有分子信標(biāo)中熒光團(tuán)和淬滅團(tuán)與核苷酸的連接都是借助柔性的長鏈，兩者在空間上的相對自由勢必導(dǎo)致彼此不能最大限度靠近，而熒光團(tuán)與淬滅團(tuán)在空間上的充分靠近是其發(fā)生能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光淬滅的必要前提。[0007]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能同時解決這兩個難題的八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)，并提供該分子信標(biāo)的制備方法和應(yīng)用。[0008]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)，解決假陽性信號的有效辦法是保證核苷酸酶切后熒光信號團(tuán)和淬滅團(tuán)彼此不發(fā)生分離，而提高熒光靈敏度的有效途徑則是最大限度降低其背景熒光。[0009]依據(jù)文獻(xiàn)，電子云密度較高的2，6-二羥基萘(Np(OH)2)可以在帶有正電荷的甲基紫晶(MV2+)陪伴下，通過靜電吸引共同進(jìn)入到八元瓜環(huán)的空腔內(nèi)，三者自組裝得到穩(wěn)定性較高的1:1:1配位化合物-甲基紫晶/2，6-二羥基萘/八元瓜環(huán)(12+/恥(011)2/CB[8])。而染料與八元瓜環(huán)的自組裝建立在熱力學(xué)最穩(wěn)定的構(gòu)型基礎(chǔ)之上。本發(fā)明的發(fā)明人在該現(xiàn)象的基礎(chǔ)上通過深入研究，發(fā)現(xiàn)如果將萘及其衍生物引入到分子信標(biāo)的熒光團(tuán)末端，將紫晶及其衍生物引入到淬滅團(tuán)末端，利用八元瓜環(huán)獨特的自組裝特性將分子信標(biāo)的熒光團(tuán)和淬滅團(tuán)在底部“套箍”在一起，再加上分子信標(biāo)莖部堿基對的“束縛”，就可徹底消除兩者在空間上的相對自由度使彼此充分靠近，獲得最高效率的熒光淬滅及高的信背比(signal-backgroundratio),大大提高檢測靈敏度。此外，即使發(fā)夾的莖部被核苷酸酶降解切開，八元瓜環(huán)仍能將熒光團(tuán)和淬滅團(tuán)緊緊“鎖定”，彼此不能分離，因此不會產(chǎn)生核苷酸酶切造成的假陽性信號，顯著提高檢測靈敏度。[0010]本發(fā)明的八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)正是基于上述設(shè)計思想完成的發(fā)明，其特征在于，所述八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)為發(fā)夾型分子，包括由核苷酸序列組成的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、熒光團(tuán)F和淬滅團(tuán)Q、在帶有熒光團(tuán)F的一端有一個萘和/或其衍生物官能團(tuán)、在帶有淬滅團(tuán)Q的一端有一個紫晶和/或其衍生物官能團(tuán)、所述萘和/或其衍生物官能團(tuán)及紫晶和/或其衍生物官能團(tuán)通過靜電吸引共同進(jìn)入到八元瓜環(huán)的空腔內(nèi)，其結(jié)構(gòu)式如通式I所示:[0011]【權(quán)利要求】1.一種八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)，其特征在于，所述八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)為發(fā)夾型分子，包括由核苷酸序列組成的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、熒光團(tuán)F和淬滅團(tuán)Q、在帶有熒光團(tuán)F的一端有一個萘和/或其衍生物官能團(tuán)、在帶有淬滅團(tuán)Q的一端有一個紫晶和/或其衍生物官能團(tuán)、所述萘和/或其衍生物官能團(tuán)及紫晶和/或其衍生物官能團(tuán)通過靜電吸引共同進(jìn)入到八元瓜環(huán)的空腔內(nèi)，其結(jié)構(gòu)式如通式I所示:2.一種用于制備八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)的方法，其特征在于，包括如下步驟:(I)合成帶有紫晶或其衍生物官能團(tuán)及NHS酯活性基團(tuán)的淬滅團(tuán)3.權(quán)利要求1所述的八元瓜環(huán)自組裝型分子信標(biāo)在特異性識別核苷酸序列中的應(yīng)用。【文檔編號】C12N15/10GK103436620SQ201310379653【公開日】2013年12月11日申請日期:2013年8月27日優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日【發(fā)明者】孫世國,彭孝軍,李志勇,王繼濤申請人:大連理工大學(xué)