甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)s單倍型的分子檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于油菜分子育種領(lǐng)域，涉及甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)S單倍型的分子檢測(cè)方法、分子標(biāo)記與應(yīng)用。制備了鑒別甘藍(lán)型油菜自交不親和S單倍型的SCAR分子標(biāo)記體系，其包括4個(gè)SCAR分子標(biāo)記：SRK1-1、SCR1-1、SRK-1300和SCR7-2。將上述標(biāo)記組合得到的2對(duì)雙重PCR標(biāo)記：SRK1-1+SRK-1300和SCR7-2+SRK-1300。上述PCR標(biāo)記組合為共同組合使用或單獨(dú)使用，其DNA序列如SEQ?ID?NO：6、SEQ?ID?NO：7、SEQ?ID?NO：8所示和SEQ?ID?NO：9所示。本發(fā)明為油菜分子育種提供了實(shí)用標(biāo)記和利用方法。
【專利說(shuō)明】甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)S單倍型的分子檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于油菜育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)S單倍型的分子檢測(cè)方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]利用雜種優(yōu)勢(shì)提高產(chǎn)量是國(guó)內(nèi)外油菜生產(chǎn)的重要目標(biāo)和發(fā)展方向。油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑有細(xì)胞質(zhì)雄性不育、細(xì)胞核雄性不育、自交不親和、化學(xué)殺雄等方法。細(xì)胞質(zhì)雄性不育是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用途徑，盡管它存在保持系和恢復(fù)系的選育周期長(zhǎng)、有潛在的細(xì)胞質(zhì)負(fù)效應(yīng)等缺點(diǎn)。我國(guó)主要是波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育，其育成的雜交種占領(lǐng)我們油菜種植面積的60%左右；國(guó)外主要是蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育，除了德國(guó)NPZ種子公司及其股份占有公司利用MSL系統(tǒng)(具體內(nèi)容屬于該公司機(jī)密)、加拿大Bayer公司利用其具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞核雄性不育系統(tǒng)選育雜交種外，其他公司基本上都是利用蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育選育雜交種。
[0003]我們?cè)谘兄瞥鲆环N大量繁殖自交不親和系的方法(專利號(hào):ZL200810236719.X)的基礎(chǔ)上，將自交不親和三系(自交不親和系、保持系、恢復(fù)系)雜種選育方法(傅廷棟主編，1995)簡(jiǎn)化為“兩系”(是指自交不親和系、恢復(fù)系)雜種選育方法(專利號(hào):ZL200810236960.2)。與波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育和蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相比，自交不親和兩系雜交種選育方法具有育種程序簡(jiǎn)單、雜交種選育周期短、雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)、親本繁育程序簡(jiǎn)便、良種生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)。
[0004]自交不親和表型鑒別在兩系雜種選育中起很重要的作用。通常用田間親和指數(shù)法來(lái)進(jìn)行判別，即在田間通過(guò)套袋自交結(jié)籽情況計(jì)算親和指數(shù)(Self-compatibility Index,簡(jiǎn)寫為SCI，親和指數(shù)=籽粒`數(shù)/花朵數(shù))，不僅費(fèi)時(shí)因而效率低下、受時(shí)間限制(必須在油菜開花后進(jìn)行)，而且結(jié)果還易受環(huán)境影響。我們利用候選基因法，發(fā)展了與S-1300的自交不親和性連鎖的SCAR標(biāo)記(專利號(hào):ZL200710053354.2)、與丙409自交不親和保持性連鎖的SCAR標(biāo)記(專利號(hào):ZL200810047237.X)。研究發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜普遍存在S單倍型(Zhang等，Theor Appl Genet, 2008，117 (2): 171-179)，上述SCAR標(biāo)記在很多材料上檢測(cè)不到，因而應(yīng)用具有很大的局限。創(chuàng)建甘藍(lán)型油菜S單倍型的分子檢測(cè)技術(shù)，用來(lái)準(zhǔn)確鑒別自交不親和性，可解決選育自交不親和系和恢復(fù)系效率低下因而雜種配合力不高的問(wèn)題、并用于自交不親和雜種純度鑒定。這些相關(guān)內(nèi)容，迄今還沒(méi)有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，利用同源基因法克隆甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)(又稱S位點(diǎn))基因，根據(jù)基因序列差異設(shè)計(jì)引物，找到可區(qū)分人工創(chuàng)建的自交不親和甘藍(lán)型油菜和天然的自交親和甘藍(lán)型油菜的S單倍型的SCAR(Sequence characterizedamplified regions,序列特征擴(kuò)增區(qū)域)分子標(biāo)記,應(yīng)用得到的SCAR分子標(biāo)記對(duì)甘藍(lán)型油菜自交不親和表型進(jìn)行快速而又準(zhǔn)確的選擇，用于選育自交不親和系和鑒定自交不親和兩系雜種純度，以加快油菜自交不親和新品系的育成。
[0006]具體地，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007] 申請(qǐng)人:通過(guò)克隆甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)(又稱S位點(diǎn))基因，根據(jù)基因序列差異設(shè)計(jì)引物，篩選得到一套用于鑒別甘藍(lán)型油菜自交不親和S單倍型的SCAR分子標(biāo)記組合，其包括4個(gè)SCAR分子標(biāo)記:SRK1-1、SCRl-U SRK-1300和SCR7-2，上述4個(gè)SCAR分子標(biāo)記的核苷酸序列依次如序列表SEQ ID NO:6，7，8，9所示。對(duì)這4個(gè)SCAR分子標(biāo)記進(jìn)行組合得到的2對(duì)雙重PCR標(biāo)記，分別是:SRK1-1+SRK-1300組合和SCR7-2+SRK-1300組合，上述雙重PCR標(biāo)記組合為共同組合使用或單獨(dú)使用，其中將上述兩個(gè)標(biāo)記共同組合的使用效果會(huì)更好。
[0008]試驗(yàn)表明，我們利用上述分子標(biāo)記或其組合，創(chuàng)建了利用甘藍(lán)型油菜自交不親和S單倍型的SCAR分子標(biāo)記體系改良自交不親和系的方法以及用于鑒定甘藍(lán)型油菜自交不親和雜種純度的方法。
[0009]甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)S單倍型的分子檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用，其具體步驟如下:
[0010]A、甘藍(lán)型油菜自交不親和位點(diǎn)S單倍型分子檢測(cè)技術(shù)的創(chuàng)建:
[0011]I)以甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300為母本，以甘藍(lán)型油菜自交不親和恢復(fù)系‘8400’為父本進(jìn)行雜交，得到F1種子，種植F1種子得到F1植株，對(duì)F1植株套袋自交得到F2分離群體，取所得F1植株花粉與母本S-1300進(jìn)行回交，獲得BC1分離群體；以甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300為母本，以甘藍(lán)型油菜自交不親和保持系Bing409為父本進(jìn)行雜交，得到F1種子，種植F1種子得到F1植株，對(duì)該F1植株套袋自交得到F2分離群體，取所得F1植株花粉與Bing409進(jìn)行回交，獲得BC1分離群體
[0012]2)調(diào)查F2和BC1植株的自交不親和表型，采用親和指數(shù)法進(jìn)行分類；
[0013]3)利用已知的候選基因序列，分別克隆步驟I)的S-1300、‘8400’和Bing409的自交不親和性S位點(diǎn)基因，這些基因包括雌蕊決定基因SRK和雄蕊決定基因SPll ;根據(jù)基因有差異序列設(shè)計(jì)引物(該引物的DNA序列見(jiàn)表5:)，對(duì)S-1300、‘8400，和Bing409進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)；
[0014]4)回收、克隆、測(cè)序步驟3)篩選得到的甘藍(lán)型油菜自交不親和S位點(diǎn)SCAR標(biāo)記的DNA片段；
[0015]5)根據(jù)步驟3)所示的引物和步驟4)所示的DNA序列，獲得兩個(gè)多重PCR標(biāo)記(其序列分別如SEQID NO:6、7、8、9所示)使其能通過(guò)一次PCR反應(yīng)區(qū)分純合親和S1SpS7S7，雜合親和S1Sw-以及純合不親Ss_13(l(lSs_13(l(l三種基因型。選擇穩(wěn)定有差異擴(kuò)增的引物對(duì)F2和BC1分離群體進(jìn)行標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析，確定其是否與自交不親和性狀連鎖；
[0016]6)利用步驟4)得到的SCAR標(biāo)記引物和步驟5)獲得的多重PCR引物，擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜，確定甘藍(lán)型油菜自交不親和S位點(diǎn)基因型。
[0017]上述A步驟得到的分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)在甘藍(lán)型油菜自交不親和系遺傳改良種的應(yīng)用方法如下:
[0018]B、所述分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)在甘藍(lán)型油菜自交不親和系選育中的應(yīng)用
[0019]I)以甘藍(lán)型油菜自交不親和系自交不親和系S-1300為母本，與自交親和的甘藍(lán)型油菜品種/品系‘8400’為父本進(jìn)行雜交，得到雜種一代即Fl種子；利用上述A步驟5)中獲得的多重PCR引物，擴(kuò)增甘藍(lán)型油菜自交不親和系母本S-1300和自交親和的甘藍(lán)型油菜父本，篩選得到在雙親間有差異擴(kuò)增的多重PCR引物；
[0020]2)種植所得的F2，在苗期分單株取幼嫩葉片抽取DNA，利用B中步驟I)獲得的在雙親間有差異擴(kuò)增引物檢測(cè)各單株的基因型；撥除具有父本純合基因型(S1S1, S7S7)和父本雜合基因型(S1Ss-1300S7)的單株，保留母本純合基因型(Ss_13CI(lSs_13CI(l)的單株；對(duì)保留單株進(jìn)行人工剝蕾自交，得到F3種子，同時(shí)進(jìn)行套袋自交，利用親和指數(shù)法(Zhang等，2008)對(duì)甘藍(lán)型油菜親和指數(shù)的分類標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)親和性；種植所有單株親和指數(shù)均小于2的F3家系，根據(jù)苗期長(zhǎng)勢(shì)、生育期等確定目標(biāo)F3家系，并對(duì)其所有單株進(jìn)行套袋自交，所有單株親和指數(shù)均小于2的F4家系即為新的自交不親和系。
[0021]3)取自交親和的甘藍(lán)型油菜父本‘8400’和‘Bing409’花粉與B中第I)步驟所得F1雜交得到回交一代(BC1)種子；種植該BC1，在苗期分單株提取幼嫩葉片的總DNA，利用B步驟中2)獲得的在雙親間有差異擴(kuò)增引物檢測(cè)各單株的基因型；撥除具有父本純合基因型(S1SpS7S7)的單株，保留父本雜合基因型(S1SsLSs_13TOS7)的單株；根據(jù)苗期長(zhǎng)勢(shì)、生育期等選擇部分保留單株，與父本‘8400’和‘Bing409’雜交得到BC2種子；種植BC2種子，采用與上述相同的方法選擇父本雜合基因型(S1Sy、Ss_13(KIS7)的單株，與父本‘8400’和‘Bing409’雜交得到BC3種子，繼續(xù)上述步驟，得到BC4種子。種植BC4,分析各單株基因型，對(duì)父本雜合基因型的單株進(jìn)行自交或剝蕾自交，得到BC4F2種子。種植BC4F2,分析各單株基因型，對(duì)母本純合基因型(Ss_13CI(lSs_13CI(l)的單株進(jìn)行自交、利用親和指數(shù)法(參考文獻(xiàn)同上)確認(rèn)其為不親和性，同時(shí)，剝蕾自交得到BC4F3,即新的自交不親和系。
[0022]4)在油菜開花前在F1植株主花序或生長(zhǎng)狀態(tài)較好的側(cè)枝花序上選取大小在
2.5-4mm之間的花蕾，進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。提取經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的再生苗葉片總DNA (方法見(jiàn)參見(jiàn)《【具體實(shí)施方式】》)，利用B中步驟2)的方法獲得的在雙親間有差異擴(kuò)增引物檢測(cè)每一獲得的再生苗的基因型；選擇母本純合基因(Ss_13CI(lSs_13CI(l)單株進(jìn)行繼代培養(yǎng)，移栽田間；對(duì)加倍成功的即雙單倍體植株，進(jìn)行人工剝蕾自交，同時(shí)進(jìn)行套袋自交，利用親和指數(shù)法(參考文獻(xiàn)同上)檢測(cè)親和性，所有親和指數(shù)小于2的雙單倍體植株即為新的甘藍(lán)型油菜自交不親和系。
[0023]C、分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)在甘藍(lán)型油菜自交不親和雜種純度鑒定的應(yīng)用
[0024]I)以甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300為母本、與親和甘藍(lán)型油菜為父本‘8400’和‘Bing409’雜交，得到Fl種子；種植甘藍(lán)型油菜自交不親和系S-1300、父本‘8400’和‘Bing409’和Fl雜種，于苗期分單株提取葉片總DNA ;利用A中步驟5)獲得的多重PCR引物，擴(kuò)增S-1300和父本‘8400’和‘Bing409’，選擇在父母本間有差異擴(kuò)增帶的引物分析Fl雜種各單株的基因型，與雙親的擴(kuò)增帶型進(jìn)行比較，計(jì)算父母本雜合基因型的比例，即為雜種純度。
[0025]在上述發(fā)明中，A步驟中的3)所述的與甘藍(lán)型油菜A基因組自交不親和S位點(diǎn)完全連鎖的顯性標(biāo)記引物的DNA序列如下:
[0026]SRKl-1
[0027]
【權(quán)利要求】
1.人工創(chuàng)造的用于鑒別甘藍(lán)型油菜自交不親和S單倍型的SCAR分子標(biāo)記，其特征在于所述的分子標(biāo)記為:SRK1-1、SCRl-1、SRK-1300和SCR7-2，將上述4個(gè)SCAR分子標(biāo)記進(jìn)行組合得到如下所述的2對(duì)雙重PCR標(biāo)記組合:SRK1-1+SRK-1300組合及SCR7-2+SRK-1300組合，上述雙重PCR標(biāo)記組合為共同組合使用或單獨(dú)使用； 上述分子標(biāo)記對(duì)應(yīng)的核苷酸序列如下所述: SRKl-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示； SCRl-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示； SRK-1300的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示； SCR7-2的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
2.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在甘藍(lán)型油菜自交不親和系遺傳改良中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中包括在甘藍(lán)型油菜自交不親和系選育中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用 ，其中包括在甘藍(lán)型油菜自交不親和雜種純度鑒定中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103451283SQ201310366045
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年8月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月20日
【發(fā)明者】馬朝芝, 高長(zhǎng)斌, 翟文, 周貴龍, 張彤 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)