專(zhuān)利名稱(chēng)：一種測(cè)量端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種測(cè)量端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法。
背景技術(shù)：
端粒是核蛋白結(jié)構(gòu)，冠在染色體末端。它是由長(zhǎng)六聚體序列(TTAGGG)組成。完整的端粒結(jié)構(gòu)和它重復(fù)的六聚體序列保護(hù)染色體末端的退化，對(duì)維持基因組的穩(wěn)定起到了至關(guān)重要的作用。端粒的六聚體序列(TTAGGG)的數(shù)量會(huì)隨著細(xì)胞的每一次分裂而減少，導(dǎo)致在生物體的整個(gè)生命過(guò)程中，端粒長(zhǎng)度在不停地縮短。端粒長(zhǎng)度的縮短會(huì)造成端粒末端的融合，染色體的不穩(wěn)定，因而成為包括肺癌，乳腺癌，結(jié)腸癌，前列腺癌，白血病等多種癌癥的原因。端粒長(zhǎng)度的縮短也是導(dǎo)致衰老的一個(gè)重要因素。研究表明包括心理和生理上的壓力，抽煙，肥胖等都可加速端粒長(zhǎng)度的縮短。測(cè)量端粒的長(zhǎng)度和監(jiān)測(cè)端粒長(zhǎng)度的動(dòng)態(tài)變化在健康群體和疾病的發(fā)展上越來(lái)越引起人們的關(guān)注。隨著干細(xì)胞開(kāi)始廣泛用于臨床實(shí)踐，越來(lái)越多的研究表明端粒的長(zhǎng)度還是用來(lái)監(jiān)測(cè)干細(xì)胞質(zhì)量，預(yù)測(cè)干細(xì)胞在體內(nèi)成活時(shí)間的一個(gè)重要指標(biāo)之一。目前有很多方法可以用來(lái)測(cè)量端粒的長(zhǎng)短，例如(I)通過(guò)DNA與端粒序列probe的雜交，利用Southern blot技術(shù)進(jìn)行末端限制性片段分析(Terminal RestrictionFragment (TRF) analysis) ; (2)流式細(xì)胞儀法；(3)原位雜交；(4)實(shí)時(shí)定量PCR等。除了TRF方法，其他方法都有一個(gè)同樣的弊病——只能測(cè)量端粒的相對(duì)長(zhǎng)度，而TRF方法需要較大量的DNA。端粒絕對(duì)長(zhǎng)度是先建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，端粒基于此計(jì)算出；相對(duì)長(zhǎng)度是通過(guò)與對(duì)照的基因如看家基因的表達(dá)量相比較而得到的結(jié)果。目前關(guān)于端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的測(cè)量方法未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的:本發(fā) 明的目的是提供一種準(zhǔn)確、省時(shí)、DNA底物消耗少、重復(fù)性強(qiáng)的測(cè)量端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法。技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的一種測(cè)量端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法包括:(I)從血樣中提取基因組DNA，用分光光度儀測(cè)量DNA濃度，稀釋到20ng，于4°C保存?zhèn)溆茫?2)建立端粒長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線:將具有14個(gè)重復(fù)序列TTAGGG的84mer oligo按濃度梯度稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)qPCR反應(yīng)獲得端粒長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，
對(duì)應(yīng)不_濃度的端粒K =iHil￡Lx S4(I),式(I)中，cT表示84mer oligo的摩爾濃度，MQlig。表示84mer oligo的分子量；
(3)建立二倍體基因組拷貝數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線:將單拷貝基因36B4按與所述步驟(2)相同的濃度梯度稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)qPCR反應(yīng)獲得
二倍體基因組拷貝數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，
權(quán)利要求
1.一種測(cè)量端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法，其特征在于包括: (1)從血樣中提取基因組DNA，用分光光度儀測(cè)量DNA濃度，稀釋至20ng，于4°C保存?zhèn)溆茫? (2)建立端粒長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線: 將具有14個(gè)重復(fù)序列TTAGGG的84mer oligo按濃度梯度稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)qPCR反應(yīng)獲得端粒長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)量端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法，其特征在于: 所述qPCR反應(yīng)體系為:
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種測(cè)量端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法，其特征在于: 所述上游引物包括分別用于端粒和36B4的qPCR的上游引物tel Fv-Cggtttgtttgggtttgggtttgggtttgggtttgggtt-S' ^ 36B4F:5’ -CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’ 所述下游引物包括分別用于端粒和36B4的qPCR的下游引物tel R:5’-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT-3’，或 36B4R:5’-CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種測(cè)量端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法，其特征在于:所有PCR反應(yīng)底物通過(guò)添加PBR322質(zhì)粒DNA使其保持在20ng。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)量端粒絕對(duì)長(zhǎng)度的方法，通過(guò)應(yīng)用oligomer standard可以測(cè)量出端粒的絕對(duì)長(zhǎng)度，而不是相對(duì)長(zhǎng)度。這是與已發(fā)表的實(shí)時(shí)定量PCR方法相比最大的不同。本發(fā)明的測(cè)量方法可重復(fù)性強(qiáng)，所需的DNA底物少，省時(shí)準(zhǔn)確，更適用于臨床檢測(cè)端粒長(zhǎng)度，監(jiān)測(cè)它的動(dòng)態(tài)變化，達(dá)到預(yù)測(cè)疾病發(fā)展和衰老的指標(biāo)之一?？蛇M(jìn)一步用于對(duì)植入前胚胎和干細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行研究。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103233071SQ20131015270
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者白麗君, 金星亮 申請(qǐng)人:南京優(yōu)而生物科技發(fā)展有限公司