煙曲霉實時pcr技術的制作方法
【專利摘要】近20多年來，由于艾滋病患者的增多，新的治療技術和骨髓移植、器官移植和強化化療等廣泛應用與臨床，侵襲性真菌病的發(fā)病率明顯升高，嚴重危害人類健康，甚至危及生命，大大增加了臨床治療的難度，已引起廣泛高度重視，本實驗室建立了一種針對煙曲霉進行特異性檢測的熒光定量PCR法(探針法),該PCR檢測體系的檢測敏感性方面，線性檢測范圍的下限可至102copies/ml，上限可達108copies/ml,敏感性、特異性和穩(wěn)定性均較好。
【專利說明】煙曲霉實時PCR技術
【技術領域】
[0001]近20多年來，由于艾滋病患者的增多，新的治療技術和骨髓移植、器官移植和強化化療等廣泛應用與臨床，侵入性檢測設備，胃腸外營養(yǎng)，廣譜抗生素的長期應用以及危重患者輔助機械通氣替代治療、老齡人口的增多等原因，侵襲性真菌病的發(fā)病率明顯升高，特別是一些免疫功能低下患者如惡性腫瘤病人繼發(fā)感染以及器官移植失敗等醫(yī)院內(nèi)感染問題常常由真菌感染所致，嚴重危害人類健康，甚至危及生命，大大增加了臨床治療的難度，已引起廣泛高度重視，Chandrasekar等人報道了造血干細胞移植的患者移植后出現(xiàn)侵襲性真菌病的患病率大于30%，而移植后因感染IFD而死亡的比率高達70%-90%，IFD的早發(fā)現(xiàn)早治療對于改善患者預后具有重要意義，而當前實驗室內(nèi)的常規(guī)檢測方法由于其敏感性和耗時性等缺陷，難以滿足臨床的需求，亟需尋求一種更加靈敏和特異的檢測方法，為目前臨床真菌感染的早期診斷、預防和治療提供有效工具。隨著近年來對真菌病原研究的不斷深入，使人們重新看到了真菌PCR在臨床應用的曙光，本課題組大膽求索，建立了一種針對煙曲霉病原菌進行檢測的實時PCR法。
【背景技術】
[0002]侵襲性真菌感染(IFD)十分普遍，主要由念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬等機會致病真菌(或條件致病真菌)引起，也可由組織胞漿菌、皮炎芽生菌、孢子絲菌等地方流行性致病真菌所致，其中，曲霉菌屬已成為免疫低下患者二次感染的重要致命因素，IFD的早期診斷和早期治療對于改善病人預后有著重要意義，而當前真菌感染的特點是高院內(nèi)感染率、低實驗室診斷率、低臨床診斷率和病情進展迅速，傳統(tǒng)診斷方法包括深部組織培養(yǎng)法、組織/細胞病理學檢測、l-3-f1-D葡聚糖(G試驗)、半乳甘露聚糖檢測(GM試驗)和影像學檢查(如CT)等，由于它們在敏感性、特異性等方面存在缺陷，難以滿足臨床早期診斷的需要，如何提高IFD的早期診斷、早期治療是國內(nèi)外學者關注的熱點問題，所以近年來IFD的早期診斷方法的研究被廣泛開展，雖然當前仍處于實驗室研究階段，但其應用前景廣闊，值得期待。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]將煙曲霉線粒體基因組大小為30696bp，將其基因序列在http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi數(shù)據(jù)庫中進行比對,找出特有的祀序列部分,在祀序列上設計一對，上游引物:5’ CTTGAATACTTCAGTAACT 3’，下游引物:5’ CCTCTATTTACTAAATCATC 3’，探針 5’FAM-GCAAG GCGAT TTATC TCACC ACT_3’TARMA，靶片段長度 132bp。具體靶序列cttgaatac ttcagtaact attagtaata tgttattaga ttctgatata tatcataatc atatagatagaagaataata atgatacaaa gtggtgagat aaatcgcctt gctgatgatt tagtaaatag agg (132bp)0
[0004]構建含靶片段的TA克隆質(zhì)粒(委托寶生物公司完成)，制備梯度濃度的雙份樣本，具體濃度為 IO1 copies/ml, IO2 copies/ml, IO3 copies/ml, IO4 copies/ml, IO5copies/ml, IO6 copies/ml, 107copies/ml，IO8 copies/ml，進行 PCR 擴增并作融解曲線分析，驗證該方法的敏感性、穩(wěn)定性與特異性，同時分別以非煙曲霉菌基因組DNA，即白色念珠菌標準株(ATCC90028)基因組DNA、解脲支原體基因組DNA、人基因組DNA、人巨細胞病毒(HCMV)基因組DNA和HBV基因組DNA為模板，進一步驗證該方法的特異性；將PCR產(chǎn)物外送測序,驗證方法的可靠性。
[0005]PCR 反應總體積為 50 u L,包括 10 X 緩沖液(20Mm Mg2+plus) 5 U L, TaKaRaEx TaqDNA 聚合酶(5U/ii L) 0.8u L, dNTPs (各 2.5mmol/L) 4 y L，上游引物(10 y mol/L) 3 y L，下游引物(10 u mol/L) 3 u L,探針(10 u mol/L) 3 u L, DNA模板I ii L,加高壓滅菌后的雙蒸水CddH2O)將反應體積補足至50 u L0 PCR反應條件為:94°C預變性3min ;94°C變性10 s,55°C退火延伸40 S，共40個循環(huán)。
[0006]PCR擴增標準曲線的斜率-3.014383,截距40.882465，相關系數(shù)R2:0.997539，提示具有較好的相關性，(說明書附圖1)。該PCR檢測體系的檢測敏感性方面，線性檢測范圍的下限可至IO2 copies/ml,上限可達IO8 copies/ml ;雙份樣本的檢測結果總體一致(說明書附圖2)，提示該PCR檢測體系的重復性、穩(wěn)定性較好，PCR產(chǎn)物外送測序，測序結果符合預期。 [0007]【專利附圖】

【附圖說明】:圖1為PCR擴增標準曲線圖；圖2為PCR擴增曲線圖。
【權利要求】
1.選取煙曲霉線粒體基因序列的特有序列為祀位，具體祀序列cttgaatacttcagtaactattagtaata tgttattaga ttctgatata tatcataatc atatagatag aagaataata atgatacaaagtggtgagat aaatcgcctt gctgatgatt tagtaaatag agg (132bp)，設計上游引物:5’CTTGAATACTTCAGTAACT 3’，下游引物:5’ CCTCTATTTACTAAATCATC 3’，探針 5’FAM-GCAAGGCGAT TTATC TCACC ACT-3’TARMA。
2.PCR 反應總體積為 50 u L,包括 IOX 緩沖液(20Mm Mg2+plus) 5 U L, TaKaRaEx TaqDNA 聚合酶(5U/ii L) 0.8u L, dNTPs (各 2.5mmol/L) 4 y L，上游引物(10 y mol/L) 3 y L，下游引物(10 u mol/L) 3 u L,探針(10 u mol/L) 3 u L, DNA模板I ii L,加高壓滅菌后的雙蒸水(ddH20)將反應體積補足至50 ii L15PCR反應條件為:94°C預變性3min ;94°C變性10 s, 55V退火延伸40 s,共40個循環(huán)。`
【文檔編號】C12Q1/68GK103773838SQ201310355569
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年8月15日 優(yōu)先權日:2013年8月15日
【發(fā)明者】曹國君, 邢志芳, 趙縝 申請人:曹國君, 邢志芳, 趙縝