一種甜瓜種子純度檢驗的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甜瓜種子純度檢驗的方法，特別是一種利用SSR分子標(biāo)記對金露三號甜瓜種子進行純度檢驗的方法。其利用一對SSR引物FLWSSRL和FLWSSRR對甜瓜雜交品種金露三號的父母本和雜交一代的基因組DNA進行擴增和瓊脂糖凝膠電泳分離，找出雜交一代與父母本差異的特征譜帶，通過受檢種子純度計算，對金露三號雜一代種子樣品進行檢驗，其檢驗的純度經(jīng)與田間種植鑒定的純度對照比較，二者的結(jié)果高度一致。適用于對金露三號及其親本真實性和種子純度的檢驗。
【專利說明】一種甜瓜種子純度檢驗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于種子質(zhì)量檢驗【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及雜交甜瓜種子純度檢驗的方法，特別是一種利用SSR分子標(biāo)記對甜瓜金露三號種子進行純度檢驗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金露三號是由合肥豐樂種業(yè)股份有限公司培育的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交甜瓜新品種(詳見《遺傳資源來源披露登記表》)，具有優(yōu)秀的田間農(nóng)藝性狀。該品種在雜交制種過程當(dāng)中，需要通過母本人工去雄，授以父本花粉來完成雜交過程，母本去雄不徹底或漏去雄，將會極大地影響制種純度。傳統(tǒng)的雜交種純度檢測方法為種植鑒定，依賴于品種表型差異，通過成株外觀形狀比較鑒定，鑒定時間長、費用高、難度較大和準(zhǔn)確性差，特別是在田間表型鑒定主要依靠鑒定人員對相關(guān)品種及其親本的熟悉程度，是一種完全的經(jīng)驗型判斷，鑒定人員本身素質(zhì)的高低直接關(guān)系鑒定純度及鑒定成功與否，因此田間鑒定越來越不適宜現(xiàn)代種業(yè)的發(fā)展需要。
[0003]SSR(Simple Sequence Repeat)是在PCR(Polymerase Chain Reaction)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)，具有高度多態(tài)性、共顯性、保守性、且僅需少量的DNA、操作簡便、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，在動物、植物、微生物等研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用，并已開始應(yīng)用于甜瓜的遺傳多樣性分析及雜交種純度的鑒定研究。本研究利用金露三號雜交種與雙親在一些SSR位點上的差異，尋找合適的引物擴增出雜交種與雙親差異明顯的穩(wěn)定條帶，用于金露三號的室內(nèi)純度檢測。為金露三號純度鑒定提供一個準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快捷、實用的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在·于提供一種能夠?qū)μ鸸戏N子進行準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快捷且實用的檢驗方法。
[0005]其技術(shù)方案是:一種甜瓜種子純度檢驗的方法，按下述步驟操作:
[0006]I) DNA 提取:
[0007]f)將甜瓜種子置于營養(yǎng)缽中發(fā)芽出苗，等到幼苗有2-3片真葉時，取2.5-3.5cm2的葉片于小研缽中，加入4XCTAB提取緩沖液將其研碎，轉(zhuǎn)入離心管，65°C水浴半小時；
[0008]g)加入與提取緩沖液等體積的的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，12000rpm離心10分鐘，吸其上清置于另一離心管，加入冰凍無水乙醇，_20°C冰柜內(nèi)放置60分鐘沉淀DNA ；
[0009]h) 12000rpm離心10分鐘，棄上清；加濃度為75%的乙醇，靜置4分鐘去鹽，棄去乙醇；
[0010]i)離心管置于加熱通風(fēng)烘箱中，65°C風(fēng)干；
[0011]j)加滅菌雙蒸水溶解待用；
[0012]上述4XCTAB提取緩沖液由4%(w/v)的十六烷基三甲基溴化銨，1.4mol/L的氯化鈉 NaCl,0.lmol/L 的 Tris-Cl 緩沖液(pH8.0),0.02mol/L 的乙二胺四乙酸和 0.2%(v/v)的α-巰基乙醇構(gòu)成；
[0013]上述苯酚-氯仿-異戊醇混合液由氯仿和異戊醇混合而成，其混合體積比為1:24: I ；
[0014]2) PCR 反應(yīng):
[0015]在PCR管中分別加入DNA模板、改性緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷、引物FLXGSSRL和FLXGSSRR、Taq酶及雙蒸水；先94°C預(yù)變性4分鐘；再94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，32個循環(huán)；72°C延伸7分鐘，95°C水浴4分鐘變性后置冰上；[0016]上述改性緩沖液為10 X PCR緩沖液+2 X 10^3mol/L氯化鎂；
[0017]上述引物FLXGSSRL 序列為 5’ -GATTCATTAGGCGGTGAG-3’ ；
[0018]上述引物FLXGSSRR 序列為 5’ -CGTGGGTTGATTGATGTTGT-3’ ；
[0019]3 )瓊脂糖凝膠電泳檢測:
[0020]將瓊脂糖加入100ml的5 X TBE中攪拌混合均勻后加熱，配制成濃度為3%的瓊脂糖溶液，室溫下冷卻至55-65°C，每200ml瓊脂糖溶液中加入0.5μ g的核酸染料sybe GreenI，倒入專用瓊脂糖制膠模板內(nèi)，插梳；待瓊脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，將凝膠放入具有1.5XTBE電泳液的電泳槽中，以電泳液高出凝膠0.5cm為宜，點樣；設(shè)定電壓200V,電泳半小時，關(guān)閉電源，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照；
[0021]4)受檢種子純度計算:
[0022]用上述方法分別獲取甜瓜雜交一代和親本種子電泳譜帶，計數(shù)受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)，并用下式計算受檢樣品的種子純度(％) =受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)/受檢種子總數(shù)X100%。
[0023]其技術(shù)效果是:本發(fā)明利用一對SSR引物FLXGSSRL和FLXGSSRR對甜瓜雜交品種金露三號的父母本和雜交一代的基因組DNA進行擴增和瓊脂糖凝膠電泳分離，找出雜交一代與父母本差異的特征譜帶，通過受檢種子純度計算，對金露三號雜一代種子樣品進行檢驗，其檢驗的純度經(jīng)與田間種植鑒定的純度對照比較，二者的結(jié)果高度一致(詳見附表1)。
[0024]附表1:應(yīng)用SSR分子標(biāo)記室內(nèi)檢測純度與田間種植鑒定純度對照表
[0025]
【權(quán)利要求】
1.一種甜瓜種子純度檢驗的方法，按下述步驟操作: 1)DNA提取: a)將甜瓜種子置于營養(yǎng)缽中發(fā)芽出苗，等到幼苗有2-3片真葉時，取2.5-3.5cm2的葉片于小研缽中，加入4XCTAB提取緩沖液將其研碎，轉(zhuǎn)入離心管，65°C水浴半小時； b)加入與提取緩沖液等體積的的苯酚-氯仿-異戊醇混合液，12000rpm離心10分鐘，吸其上清置于另一離心管,加入冰凍無水乙醇，_20°C冰柜內(nèi)放置60分鐘沉淀DNA ； c)12000rpm離心10分鐘，棄上清；加濃度為75%的乙醇，靜置4分鐘去鹽，棄去乙醇； d)離心管置于加熱通風(fēng)烘箱中，65°C風(fēng)干； e)加滅菌雙蒸水溶解待用； 上述4XCTAB提取緩沖液由4%(w/v)的十六烷基三甲基溴化銨，1.4mol/L的氯化鈉NaCl,0.lmol/L 的 Tris-Cl 緩沖液(pH8.0),0.02mol/L 的乙二胺四乙酸和 0.2% (v/v)的a-巰基乙醇構(gòu)成； 上述苯酚-氯仿-異戊醇混合液由氯仿和異戊醇混合而成，其混合體積比為1:24:I; 2)PCR反應(yīng): 在PCR管中分別加入DNA模板、改性緩沖液、三磷酸脫氧核糖核苷、引物FLXGSSRL和FLXGSSRR、Taq酶及雙蒸水；先94°C預(yù)變性4分鐘；再94°C變性30秒，55°C退火30秒，72 °C延伸I分鐘，32個循環(huán)；72°C延伸7分鐘，95°C水浴4分鐘變性后置冰上； 上述改性緩沖液為10XPCR緩沖液+2X 10_3mol/L氯化鎂； 上述引物 FLXGSSRL 序列為 5’ -GAITCATTAGGCGGTGAG-3’ ； 上述引物 FLXGSSRR 序列為 5’ -CGTGGGTTGATTGATGTTGT-3?； 3)瓊脂糖凝膠電泳檢測: 將瓊脂糖加入100ml的5 X TBE中攪拌混合均勻后加熱，配制成濃度為3%的瓊脂糖溶液，室溫下冷卻至55-65°C，每200ml瓊脂糖溶液中加入0.5 y g的核酸染料sybe Green I，倒入專用瓊脂糖制膠模板內(nèi)，插梳；待瓊脂糖溶液完全凝固后，拆除模板和梳子，將凝膠放入具有1.5 X TBE電泳液的電泳槽中，以電泳液高出凝膠0.5cm為宜，點樣；設(shè)定電壓200V，電泳半小時，關(guān)閉電源，使用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照； 4)受檢種子純度計算: 用上述方法分別獲取甜瓜雜交一代和親本種子電泳譜帶，計數(shù)受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)，并用下式計算受檢樣品的種子純度(％) =受檢樣品中有清晰的兩條帶型的種子數(shù)/受檢種子總數(shù)X 100%。
【文檔編號】C12Q1/68GK103627786SQ201310305714
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】周賢達, 王兆賢, 陳會中, 王浩波, 吳義兵, 周桂林, 林茂, 朱先飛, 徐麗媛, 王麗梅 申請人:合肥豐樂種業(yè)股份有限公司