一種熒光實時pcr法檢測食品中鴨源性成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種熒光實時PCR法檢測食品中鴨源性成分的方法。本發(fā)明涉及動物物種和動物源性成分鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及食品中鴨源性成分的方法；尤其涉及一種熒光實時PCR法檢測食品中鴨源性成分的方法。本發(fā)明旨在鑒別食品中是否含有鴨源性成分。本發(fā)明根據(jù)鴨線粒體細(xì)胞色素b(cytb)基因設(shè)計鴨源特異引物和探針體系，對食品中鴨源性成分進(jìn)行檢測，操作簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，進(jìn)一步完善食品肉種來源鑒別體系，維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益。
【專利說明】-種熒光實時PCR法檢測食品中鴨源性成分的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及動物物種和動物源性成分鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及食品中鴨源性成分 的方法；尤其涉及一種熒光實時PCR法檢測食品中鴨源性成分的方法。

【背景技術(shù)】：
[0002] 隨著人民生活水平的提高、食品質(zhì)量安全監(jiān)管部門檢測技術(shù)的不斷完善和更新， 食品摻假的手段也在不斷提高。不法商販、企業(yè)為獲得非法利潤，常以較低價的雞肉、豬肉 或鴨肉冒充牛、羊肉，再在摻假的肉類中加入各種香精基料，使消費(fèi)者不能從感官上加以鑒 另IJ。由于替代成分通常與被替代成分在生化、理化、感官性質(zhì)上及其相似，加之食物本身的 復(fù)雜性和可變性，使得常規(guī)檢測方法如電泳、免疫學(xué)技術(shù)、色譜技術(shù)、傳統(tǒng)PCR等多有不足， 如靈敏度低、周期長、費(fèi)時費(fèi)力。
[0003] 實時熒光PCR技術(shù)以DNA為模板，設(shè)計特異引物探針，在封閉的體系中進(jìn)行擴(kuò)增和 實時檢測，無需電泳就可以對結(jié)果進(jìn)行分析，避免了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物的污染和EB帶來的危害， 縮短檢測時間，且擴(kuò)增目的片段較短，尤其適用加工食品。該發(fā)明旨在利用實時熒光PCR技 術(shù)建立食品中鴨源成分檢測方法，為質(zhì)檢部門打擊不法商販、維護(hù)消費(fèi)者合法利益提供有 力的科學(xué)依據(jù)。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明旨在鑒別食品中是否含有鴨源性成分。
[0005] 技術(shù)解決方案：
[0006] 基于Genbank上已公布的鴨線粒體細(xì)胞色素 Cyt b基因設(shè)計鴨特異性的引物探 針體系（鴨源性上游引物F :5' -GCAACTGCCTTCGTAGGTTATGTC-3';鴨特異性下游引物R : 5' -GGAGGGCTGAAAATAAGTTGGTAA-3，；鴨特異性探針序列 P : 5，（FAM) -ATGAGGACAAATATCG TTCTGAGGAGCTACCGTA-3 ^ (TRAMA))，以提取的肉（制）品中動物組織DNA為PCR擴(kuò)增模板， 進(jìn)行鴨特異性擴(kuò)增探針引物進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，最終對樣品中目標(biāo)DNA進(jìn)行 判定，達(dá)到對樣品中所含成分進(jìn)行鑒別判斷。主要步驟包括：
[0007] 1)樣品中DNA的提??；
[0008] 2)以提取到的DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物探針體系進(jìn)行實時熒光PCR反 應(yīng)，反應(yīng)體系的體積為25 μ L :Taqman PCR master mixl2. 5 μ L ;上下游引物、突光標(biāo)記探針 各1 μ L ;模板DNA1 μ L ;其余不足用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊；
[0009] 3)在樣品檢測的同時，設(shè)置空白對照（以水代替DNA模板）、陰性對照（以非目標(biāo) 肉DNA為模板）、陽性對照（以純鮮鴨肉DNA為模板）；
[0010] 4)反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：50°C，2min ;95°C，10min ;951：，158,601：，11^11，40個循環(huán)，于實 時熒光PCR儀上進(jìn)行。閾值設(shè)置時保證閾值不小于陰性對照的最高熒光值，使陰性對照Ct 值大于35 ;
[0011] 5)質(zhì)量控制對照結(jié)果：
[0012] 空白對照：無熒光信號檢出；
[0013] 陰性對照：無熒光信號檢出（Ct值大于35);
[0014] 陽性對照：有熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值< 28。
[0015] 6)結(jié)果判定：
[0016] Ct值小于35,且空白、陰性及陽性對照結(jié)果正常者判為檢出鴨源性成分；
[0017] Ct值大于35,且空白、陰性及陽性對照結(jié)果正常者判為未檢出鴨源性成分；空白、 陰性及陽性對照結(jié)果結(jié)果異常時重做實驗；
[0018] 本發(fā)明的有益效果：
[0019] 本發(fā)明設(shè)計了鴨源性成分檢測的特異性引物、探針體系，規(guī)定了具體檢測和結(jié)果 判定方法，可定性檢測食品中的鴨源性成分，進(jìn)一步完善食品肉種來源鑒別體系，維護(hù)消費(fèi) 者權(quán)益。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是鴨源性引物探針體系特異性檢測實時熒光PCR擴(kuò)增曲線
[0021] 圖2是鴨源引物探針體系靈敏度檢測實時熒光PCR擴(kuò)增曲線

【具體實施方式】
[0022] 1、所用引物、探針體系
[0023] 鴨源性上游引物 F:5' -GCAACTGCCTTCGTAGGTTATGTC-3';
[0024] 鴨特異性下游引物 R:5，-GGAGGGCTGAAAATAAGTTGGTAA-3，；
[0025] 鴨特異性探針序列P :
[0026] 5 ' （FAM)-ATGAGGACAAATATCGTTCTGAGGAGCTACCGTA-3，（TRAMA)
[0027] 2、基因組模板制備采用一次性的組織研磨棒等實驗器具對樣品進(jìn)行均質(zhì)處理，保 證樣品的均勻性以及避免樣品間的相互污染，按照組織基因組DNA提取試劑盒說明書步驟 進(jìn)行，最終提取D 26(l/0D28(l比值均在1. 5?2. 0之間的動物組織DNA。
[0028] 3、實時熒光PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系的體積為25 μ L :Taqman PCR master mixl2. 5 μ L ;上下游引物、熒光標(biāo)記探針各1 μ L ;模板DNA1 μ L ;其余不足用滅菌雙蒸水補(bǔ) 齊。
[0029] 4、實時熒光PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：50°C，2min ;95°C，10min ;95°C，15s， 60°C，lmin，40個循環(huán)，于實時熒光PCR儀上進(jìn)行。閾值設(shè)置時保證閾值不小于陰性對照的 最高熒光值，使陰性對照Ct值大于35。
[0030] 5、特異性試驗以雞、牛、羊、豬及鴨等純?nèi)馓崛〉腄NA，控制濃度在50ng/μ L左右， 進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)，以驗證所設(shè)計引物、探針的特異性。鴨特異性引物和探針體系應(yīng)對 鴨源以外成分無擴(kuò)增。
[0031] 6、靈敏度試驗取純鴨肉提取DNA，用滅菌雙蒸水進(jìn)行稀釋，濃度25?0.0016ng/ μ L，取1 μ L為模板，進(jìn)行實時熒光PCR，檢測所設(shè)計鴨特異性引物探針體系的靈敏度。
[0032] 7、質(zhì)量控制對照結(jié)果：
[0033] 空白對照：無突光信號檢出；
[0034] 陰性對照：無熒光信號檢出（Ct值大于35);
[0035] 陽性對照：有熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值< 28。
[0036] 8、結(jié)果判定：
[0037] Ct值小于35,且空白、陰性及陽性對照結(jié)果正常者判為檢出鴨源性成分；
[0038] Ct值大于35,且空白、陰性及陽性對照結(jié)果正常者判為未檢出鴨源性成分；空白、 陰性及陽性對照結(jié)果結(jié)果異常時重做實驗；
[0039] 9、檢測結(jié)果
[0040] 所設(shè)計鴨的引物探針體系只針對鴨源模板進(jìn)行擴(kuò)增，且重復(fù)性良好，對其他動物 源性成分：豬、牛、羊、雞等肉類均不能擴(kuò)增出正常曲線，正常擴(kuò)增Ct值限定為35循環(huán)內(nèi)，證 實該檢測體系具有較好的特異性。
[0041] 鴨 DNA 模板濃度依次為 25、5、1、0· 2、0· 04、0· 008 及 0· 0016ng/ μ L，其 Ct 值分別 為：18· 78、21· 57、24· 17、26· 94、29· 74、33· 02、37· 34。其中濃度 0· 008ng/y L 的模板獲得正 常的擴(kuò)增曲線，Ct值< 35,說明該引物探針體系可檢測到0. 008ng的鴨源DNA。
[0042] 本發(fā)明的一種熒光實時PCR法檢測食品中鴨源性成分的方法具有良好的靈敏度 以及特異性。
【權(quán)利要求】
1. 一種鴨源特異性的實時熒光PCR引物、探針體系。鴨源性上游 引物 F :5 ' -GCAACTGCCTTCGTAGGTTATGTC-3 ';鴨特異性下游引物 R : 5' -GGAGGGCTGAAAATAAGTTGGTAA-3，；鴨特異性探針序列 P : 5，（FAM) -ATGAGGACAAATATCG TTCTGAGGAGCTACCGTA-3，（TRAMA)。
2. -種用權(quán)利要求1所述的鴨源特異性的實時熒光PCR引物、探針體系進(jìn)行食品中鴨 源性成分的檢測。主要步驟包括： 1) 樣品中DNA的提?。? 2) 以提取到的DNA為模板，用權(quán)利要求1所述引物探針體系進(jìn)行實時熒光PCR反應(yīng)， 反應(yīng)體系的體積為25yL:Taqman PCR master mixl2. 5yL;上下游引物、突光標(biāo)記探針各 1 μ L ;模板DNA1 μ L ;其余不足用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊； 3) 在樣品檢測的同時，設(shè)置空白對照（以水代替DNA模板）、陰性對照（以非目標(biāo)肉 DNA為模板）、陽性對照（以純鮮鴨肉DNA為模板）； 4) 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：50°C，2min ;95°C，lOmin ;95°C，15s，60°C，lmin，40 個循環(huán)，于實時熒 光PCR儀上進(jìn)行。閾值設(shè)置時保證閾值不小于陰性對照的最高熒光值，使陰性對照Ct值大 于35 ; 5) 質(zhì)量控制對照結(jié)果： 空白對照：無突光信號檢出； 陰性對照：無熒光信號檢出（Ct值大于35); 陽性對照：有熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值< 28。 6) 結(jié)果判定： Ct值小于35,且空白、陰性及陽性對照結(jié)果正常者判為檢出鴨源性成分； Ct值大于35,且空白、陰性及陽性對照結(jié)果正常者判為未檢出鴨源性成分；空白、陰性 及陽性對照結(jié)果結(jié)果異常時重做實驗。
【文檔編號】C12N15/11GK104232742SQ201310225966
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月8日
【發(fā)明者】金萍, 丁洪流, 李培, 陳英 申請人:蘇州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所