一種白念珠菌CaFUN30基因的用途及缺失CaFUN30基因的白念珠菌減毒株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種白念珠菌CaFUN30基因的用途及缺失CaFUN30基因的白念珠菌減毒株。本發(fā)明提供一種白念珠菌CaFUN30基因的用途，用于制備白念珠菌減毒株，或者用于制備或篩選白念珠菌治療藥物。本發(fā)明成功構(gòu)建了一種白念珠菌CaFUN30減毒株，并進(jìn)一步提供了所述CaFUN30減毒株的構(gòu)建方法，在本發(fā)明的減毒株中CaFUN30基因不表達(dá)，白念珠菌減毒株相對于野生型白念珠菌，其白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的效率大幅降低，從而降低了白念珠菌的毒性。
【專利說明】—種白念珠菌CaFUN30基因的用途及缺失CaFUN30基因的白念珠菌減毒株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種白念珠菌CaFUN30基因的用途及缺失CaFUN30基因的白念珠菌減毒株。

【背景技術(shù)】
[0002]白念珠菌(Candida albicans)是一種臨床上分離到的一種機(jī)會(huì)性人體致病真菌，特別在免疫下調(diào)的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起廣泛的淺部和深部系統(tǒng)感染，感染部位包括口腔，女性陰道等，引起鵝口瘡，陰道炎等，也可以侵入表皮和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血液而到達(dá)內(nèi)臟器官，如腎臟，腦部等，導(dǎo)致敗血癥，嚴(yán)重可以導(dǎo)致死亡(Odds, F.C.1994.J.Am.Acad, Dermatol.31: S2-S5.)。白念珠菌在不同的生長條件下，有不同的生長形態(tài)，包括菌體(yeast form),假菌絲(pseudohyphae),菌絲(hyphae)以及白菌(white cell),灰菌(opaque cell)。這種形態(tài)轉(zhuǎn)化能力直接影響白念珠菌的致病能力(Odds, F.C.1985.Crit Rev Microb1l.12:45-93;Brown, A.J.P.et al.1999.Trends Microb1l.7:334-338.)。白菌和灰菌在不同的感染系統(tǒng)中致病性是不同的，白圃在系統(tǒng)感染中的致病性較強(qiáng)，而灰圃在表皮感染中致病性較強(qiáng)。首例臨床的白念樣本是從感染白念珠菌的骨髓移植病人的血液中分離到的W0-1菌株(Slutsky, et al.1985.Science.230:666-669;Slutsky, et al.1987.J Bacter1l.169，189-197.)。白念珠菌的白菌和灰菌形態(tài)是可以相互轉(zhuǎn)換的，但是在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)條件下，白念珠菌的白-灰形態(tài)之間的轉(zhuǎn)換效率很低，只有大約10_4~10_5，(Rikkerink.et al.1988.JBacter1l.170，895-899)。許多培養(yǎng)條件可以影響白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換，包括UV，CO2, PH,溫度，GlcNAc 等(Huang, et al.2009.Curr B1l.19:330-334;Huang, et al.2010.PLoSPathog.6:e1000806.Xie J.et al.2013.PLoS B1l.11 (3): e1001525.)。比如 22°C _24°C的低溫能夠促進(jìn)白菌向灰菌轉(zhuǎn)換，低溫有助于維持灰菌細(xì)胞的狀態(tài)，而當(dāng)溫度達(dá)到30°C時(shí)，細(xì)胞將幾乎100%保持在白菌細(xì)胞狀態(tài)。另外CO2以及GIcNAc單獨(dú)作用和協(xié)同作用均能明顯促進(jìn)白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的效率。但是這些環(huán)境因素發(fā)揮功能均不能繞過Worl蛋白。
[0003]Worl是白念珠菌白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵的調(diào)控因子(Huang, et al.2006.Proc Natl Acad Sci USA.103:12813-12818.Zordan RE.2006.Proc Natl Acad SciUSA.103:12807-12812.)。Worl只在灰菌細(xì)胞中能夠檢測到3.9kb和2.5kb兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本。異位過表達(dá)Worl能夠使細(xì)胞鎖定在灰菌狀態(tài)，敲除Worl則細(xì)胞呈現(xiàn)白菌狀態(tài)。MTLa I/α 2復(fù)合體在Worl的啟動(dòng)子區(qū)域具有結(jié)合位點(diǎn)，因此能夠抑制Worl蛋白的表達(dá)，但是當(dāng)在MTLa和MTLa菌株中，即MTL a I/a 2復(fù)合體的抑制作用被解除之后，Worl蛋白的表達(dá)水平達(dá)到一定的閾值，就會(huì)結(jié)合到自身的啟動(dòng)子區(qū)域，從而激活并維持自身的表達(dá)，使細(xì)胞向灰菌狀態(tài)轉(zhuǎn)換。同時(shí)Worl也能結(jié)合到其它灰菌特異性基因以及灰菌抑制基因的啟動(dòng)子區(qū)域來調(diào)控白念珠菌的白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換。例如WORl可以結(jié)合到W0R2和CZFl的啟動(dòng)子區(qū)域，誘導(dǎo)兩者的表達(dá)，W0R2又能夠反饋促進(jìn)WORl的表達(dá)，這雙重機(jī)制能夠保證WORl的高表達(dá)水平。另外CZFl又可以通過抑制EFGl的表達(dá)轉(zhuǎn)錄間接的激活WORl的表達(dá)，從而建立一個(gè)循環(huán)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，來維持細(xì)胞的狀態(tài)(Zordan RE.2007.PLoS B1l.5:e256.)。但是Worl的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)里還有那些蛋白參與，研究的并不是很深入，調(diào)控的機(jī)制也不是很清楚。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]白念珠菌(Candida albicans)是一種人類常見的機(jī)會(huì)型致病真菌,能進(jìn)行多種形態(tài)轉(zhuǎn)變，包括酵母-菌絲轉(zhuǎn)變和白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)變，這些形態(tài)變化的頻率會(huì)在一定程度上影響白念珠菌的致病性。而Worl (White-Opaque Regulatorl)蛋白是白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控因子。通過酵母雙雜交文庫的篩選，本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一種新的基因，該基因能夠參與Worl蛋白對白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。由于通過基因組序列分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白序列與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FUN30具有很高的序列同源性以及結(jié)構(gòu)相似性，故命名為CaFUN30。
[0005]本發(fā)明的目的在于通過白念珠菌白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控因子CaFun30在白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換效率和毒性表現(xiàn)中的功能作用的研究，公開CaFUN30基因在白念珠菌菌絲生長調(diào)控以及致病機(jī)理研究領(lǐng)域的用途，并構(gòu)建獲得一種白念珠菌減毒菌株。
[0006]本發(fā)明第一方面公開一種白念珠菌CaFUN30基因的用途,用于制備白念珠菌減毒株，或者用于制備或篩選白念珠菌治療藥物。
[0007]優(yōu)選的，所述白念珠菌減毒株為CaFUN30基因不表達(dá)的白念珠菌cafun30/cafun30缺失株。
[0008]優(yōu)選的，所述CaFUN30基因編碼的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]優(yōu)選的，所述CaFUN30基因含有如SEQ ID NO:1所示的基因序列。
[0010]更優(yōu)選的，本發(fā)明所述cafun30/cafun30缺失株為白念珠菌的減毒株。在所述白念珠菌cafun30/cafun30缺失株中CaFUN30基因不表達(dá)。
[0011]本發(fā)明所述白念珠菌治療藥物為以CaFUN30基因?yàn)橹委煱谢?，使CaFUN30基因不表達(dá)的藥物、或者以CaFUN30基因表達(dá)的蛋白為拮抗對象的藥物；或者以CaFUN30基因和其他基因共同作為靶基因加以沉默的藥物。以CaFUN30基因?yàn)榘悬c(diǎn)，篩選或制備使該基因不表達(dá)的藥物，用于降低白念珠菌白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換率，從而使白念珠菌毒性減弱，以治療白念珠菌感染。例如，該白念珠菌治療藥物可以通過RNA干擾或者基因重組的方法使CaFUN30基因不表達(dá)；或者通過制備CaFUN30蛋白拮抗劑，使CaFUN30基因表達(dá)的蛋白不發(fā)揮作用。
[0012]本發(fā)明第二方面提供一種白念珠菌減毒株，為白念珠菌cafun30/cafun30缺失株，所述減毒株中CaFUN30基因不表達(dá)。
[0013]優(yōu)選的，所述白念珠菌cafun30/cafun30缺失株中，CaFUN30基因通過同源重組的方法敲除。
[0014]優(yōu)選的，所述白念珠菌cafun30/cafun30缺失株與野生型白念珠菌相比，降低了白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的效率，從而降低了白念珠菌的毒性。
[0015]本發(fā)明第三方面提供所述的白念珠菌減毒株的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0016]I)單拷貝缺失株的構(gòu)建:使用URA-BLAST敲除法，體外構(gòu)建敲除質(zhì)粒，所述敲除質(zhì)粒中含有與CaFUN30開放閱讀框同源的重組片段，并且該重組片段中含有HisG-URA3_HisG篩選片段；利用線性化的敲除質(zhì)粒通過同源重組的方法敲除白念珠菌染色體上的一個(gè)CaFUN30拷貝，獲得單拷貝缺失菌株；經(jīng)鑒定正確的單拷貝缺失菌株通過URA3環(huán)出，篩選得到Ura-菌株；
[0017]2)雙拷貝缺失株的構(gòu)建:使用URA-BLAST敲除法，再次將線性化的敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化AUra-菌株中，進(jìn)行第二拷貝的敲除，得到fun30/fun30的雙拷貝缺失菌株。
[0018]優(yōu)選的，所述敲除質(zhì)粒的構(gòu)建方法具體包括如下步驟:利用PCR方法擴(kuò)增出上下游基因序列300bp-700bp片段作為同源重組臂，將同源重組臂構(gòu)建到載體上，再將hisG-URA3-hisG片段連接到載體上。
[0019]更優(yōu)選的，所述同源重組臂，上游基因序列
[0020]引物FUN30UF:5，ccc AAGCTTGTCTTTTATGGAACTTCC3’ (SEQ ID NO:3)
[0021]引物FUN30UR:5，ccgGGATCCTTGAATGAAAATAAGTAATACCAGC3’ (SEQ ID NO:4)
[0022]從基因組上擴(kuò)增出上游同源臂533bp，
[0023]下游基因序列
[0024]引物FUN30DF:5，cccGGTACCACAAAATAAGAAATGTACACATTTGAAGCTG3’ (SEQ ID NO:5)
[0025]引物F UN30DR:5，ccgGAATTCAATACTGTCAATCCACCACCACC3，(SEQ ID NO:6)
[0026]從基因組上擴(kuò)增出下游同源臂366bp。
[0027]更優(yōu)選的，所述載體為PMD18-T載體。
[0028]更優(yōu)選的，所述hisG-URA3_hisG片段利用Bgl I1-BamH I從PCUB6載體上酶切回收，再連接到BamH I單酶切的構(gòu)建好的載體上。
[0029]優(yōu)選的，所述步驟I中，通過PCR以及Southern的方法鑒定單拷貝缺失菌株的陽性轉(zhuǎn)化子。
[0030]優(yōu)選的，所述步驟2中，通過Southern方法進(jìn)行鑒定,得到fun30/fun30的雙拷貝缺失菌株(此敲除株將CaFUN30基因的ORF全長(3294bp)用hisG-URA3_hisG序列替換，這樣基因就被全部敲除了)。
[0031]本發(fā)明第四方面提供所述白念珠菌減毒株在研究白念珠菌發(fā)育及毒性功能中的應(yīng)用，或者在制備或篩選白念珠菌治療藥物中的應(yīng)用。
[0032]本發(fā)明的白念珠菌減毒株相對于野生型白念珠菌，其白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的效率大幅降低，從而降低了白念珠菌的毒性。
[0033]本發(fā)明成功構(gòu)建了一種白念珠菌CaFUN30減毒株，并進(jìn)一步提供了所述CaFUN30減毒株的構(gòu)建方法，在本發(fā)明的減毒株中CaFUN30基因不表達(dá)。本發(fā)明發(fā)明人發(fā)現(xiàn)白念珠菌CaFun30蛋白與Worl蛋白在白念珠菌體內(nèi)具有相互作用，這表明這個(gè)蛋白可能參與到Worl對白-灰形態(tài)調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)之中，其毒性相關(guān)基因CaFUN30和白念珠菌減毒株均可用于制備或篩選白念珠菌治療藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1A顯示了 CaFUN30基因敲除菌株的Southern blot鑒定策略。
[0035]圖1B顯示了第一條染色體上的CaFUN30基因敲除的鑒定圖。JYCl (JYCl，MTLa/a野生型)為背景的敲除菌株中Fun30/fun301#及其環(huán)出URA3后的菌株均為正確敲除菌株，F(xiàn)un30/fun304#整合出現(xiàn)問題，條帶大小錯(cuò)誤；CAI4(MTLa/a野生型)為背景的敲除菌株中Fun30/fun302#和3#及其環(huán)出URA3后的菌株均為正確整合菌株。
[0036]圖1C顯示了 CaFUN30第二拷貝基因敲除的Southern鑒定圖。fun30/fun302#為JYCl背景下的正確敲除菌株。
[0037]圖2顯示了 CaFUN30對于白念珠菌白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的功能研究。過表達(dá)CaFUN30促進(jìn)了白菌形成灰菌的轉(zhuǎn)換能力，而野生型JYCl、FUN30/fun30和fun30/fun30均沒有明顯的白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的變化。
[0038]圖3顯示了 fun30/fun30敲除菌株的毒性研究。與SC5314(MTLa/ α野生型菌株)和JYCl (MTLa/a野生型菌株)這兩種野生型相比，fun30/fun30敲除菌株對小鼠的毒性明顯減弱了，表明CaFun30是一個(gè)影響白念珠菌毒性的因子。
[0039]圖4顯示了 CaFun30是核定位的蛋白。

【具體實(shí)施方式】
[0040]以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的【具體實(shí)施方式】加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。
[0041]請參閱圖1-4。需要說明的是，本實(shí)施例中所提供的圖示僅以示意方式說明本發(fā)明的基本構(gòu)想，遂圖式中僅顯示與本發(fā)明中有關(guān)的組件而非按照實(shí)際實(shí)施時(shí)的組件數(shù)目、形狀及尺寸繪制，其實(shí)際實(shí)施時(shí)各組件的型態(tài)、數(shù)量及比例可為一種隨意的改變，且其組件布局型態(tài)也可能更為復(fù)雜。
[0042]本發(fā)明中的名字表述說明:白念珠菌FUN30基因用CaFUN30表示，在不會(huì)與釀酒酵母FUN30基因混淆的情況下也用FUN30表示，白念珠菌Fun30蛋白用CaFun30表示，在不會(huì)與釀酒酵母Fun30蛋白混淆的情況下也用Fun30表示，白念珠菌FUN30基因缺失株用cafun30/cafun30表示，在不會(huì)與釀酒酵母FUN30基因缺失株混淆的情況下也用fun30/fun30表不。
[0043]下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0044]基本實(shí)驗(yàn)方法:
[0045]1.白念珠菌基因組DNA抽提:
[0046]白念珠菌培養(yǎng)過夜用Iml ddH20洗I次，懸浮在500 μ I溶液A中(IM山梨醇，10mMEDTA ρΗ8.0)，加入2μ 120mg/ml的Zymolase，37。C放置I小時(shí)后，高速離心去上清，細(xì)胞用 500 μ I of TE buffer (20mM Tris.HCl pH7.5，ImM EDTA)洗一次，徹底重懸細(xì)胞沉淀，懸浮在 350 μ I of TE buffer 中，并加入 90 μ I of 溶液 B (250mM EDTA pH8.0, 400mMTris.HCl pH8.0，2%SDS)，65° C 放置 30min，加入 80 μ I of5M KAc，混勻，冰上放置 I 小時(shí)，高速離心5分鐘，吸取上清并加入1ml的無水乙醇和50ul3M NaAc, -20° C放置20分鐘使基因組DNA徹底沉淀，高速離心5分鐘，沉淀用75%乙醇洗一次，離心后烘干。加入適量的水溶解DNA。
[0047]2.白念珠菌的轉(zhuǎn)化:
[0048]首先是白念珠菌感受態(tài)細(xì)胞的制備，將過夜培養(yǎng)至飽和狀態(tài)的菌進(jìn)行轉(zhuǎn)接到50ml新鮮的Yro培養(yǎng)基中，30°C繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)。收集細(xì)胞，用Iml的TE buffer洗細(xì)胞沉淀一次，離心棄上清，然后加入IXTE buffer和0.1M LiAc buffer重懸菌體，并靜置5分鐘，離心棄上清，此時(shí)就是白念珠菌的感受態(tài)細(xì)胞。準(zhǔn)備PEG/LiAc溶液(pH7.5) 1ml ;在1.5ml Eppendof管中依次加入質(zhì)粒(線形化質(zhì)粒大約5 μ g), 10 μ 110mg/ml魚精DNA,混勻；加入 0.1ml 感受態(tài)細(xì)胞和 0.6mlPEG/LiAc，Vortex 混勻；30°C 200rpm 培養(yǎng) 30min ;42°C熱擊22min ;冰浴~5min:6000rpm離心lmin,吸掉上清,用0.2mIddH2O重懸細(xì)胞；涂布于適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)缺陷的篩選SD平板上。
[0049]實(shí)施例1白念珠菌CaFUN30基因的異位過表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0050]由于在白念珠菌中FUN30基因?yàn)橐粋€(gè)功能未知的新基因，并且我們是利用酵母雙雜交文庫篩選得到的能夠與Worl相互作用的蛋白，所以為了檢測CaFUN30是否也在白念珠菌的白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮功能，我們首先構(gòu)建了過表達(dá)FUN30的質(zhì)粒。過表達(dá)CaFUN30質(zhì)粒構(gòu)建在BAl載體上，位于ADHl啟動(dòng)子下游，兩端具有Ade2的同源重組臂(同源臂就包含在BAl載體中)(BAl載體構(gòu)建方法見Ca0.et al., 2006.Mol B1lCelll7:295-307.)。利用 CGD 網(wǎng)站(http://www.candidagenome.0rg/)搜索得到白念珠菌中FUN30的基因全長序列(SEQ ID NO:1)，然后設(shè)計(jì)引物
[0051]FUN30F:5’ccgAGATCTATGAGTTGGTTTAGAAGAAATAAACCAACG3’ (SEQ ID NO:7)
[0052]FUN30R:5’cccGGTACCTCAACTATAAACTATTGACTCTAATGTTGAAATC3’ (SEQ ID NO:8)
[0053]從野生型菌株SC5314基因組中擴(kuò)增FUN30的全長片段3294bp。利用Bgl I1-KpnI酶切后將FUN30全長連入BAl載體，將質(zhì)粒用Asc I酶切成線性化，轉(zhuǎn)入白念珠菌JYCl (MTLa/a型菌株)中進(jìn)行同源重組，使得目的片段異位整合到Ade2區(qū)域進(jìn)行表達(dá)。利用PCR的方法進(jìn)行鑒定得到陽性轉(zhuǎn)化子，PCR的具體方法為:利用PCR的方法將引物
[0054]Fun30F-1:5’GTGTCGGTATCAATTTAGTAGC3’ (SEQ ID NO:9)
[0055]Ade2F:5’CAACACCAATAATTGATGAAACTG3’(SEQ ID NO:10)
[0056]利用Tag酶擴(kuò)增出1200bp大小的條帶，即為陽性轉(zhuǎn)化子。
[0057]實(shí)施例2白念珠菌CaFUN30基因的敲除菌株的構(gòu)建
[0058]為了更全面的研究CaFUN30在白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換中的調(diào)控功能，我們在白念珠菌中對CaFUN30基因進(jìn)行了敲除菌株的構(gòu)建。利用5-F0A將hisG-URA3_hisG片段中URA3環(huán)出的方法進(jìn)行基因的敲除，從而進(jìn)行篩選得到互補(bǔ)營養(yǎng)缺陷的陽性克隆。首先在CGD上查找到FUN30的上下游基因序列，設(shè)計(jì)引物利用PCR方法擴(kuò)增:
[0059]引物Fun30UF:5，ccc AAGCTTGTCTTTTATGGAACTTCC3’ (SEQ ID NO:3)
[0060]引物Fun30UR:5，ccgGGATCCTTGAATGAAAATAAGTAATACCAGC3’ (SEQ ID NO:4)
[0061]擴(kuò)增出上游同源臂533bp。
[0062]引物FUN30DF:5，cccGGTACCACMMTMGMATGTACACATTTGMGCTG3’ (SEQ ID NO:5)
[0063]引物FUN30DR:5，ccgGAATTCAATACTGTCAATCCACCACCACC3，(SEQ ID NO:6)
[0064]擴(kuò)增出下游同源臂366bp。
[0065]然后逐步把上游同源臂用Hind II1-BamH I酶切，下游同源臂用Kpn 1-EcoR I酶切,依次構(gòu)建到PMD18-T載體上。利用Bgl I1-BamH I將hisG-URA3_hisG從PCUB6載體上酶切回收，連接到BamH I單酶切的構(gòu)建好的載體上，然后進(jìn)行鑒定，測序，得到正確構(gòu)建的克隆。最后利用Hind III酶切質(zhì)粒成線性化，轉(zhuǎn)入白念珠菌JYCl (a/a型菌株)中進(jìn)行同源重組，使得目的片段異位整合到FUN30基因區(qū)域。通過PCR
[0066]Fun30UF-1:5’GCATTGTCTCAAATAATCAAAACG3，(SEQ ID NO:11)
[0067]CaURA3NR:5’GTTTATACCATCCAAATCAATTCC3’(SEQ ID NO:12)
[0068]擴(kuò)增出2kb大小的條帶即為陽性轉(zhuǎn)化子，然后再通過Southern的方法鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)鑒定正確的第一拷貝敲除的菌株在含5-F0A和尿苷的SD平板上培養(yǎng)讓hisG-URA3-hisG 片段中的 URA3 環(huán)出(Boeke et al.1984.Mol Gen Genet.197:345 - 346),篩選得到Ura-菌株。再次將線性化的敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入此Ura-菌株中，進(jìn)行第二拷貝的敲除。最后利用Southern方法進(jìn)行鑒定,得到fun30/fun30的敲除菌株。圖1A顯示了 CaFUN30基因敲除菌株的Southern blot鑒定策略，圖1B顯示為FUN30/fun30 Southern雜交分析鑒定的圖譜和圖1C顯示為fun30/fun30 Southern雜交分析鑒定的圖譜。
[0069]Southern分析方法:基因組DNA用Pvu II完全酶切，電泳完成后的瓊脂糖膠分別用變性液和中和液浸泡45min，尼龍膜用雙蒸水或5XSSC浸透，搭好轉(zhuǎn)膜平臺(tái)，膠與膜間用Parafilm封閉，加一個(gè)500g砝碼。以5XSSC為轉(zhuǎn)膜液轉(zhuǎn)移過夜，第二天漂洗晾干紫外交聯(lián)(C3程序即150MJ/cm2)。交聯(lián)后的膜裝入雜交管，加入5ml預(yù)雜交液(6XSSC，5Xdenhardt’ s Reagent,0.5% SDS, 100 μ g/ml 魚精 DNA)于 65°C預(yù)雜交 lh，探針在 100°C變性 5min，加入 150μ I (約 I / 3 所標(biāo)記的探針)65°C雜交 10_16h。0.1 X SSC, 0.1%SDS洗兩到三次，每次30min,取出膜，晾干,磷屏顯影5h。探針標(biāo)記用Thermo Scientific的North2South B1tin Random Prime Labeling Kit 試劑盒(貨號(hào) 17075),并按照其說明操作。將含25ng DNA的溶液于100° C加熱變性5_10min，置于冰浴中。在管中加入1ulheptanucleotide mix和變性的DNA模板,沸水浴5min。迅速將變性的DNA溶液置于干冰/乙醇混合物上，冷卻5min,再依次加入以下成分來準(zhǔn)備樣品溶液:10ul of5XdNTP mix,5ul of 10 X React1n Buffer, Iul Klenow fragment (Final Volume=50ul),輕輕振蕩混勻樣品，簡單離心將液體收集到管底。將混好后的EP管置于37°C60min;探針于100° C變性5min冰上冷卻后加入雜交體系中進(jìn)行雜交。
[0070]實(shí)施例3CaFUN30基因的過表達(dá)和缺失對白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換的影響
[0071]利用同源重組的方法對白念珠菌的CaFUN30基因進(jìn)行敲除，通過PCR方法以及Southern方法鑒定得到了 fun30/fun30的正確敲除菌株(圖1B，1C)。這也說明了 FUN30基因的敲除不會(huì)導(dǎo)致白念珠菌死亡。
[0072]為了證明FUN30基因在白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換方面的作用，我們進(jìn)行了一系列的形態(tài)轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)以及統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。將多種基因型的菌株從庫中劃到新鮮的YPD平板上，放于22°C條件下培養(yǎng)兩天，然后挑取大約一個(gè)Colony大小的菌稀釋于Iml ddH20,測0D_的值(0D_=0.1時(shí)，細(xì)胞的濃度是3 X106cell/ml )。然后進(jìn)行100倍的濃度梯度稀釋，取100-200ul細(xì)胞懸液(細(xì)胞總數(shù)在200-300個(gè)之間)涂于SD6.8+PhloxineB平板上，分別置于22°C空氣條件下、230C +5%C02條件下進(jìn)行培養(yǎng)5-7天，然后進(jìn)行形態(tài)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和拍照。
[0073]與野生型菌株(WT+V)相比，過表達(dá)FUN30基因的菌株(WT+FUN30)在22°C空氣條件，23°C，5%C02條件下均能明顯的促進(jìn)白菌向灰菌轉(zhuǎn)換的效率。這表明Fun30對白念珠菌的白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換具有調(diào)控作用。而fun30/fun30敲除菌株以及FUN30/fun30單拷貝敲除菌株與野生型菌株相比，在多種培養(yǎng)條件下，對白念珠菌的白-灰轉(zhuǎn)換效率有一定程度的降低(圖2和表1 )。通過DIC進(jìn)行形態(tài)觀察，從細(xì)胞的形態(tài)上也可以看出過表達(dá)FUN30能夠促進(jìn)白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換，這表明Fun30是一個(gè)白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的正調(diào)控因子。
[0074]表1顯示了統(tǒng)計(jì)意義上的CaFUN30對白念珠菌白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的功能
[0075]

【權(quán)利要求】
1.一種白念珠菌CaFUN30基因的用途，用于制備白念珠菌減毒株，或者用于制備或篩選白念珠菌治療藥物。
2.權(quán)利要求1所述的白念珠菌CaFUN30基因的用途，其特征在于，所述CaFUN30基因編碼的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如權(quán)利要求2所述的白念珠菌CaFUN30基因的用途，其特征在于，所述CaFUN30基因含有如SEQ ID NO:1所示的基因序列。
4.一種白念珠菌減毒株,為白念珠菌cafun30/cafun30缺失株,所述減毒株中CaFUN30基因不表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述的白念珠菌減毒株，其特征在于，所述白念珠菌Cafun30/Cafun30缺失株中，CaFUN30基因通過同源重組的方法敲除。
6.如權(quán)利要求4所述的白念珠菌減毒株，其特征在于，所述白念珠菌Cafun30/Cafun30缺失株與野生型白念珠菌相比，降低了白-灰形態(tài)轉(zhuǎn)換的效率。
7.如權(quán)利要求4-6任一權(quán)利要求所述的白念珠菌減毒株的構(gòu)建方法，包括如下步驟: O單拷貝缺失株的構(gòu)建:使用URA-BLAST敲除法，體外構(gòu)建敲除質(zhì)粒，所述敲除質(zhì)粒中含有與CaFUN30開放閱讀框同源的重組片段，并且該重組片段中含有HisG-URA3_HisG篩選片段；利用線性化的敲除質(zhì)粒通過同源重組的方法敲除白念珠菌染色體上的一個(gè)CaFUN30拷貝，獲得單 拷貝缺失菌株；經(jīng)鑒定正確的單拷貝缺失菌株通過URA3環(huán)出，篩選得到Ura-菌株； 2)雙拷貝缺失株的構(gòu)建:使用URA-BLAST敲除法，再次將線性化的敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入U(xiǎn)ra-菌株中，進(jìn)行第二拷貝的敲除，得到fun30/fun30的雙拷貝缺失菌株。
8.權(quán)利要求4-6任一權(quán)利要求所述白念珠菌減毒株在研究白念珠菌發(fā)育及毒性功能中的應(yīng)用，或者在制備或篩選白念珠菌治療藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/725GK104178429SQ201310192584
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月22日
【發(fā)明者】陳江野, 高寧, 聶鑫怡, 王華峰, 鄢明輝 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院