一株對(duì)啤酒發(fā)酵環(huán)境具有多種耐受性的啤酒酵母及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株經(jīng)過改良細(xì)胞壁組成而提高了對(duì)發(fā)酵環(huán)境的多種耐受性的Saccharomyces?carlsbergensis，已于2012年01月09日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.7114。該菌株具有改良的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)并獲得高濃度乙醇，高溫，高滲透壓耐受性，在高濃發(fā)酵中表現(xiàn)更高的發(fā)酵效率，發(fā)酵所得啤酒也更加潔白細(xì)膩。此菌株經(jīng)傳統(tǒng)紫外誘變篩選獲得，在啤酒行業(yè)中具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株對(duì)啤酒發(fā)酵環(huán)境具有多種耐受性的啤酒酵母及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株經(jīng)過改良細(xì)胞壁組成而提高了對(duì)發(fā)酵環(huán)境的多種耐受性的啤酒酵母，屬微生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]啤酒酵母在發(fā)酵過程中由于工藝操作和環(huán)境條件的變化，經(jīng)受著各種發(fā)酵環(huán)境因素的影響。從起始接種至充氣麥汁至最終發(fā)酵結(jié)束時(shí)收獲酵母泥，酵母細(xì)胞必須應(yīng)對(duì)原麥汁的高滲環(huán)境，乙醇的逐漸積累，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸匱乏等壓力。啤酒酵母對(duì)這些壓力的耐受性直接影響發(fā)酵周期及成品啤酒的質(zhì)量，進(jìn)而影響著最終的經(jīng)濟(jì)效益。采用高濃度發(fā)酵和后稀釋技術(shù)是提高企業(yè)發(fā)酵設(shè)備的產(chǎn)能和利用率的做有效手段，但在高濃度麥汁發(fā)酵過程中，酵母對(duì)發(fā)酵環(huán)境的耐受性顯得尤為重要。所以提高啤酒酵母發(fā)酵環(huán)境的多種耐受性對(duì)啤酒行業(yè)的發(fā)展意義重大。
[0003]在 國內(nèi)啤酒行業(yè)，有關(guān)酵母對(duì)發(fā)酵環(huán)境因素的耐受性的研究尚處于起步階段，而在國外已經(jīng)獲得一定的重視。酵母應(yīng)對(duì)發(fā)酵環(huán)境因素的影響是一個(gè)系統(tǒng)的反應(yīng)，稱為一般壓力應(yīng)對(duì)機(jī)制(GSR)。GSR被認(rèn)為是酵母的適應(yīng)環(huán)境的進(jìn)化結(jié)果，通常會(huì)引起約200個(gè)基因的上調(diào)及相應(yīng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加。國外一些研究者通過基因操作使得這些基因中的一部分在正常情況下過量表達(dá)，從而獲得了壓力耐受菌株并取得一定效果。然而工程菌株在食品行業(yè)存在爭議性，使得這種方法的應(yīng)用受到一定的限制。通過馴化獲得耐性菌株則有著周期長，抗性種類單一的劣勢(shì)。根據(jù)前人對(duì)酵母應(yīng)對(duì)發(fā)酵環(huán)境壓力的影響研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞壁在壓力應(yīng)對(duì)過程中也發(fā)揮著重要的作用。
[0004]啤酒酵母細(xì)胞壁是由甘露聚糖蛋白、β-1，6_葡聚糖、β-1，3-葡聚糖和幾丁質(zhì)等相互交鏈構(gòu)成的復(fù)雜的雙層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。內(nèi)層的β-1，3-葡聚糖和幾丁質(zhì)負(fù)責(zé)保持細(xì)胞壁的剛性，外層甘露糖蛋白通過β_1，6-葡聚糖連接到內(nèi)層則決定了細(xì)胞壁的透過性。這些組分協(xié)同起來保護(hù)細(xì)胞，使細(xì)胞在壓力條件下能繼續(xù)保持活力進(jìn)而高效的發(fā)酵麥汁。研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)對(duì)壓力時(shí)，細(xì)胞壁會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化:細(xì)胞壁變厚，甘露糖蛋白含量增加。這些變化使得細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變強(qiáng)壯，更有利于細(xì)胞的生存。關(guān)于酵母細(xì)胞壁的研究發(fā)現(xiàn)β-1，3-葡聚糖合成酶抑制劑抗性菌株的細(xì)胞壁組成會(huì)發(fā)生類似的變化。本方法采用傳統(tǒng)紫外誘變手段，以酵母細(xì)胞壁葡聚糖合成酶抑制劑-米卡芬凈抗性為篩選條件，再在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選獲得耐高滲透壓，高濃度乙醇，高溫的優(yōu)良啤酒酵母菌株。此方法相對(duì)簡單方便且有利于在生產(chǎn)中應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株對(duì)發(fā)酵環(huán)境具有多種耐受性的啤酒酵母菌MR1_2(Saccharomyces carlsbergensis),已于2013年01月09日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0.7114，保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所。[0006]所述酵母MR1-2細(xì)胞壁多糖組分甘露聚糖、β_葡聚糖和幾丁質(zhì)含量相比出發(fā)菌株分別增加了 32.6%、51.9%和30.7%。
[0007]所述酵母MR1-2的菌落形態(tài)，呈卵圓形，直徑約6.5μπι ;ΥΕΗ)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后長出約2mm直徑的圓形菌落；菌落呈乳白色，表面濕潤、粘稠，易被挑起。
[0008]所述酵母MR1-2的獲得方法是，將出發(fā)菌株在30W紫外燈距離30cm處照射20s，涂布35ng/ml米卡芬凈平板,挑取在35ng/ml米卡芬凈平板上長勢(shì)較好的菌落,在10%乙醇(v/v),35°C,lM NaCl等壓力條件下篩選，篩選在所有壓力條件下表現(xiàn)出生長優(yōu)勢(shì)的菌株啤酒酵母MR1-2。
[0009]所述多耐性啤酒酵母MR1-2應(yīng)用于高濃發(fā)酵表現(xiàn)出更高的發(fā)酵效率，啤酒泡沫更加潔白細(xì)膩。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1，啤酒酵母Y-1對(duì)米卡芬凈的敏感性柱形圖；
[0011]圖2，耐性菌株MR1-2與原菌Y-1在不同壓力條件下的生長情況；
[0012]圖3，耐性菌株MR1-2與原菌Y_1細(xì)胞壁主要多糖含量；
[0013]圖4，耐性菌株MR1-2與原菌Y_1細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量；
[0014]圖5，耐性菌株MR1-2與原菌Y_1高濃度麥汁發(fā)酵曲線。 【具體實(shí)施方式】
[0015]菌種:
[0016]I)出發(fā)菌株:啤酒酵母Y-1，已于1993年9月8日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏編號(hào)為CCTCC N0.M93049Y-12)
[0017]培養(yǎng)基:
[0018]YPD基本培養(yǎng)基:酵母提取粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂粉。
[0019]乙醇培養(yǎng)基:在基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加8%或10% (v/v)乙醇。
[0020]NaCl培養(yǎng)基:在基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加1.0M/L NaCl。
[0021]營養(yǎng)饑餓培養(yǎng)基:同基本培養(yǎng)基，細(xì)胞經(jīng)饑餓處理后在YPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行梯度生長。
[0022]實(shí)施例1對(duì)發(fā)酵環(huán)境具有多種耐受性啤酒酵母的獲得
[0023]將出發(fā)菌在含不同濃度米卡芬凈的YEH)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，如圖1所示，當(dāng)米卡芬凈濃度達(dá)到35ng/mL時(shí)，出發(fā)菌株不能生長,故選取35ng/mL作為篩選米卡芬凈抗性菌株的條件。
[0024]以江南大學(xué)生物工程學(xué)院保藏的一株啤酒酵母為出發(fā)菌株，在30W紫外燈距離30cm處照射20s后涂布35ng/ml米卡芬凈平板。挑選能在10%乙醇(v/v)、35°C、IM NaCl壓力條件下具有生長優(yōu)勢(shì)的酵母菌株。如圖2所示，MR1-2在所有壓力條件下表現(xiàn)出生長優(yōu)勢(shì)。
[0025]所得酵母呈卵圓形，直徑約6.5μπι ;YEH)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d后長出約2mm直徑的圓形菌落；菌落呈乳白色，表面濕潤、粘稠，易被挑起。[0026]實(shí)施例2酵母細(xì)胞壁多糖組分分析
[0027]將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的酵母細(xì)胞離心收集，取約IOOmg濕酵母細(xì)胞用去離子水洗滌3遍。將細(xì)胞重新懸浮于0.5mL10mM Tris-HCl (pH8.0)緩沖液并轉(zhuǎn)移至5mL具塞玻璃試管。添加0.5g的直徑400 μ m的干燥潔凈的玻璃珠，然后在漩渦混合儀上振蕩5個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)振蕩3min、冰浴3min。處理后的酵母細(xì)胞用去離子水洗滌3遍，收集沉淀即為酵母細(xì)胞壁，45°C真空干燥過夜即得干燥細(xì)胞壁。
[0028]稱取約IOmg干燥細(xì)胞壁加入150 μ L72%(w/w)硫酸在室溫下放置3h(間隔適當(dāng)振動(dòng)促進(jìn)酸解)。之后加入0.95mL純水稀釋并真空封管，封管后沸水浴4h即得多糖水解液。水解液用氫氧化鋇中和至中性，再經(jīng)過適當(dāng)稀釋過濾后，用高效離子色譜檢測(cè)單糖含量，進(jìn)一步計(jì)算得出細(xì)胞壁中應(yīng)的多糖含量。如圖3、圖4所示，相比于出發(fā)菌株，啤酒酵母MR1-2細(xì)胞壁甘露聚糖、葡聚糖和幾丁質(zhì)含量分別增加了 32.6%、51.9%和30.7%。
[0029]實(shí)施例3對(duì)發(fā)酵環(huán)境具有多種耐受性的啤酒酵母的高濃發(fā)酵性能測(cè)試
[0030]將經(jīng)擴(kuò)培得到的酵母泥按0.5% (w/v)的比例接種于含有300mL18oP的新鮮定型麥汁的3L三角瓶中，于上發(fā)酵栓15°C發(fā)酵，每天測(cè)量發(fā)酵裝置重量計(jì)算CO2失重，每隔2d采用比重瓶法測(cè)定發(fā)酵清液的濃度。如圖5所示，相比于出發(fā)菌株，啤酒酵母MR1-2表現(xiàn)出更高的發(fā)酵效率，所得啤 酒泡沫更潔白細(xì)膩。
【權(quán)利要求】
1.一株對(duì)啤酒發(fā)酵環(huán)境具有多種耐受:性的Saccharomyces carlsbergensis,于2012年01月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0.7114，保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所；能夠耐受35ng/mL米卡芬凈、10%的乙醇、35°C、1M NaCl和無菌水中饑餓培養(yǎng)24h。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Saccharomycescarlsbergensis,相比于出發(fā)菌株細(xì)胞壁組分中甘露聚糖、β -葡聚糖和幾丁質(zhì)的含量分別增加了 32.6%、51.9%和30.7%。
3.一種獲得權(quán)利要求1所述Saccharomyces carlsbergensis的方法,其特征在于,包括如下步驟: 1)將出發(fā)菌株在30W紫外燈距離30cm處照射20s，涂布35ng/ml米卡芬凈平板； 2)挑取在35ng/ml米卡芬凈平板上長勢(shì)較好的菌落，在10%乙醇(v/v)、35°C和IMNaCl等壓力條件下篩選，篩選表 現(xiàn)出在所有壓力條件下具有生長優(yōu)勢(shì)的菌株啤酒酵母MR1-2。
4.一種權(quán)利要求1所述Saccharomyces carlsbergensis在啤酒高濃發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于，發(fā)酵效率高于出發(fā)菌株，啤酒泡沫更潔白細(xì)膩。
【文檔編號(hào)】C12C11/00GK103981109SQ201310158304
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月2日
【發(fā)明者】李崎, 王金晶, 李欣兒, 李永仙, 劉春鳳, 朱林江, 鄭飛云, 顧國賢 申請(qǐng)人:江南大學(xué)