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一種用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子及其制備和應(yīng)用方法

文檔序號(hào):424134閱讀:593來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):一種用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子及其制備和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域,涉及轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因質(zhì)粒分子pVZ的構(gòu)建及其在轉(zhuǎn)基因玉米定量檢測(cè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
截至2011年,全球轉(zhuǎn)基因種植面積已達(dá)到1.6億公頃,其中轉(zhuǎn)基因玉米種植面積居第一位。作為我國(guó)最重要的糧食作物之一,國(guó)內(nèi)轉(zhuǎn)基因玉米研發(fā)工作進(jìn)展也較為迅速,目前有多個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米優(yōu)良品系進(jìn)入環(huán)境釋放階段,申請(qǐng)商業(yè)化種植,其中轉(zhuǎn)植酸酶玉米已經(jīng)獲得安全評(píng)價(jià)證書(shū)。轉(zhuǎn)基因作物迅猛發(fā)展的同時(shí),也伴隨著人們對(duì)其環(huán)境安全和食用安全的關(guān)注和質(zhì)疑。研究、制定轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),對(duì)于加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因作物安全管理,防止轉(zhuǎn)基因作物未經(jīng)安全批準(zhǔn)進(jìn)入生產(chǎn)流通環(huán)節(jié);保障轉(zhuǎn)基因生物安全和人類(lèi)健康,保護(hù)消費(fèi)者利益;消除公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物安全性的疑慮,營(yíng)造良好的轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化氛圍具有重要意義。質(zhì)粒分子( Plasmid Molecule)作為一種新的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有容易獲得、使用方便、純度易控制和均勻性好等優(yōu)點(diǎn),被越來(lái)越多的應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測(cè)中。研究、構(gòu)建轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米陽(yáng)性質(zhì)粒分子,對(duì)于加強(qiáng)該品種的安全管理,保護(hù)消費(fèi)者利益,消除公眾對(duì)于轉(zhuǎn)基因作物安全性的疑慮,營(yíng)造良好的轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)化氛圍具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子及其制備和應(yīng)用方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子,以pMD19-T為載體,通過(guò)連接酶連接PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括含轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb特異性序列。該質(zhì)粒分子的特異性序列如下:GCGAAGAGCGTGACCAAGAACGACGTGGACGGCTTCGAGTTCTACCTGAACACCTTCCACGACGTGATGGTGGGCAACAACCTGTTCGGCCGCAGCGCCCTGAAGACCGCCAGCGAGCTGATCACCAAGGAGAACGTGAAGACCAGCGGCAGCGAGGTGGGCAACGTGTACAACTTCCTGATCGTGCTGACCGCCCTGCAGGCCCAGGCCTTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTGATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAACCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT,如 SEQ ID N0.1 所示。所述的用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子的制備方法,包括步驟如下:(1)根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)引物,弓丨物序列如下:
C-Vip3Aa20-lF:5’ -GCGAAGAGCGTGACCAAGA-3’,SEQ ID N0.2 所示,C-Vip3Aa20-2R:5,-GCGGGCTCTGGCTTCACAGGTGGTCAGGGTCAGGAA-3,,如 SEQ IDN0.3所示,C-zSSIIb-lF:5,-TTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGC-3,,SEQ ID N0.4 所示,C-zSSIIb-2R:5’ -ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3',SEQ ID N0.5 所示;(2)用引物 C-Vip3Aa20-lF/C-Vip3Aa20-2R 和 C-zSSIIb-lF/C-zSSIIb-2R 分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得含轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20轉(zhuǎn)化體特異性基因序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb特異性序列的DNA片段;回收這兩個(gè)目的片段,以此為模板采用引物C-Vip3Aa20-lF/C-zSSI Ib-2R 進(jìn)行重疊 PCR 擴(kuò)增;(3 )將得到的PCR產(chǎn)物回收后通過(guò)連接酶連接到PMD19-T載體上,連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α,將得到的克隆產(chǎn)物大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒得到質(zhì)粒分子pVZ。上述步驟(2)所述的PCR擴(kuò)增具體步驟為:以C-Vip3Aa20-lF/C-Vip3Aa20_2R和C-zSSIIb-lF/C-zSSIIb_2R為上、下游引物,在Premix Ex Taq(Takara)擴(kuò)增體系中,加入轉(zhuǎn)基因玉米MIR162模板DNA,先95°C擴(kuò)增5min,再95°C擴(kuò)增30s,再58°C擴(kuò)增30s,然后72°C擴(kuò)增30s,這樣進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后在72°C擴(kuò)增7min。重疊PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序如下:擴(kuò)增體系為Premix rTaq (Takara) 15 μ L,上、下游引物(10 μ mol/L)各1.5μ ,回收的目的片段2 μ L,加水補(bǔ)足至30 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?95°C 5min ;95°C 30s, 58°C 30s, 72°C 45s,35 個(gè)循環(huán);72°C 7min。所述的質(zhì)粒分子pVZ作為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品的替代品在SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)基因玉米MIR162成分中的應(yīng)用,具體應(yīng)用方法為:
(1)建立肌1 162基因的5¥81 6代611 I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):先將質(zhì)粒分子pVZ進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)缓笙蚋飨♂屢褐屑尤隡IR162基因特異性引物,以及zSSIIb基因的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物,進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增后,測(cè)定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值,該Ct值與拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系,據(jù)此繪制MIR162的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn);(2)提取待檢測(cè)樣品基因組DNA,得基因組DNA提取液,然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因特異性引物,以及zSSIIb基因的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物,進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增后,測(cè)定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值,然后根據(jù)上述繪制的MIR162基因的SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算出相應(yīng)的拷貝數(shù),則轉(zhuǎn)基因玉米MIR162基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比,即為待檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。上述步驟(1)、(2)中所述的MIR162基因特異性引物序列(見(jiàn)專(zhuān)利號(hào)201210052534的中國(guó)專(zhuān)利)如下:Vip3Aa20-F:5’ -CTTCGAGTTCTACCTGAA-3’,如 SEQ ID N0.7,Vip3Aa20-R:5,-CACGATCAGGAAGTTGTA-3',如 SEQ ID N0.8。
步驟(I)、(2)中所述的zSSIIb引物序列(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn))如下:zSSIIb-F:5,-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3,,如 SEQ ID N0.9,zSSIIb-R:5,-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3,,如 SEQ ID N0.10。步驟(I)、(2)中所述的擴(kuò)增條件均為:擴(kuò)增反應(yīng)體積為20μ L,2XPremix ExTaq (Rox) 10 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forward primer0.4 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Reverseprimer0.4 μ L,ddH208.2 μ L, DNA 模板 I μ L,擴(kuò)增反應(yīng)條件:95°C IOmin 預(yù)變性;95°C 15s,60°C 30s,在60°C收集熒光信號(hào),共計(jì)40個(gè)循環(huán)。所述的質(zhì)粒分子作為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品的替代品在TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)基因玉米MIR162成分中的應(yīng)用,應(yīng)用方法如下:(I)建立轉(zhuǎn)基因 玉米MIR162的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn): ①對(duì)質(zhì)粒分子pVZ進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)缓笙蚋飨♂屢褐屑尤朕D(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性引物和熒光標(biāo)記探針,以及zSSIIb基因的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針,進(jìn)行擴(kuò)增;②擴(kuò)增后,測(cè)定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值,該Ct值與拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系,據(jù)此繪制轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn);(2)提取待檢測(cè)樣品基因組DNA,得基因組DNA提取液,然后向基因組DNA提取液中加入轉(zhuǎn)基因玉米MIR162基因特異性引物和熒光標(biāo)記探針,以及zSSIIb基因的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針,進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增后,測(cè)定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值,然后根據(jù)上述繪制的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算出相應(yīng)的拷貝數(shù),則轉(zhuǎn)基因玉米MIR162拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比,即為待檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。上述步驟(I)和(2)中,zSSIIb基因的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針如下:zSSIIb-lF:5,-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3,,SEQ ID N0.9 所示,zSSIIb-2R:5,-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3,,SEQ ID N0.10 所示,zSSIIb-P:FAM-5,-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3,-TAMRA, SEQ ID N0.6 所示;轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性引物和熒光標(biāo)記探針序列(專(zhuān)利號(hào):201210052534的中國(guó)專(zhuān)利)如下:Vip3Aa20-F:5,-CTTCGAGTTCTACCTGAA-3,,如 SEQ ID N0.7,Vip3Aa20-R:5,-CACGATCAGGAAGTTGTA-3',如 SEQ ID N0.8,Vip3Aa20-P:FAM-5,-CGCTGGTCTTCACGTTCTCCT-3,-Eclipse,如 SEQ ID N0.11。步驟(I)和(2)中,所述的擴(kuò)增均為擴(kuò)增的參數(shù)如下:擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μ L, 2 XPremix Ex Taq (Rox) 12.5 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forward primer I μ L,濃度為10 μ mol/L 的 Reverse primer I μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 TaqMan probe0.5 μ L, ddH204 μ L,DNA模板I μ L.擴(kuò)增反應(yīng)條件:95°C IOmin預(yù)變性;95°C 15s,60°C 30s,在60°C收集熒光信號(hào),共計(jì)40個(gè)循環(huán)。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下:本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒分子pVZ可作為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品的替代品用于SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR和TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)玉米及其相關(guān)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量,其適用性強(qiáng),穩(wěn)定性好,具有極高的應(yīng)用價(jià)值與市場(chǎng)前景。


圖1為實(shí)施例1中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖2為實(shí)施例1中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖3為實(shí)施例2中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。圖4為實(shí)施例2中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子的制備方法,包括步驟如下:(I)根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)引物與探針,引物與探針序列如下: C-Vip3Aa20-lF:5,-GCGAAGAGCGTGACCAAGA-3',SEQ ID N0.2 所示,C-Vip3Aa20-2R:5’-GCGGGCTCTGGCTTCACAGGTGGTCAGGGTCAGGAA-3’ , SEQ ID N0.3所示,C-zSSIIb-lF:5,-TTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGC-3,,SEQ ID N0.4 所示,C-zSSIIb-2R:5,-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3',SEQ ID N0.5 所示;(2)用引物為 C-Vip3Aa20-lF/C-Vip3Aa20-2R 和 C-zSSIIb-lF/C-zSSIIb_2R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為 Premix Ex Taq (Takara) 20 μ L,上、下游引物(10 μ mol/L)各 2.5yL,轉(zhuǎn)基因玉米MIR162模板DNA(50ng/y L)2y L,加水補(bǔ)足至50μ L。反應(yīng)程序?yàn)?95°C 5min ;95°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s,35個(gè)循環(huán);72°C 7min。重疊PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序如下:擴(kuò)增體系為Premix rTaq (Takara) 15 μ L,上、下游引物(10 μ mol/L)各1.5μ ,回收的目的片段2 μ L,加水補(bǔ)足至30 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)?95°C 5min ;95°C 30s, 58°C 30s, 72°C 45s,35 個(gè)循環(huán);72°C 7min。(3)將兩個(gè)目的片段產(chǎn)物回收,以此為模板采用弓I物C-Vip3Aa20-lF/C-zSSIIb-2R進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增,得到的PCR產(chǎn)物回收后通過(guò)連接酶連接到pMD19-T載體(2692bp)上。連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ci。將得到的克隆產(chǎn)物大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,采用凝膠電泳法鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證。實(shí)施例1質(zhì)粒分子pVZ在轉(zhuǎn)基因玉米MIR162SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中的應(yīng)用將質(zhì)粒分子pVZ按5倍倍比分別稀釋至25000、5000、1000、200和40copies/μ L.每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù),檢測(cè)擴(kuò)增的重復(fù)性。引物和探針由大連Takara公司合成,稀釋成10 μ mol/L備用。合成的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性引物序列如下:Vip3Aa20-F:5,-CTTCGAGTTCTACCTGAA-3,,如 SEQ ID N0.7,
Vip3Aa20-R: 5’ -CACGATCAGGAAGTTGTA-3',如 SEQ ID N0.8 ;玉米內(nèi)標(biāo)引物與探針(zSSIIb)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物,其序列如下:zSSIIb-F:5,-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3,,如 SEQ ID N0.9,zSSIIb-R:5,-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3,,如 SEQ ID N0.10 ;擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μ L,擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μ L, 2 XPremix Ex Taq (Rox) 10 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forward primer0.4 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Reverseprimer0.4 μ L, ddH208.2 μ L, DNA 模板 I μ L。擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 °C IOmin 預(yù)變性;950C 15s, 50°C 30s, 72°C 30s,在72°C收集熒光信號(hào),共計(jì)40循環(huán)。每個(gè)試樣重復(fù)3次,同時(shí)設(shè)立無(wú)菌雙蒸水(ddH20,空白)和非轉(zhuǎn)基因樣品(鄭單958,陰性)對(duì)照。結(jié)果:通過(guò)對(duì)不同質(zhì)粒分子pVZ拷貝數(shù)為25000、5000、1000、200和40的DNA進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),縱坐標(biāo)為Ct,橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的線(xiàn)性計(jì)算公式,通過(guò)對(duì)不同轉(zhuǎn)基因含量的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品(3%,1%, 0.5%, 0.1%)、陽(yáng)性樣品、陰性樣品及空白對(duì)照的測(cè)定,將樣品的Ct值代入公式,即可得到待測(cè)樣品轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。對(duì)玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的特異性引物對(duì)同一組標(biāo)準(zhǔn)品DNA和不同百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米DNA進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,分別得至IJ PCR擴(kuò)增曲線(xiàn),并由系統(tǒng)軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示,該曲線(xiàn)的斜率為-3.314系數(shù)R2為0.998,轉(zhuǎn)基因玉米MIR162基因特異性引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖2所示,該曲線(xiàn)的斜率為-3.417,相關(guān)系數(shù)R2為0.999,兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)均小于0.17,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于0.33%,因此根據(jù)未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。根據(jù)公式:樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量=(Vip3Aa20基因拷貝數(shù)/內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb拷貝數(shù))X100%可以計(jì)算出待測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量為3%、1%、0.5%的混合樣品的定量結(jié)果為3.09%,0.87%和0.58%,百分偏差分別為3%、13%和16%,三次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)均小于0.101,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于11.6% ;上述定量結(jié)果準(zhǔn)確度和精確度較高,均符合歐盟的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)施例2質(zhì)粒分子pVZ2在轉(zhuǎn)基因玉米MIR162TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)中的應(yīng)用將質(zhì)粒分子pVZ按5倍倍比分別稀釋至25000、5000、1000、200和40copies/μ L.每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù),檢測(cè)擴(kuò)增的重復(fù)性。引物和探針由大連Takara公司合成,稀釋成10 μ mol/L備用。合成的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性引物與探針序列如下:Vip3Aa20-F:5,-CTTCGAGTTCTACCTGAA-3,,如 SEQ ID N0.7,Vip3Aa20-R:5,-CACGATCAGGAAGTTGTA-3',如 SEQ ID N0.8,Vip3Aa20-P:FAM-5,-CGCTGGTCTTCACGTTCTCCT-3,-Eclipse,如 SEQ ID N0.11 ;玉米內(nèi)標(biāo)引物與探針(zSSIIb)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物與探針,其序列如下:zSSIIb-F:5,-CGGTGGATGCTAAGGCTGA TG-3,,SEQ ID N0.9 所示,zSSIIb-R:5,-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3,,SEQ ID N0.10 所示,
zSSIIb-P:FAM-5’ -TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-3' -TAMRA, SEQ ID N0.6 所示;擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μ L,擴(kuò)增反應(yīng)體積為20 μ L, 2 X Premix Ex Taq (Rox) 12.5μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forward primerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Reverse primerl μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 TaqMan probe0.5 μ L, ddH204 μ L, DNA 模板 I μ L.擴(kuò)增反應(yīng)條件:95°C IOmin預(yù)變性;95°C 15s, 60°C 30s,在60°C收集熒光信號(hào),共計(jì)40個(gè)循環(huán).每個(gè)試樣重復(fù)3次,同時(shí)設(shè)立無(wú)菌雙蒸水(ddH20,空白)和非轉(zhuǎn)基因樣品對(duì)照。結(jié)果:通過(guò)對(duì)不同質(zhì)粒分子pVZ拷貝數(shù)為25000、5000、1000、200和40的DNA進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,計(jì)算機(jī)軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),縱坐標(biāo)為Ct,橫坐標(biāo)為起始拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所得的線(xiàn)性計(jì)算公式,通過(guò)對(duì)不同轉(zhuǎn)基因含量的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品(3%,1%, 0.5%, 0.1%)、陽(yáng)性樣品、陰性樣品及空白對(duì)照的測(cè)定,將樣品的Ct值代入公式,即可得到待測(cè)樣品轉(zhuǎn)基因成分的百分含量。對(duì)玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb和轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的基因特異性引物對(duì)同一組標(biāo)準(zhǔn)品DNA和不同百分含量的轉(zhuǎn)基因玉米DNA進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增,分別得到PCR擴(kuò)增曲線(xiàn),并由系統(tǒng)軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖3所示,該曲線(xiàn)的斜率為-3.384系數(shù)R2為0.997,轉(zhuǎn)基因玉米MIR162基因特異性引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖4所示,該曲線(xiàn)的斜率為-3.522,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 ;兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)均小于0.11,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于0.31%,因此根據(jù)未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。根據(jù)公式:樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量=(Vip3Aa20基因拷貝數(shù)/內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb拷貝數(shù))X100%可以計(jì)算出待測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量為3%、1%、0.5%的混合樣品的定量結(jié)果為3.20%、1.13%和0.47%,百分偏差分別為6.7%、13%和6%,三次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)均小于0.178,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于12.6% ;上述定量結(jié)果準(zhǔn)確度和精確度較 高,均符合歐盟的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。以上結(jié)果可以證明,本發(fā)明為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品提供了適用性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的陽(yáng)性質(zhì)粒分子替代品。為轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)提供了一種強(qiáng)有力的技術(shù)支撐,為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的控制提供了必要的手段。
權(quán)利要求
1.一種用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子,其特征是,以PMD19-T為載體,通過(guò)連接酶連接PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括含轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb特異性序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子,其特征是,所述的含轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb特異性序列為:GCGAAGAGCGTGACCAAGAACGACGTGGACGGCTTCGAGTTCTACCTGAACACCTTCCACGACGTGATGGTGGGCAACAACCTGTTCGGCCGCAGCGCCCTGAAGACCGCCAGCGAGCTGATCACCAAGGAGAACGTGAAGACCAGCGGCAGCGAGGTGGGCAACGTGTACAACTTCCTGATCGTGCTGACCGCCCTGCAGGCCCAGGCCTTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGCAGGCCATCGCTGAACCGGTGGATGCTAAGGCTGATGCAGCTCCGGCTACAGATGCGGCGGCGAGTGCTCCTTATGACAGGGAGGATAATGAACCTGGCCCTTTGGCTGGGCCTAATGTGATGAACGTCGTCGT。
3.權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子的制備方法,其特征是,包括步驟如下: (I)根據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)引物與探針,引物與探針序列如下:C-Vip3Aa20-lF:5’-GCGAAGAGCGTGACCAAGA-3’C-Vip3Aa20-2R:5’-GCGGGCTCTGGCTTCACAGGTGGTCAGGGTCAGGAA-3’ C-zSSIIb-lF:5’-TTCCTGACCCTGACCACCTGTGAAGCCAGAGCCCGC-3’C-zSSIIb-2R:5’-ACGACGACGTTCATCACATTAGG-3’ ;(2 )用引物 C-Vip3Aa20-lF/C-Vip3Aa20-2R 和 C-zSSIIb-lF/C-zSSIIb_2R 分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增獲得含轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb特異性序列的DNA片段;回收這兩個(gè)目的片段,以此為模板采用引物C-Vip3Aa20-lF/C-zSSIIb-2R進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增; (3 )將得到的PCR產(chǎn)物回收后通過(guò)連接酶連接到pMD19-T載體上,連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α,將得到的克隆產(chǎn)物大量培養(yǎng)后提取質(zhì)粒得到質(zhì)粒分子pVZ。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的所述的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子的制備方法,其特征是,步驟(2)所述的PCR擴(kuò)增具體步驟為:以C-Vip3Aa20-lF/C-Vip3Aa20-2R和 C-zSSIIb-lF/C-zSSIIb-2R 為上、下游引物,在 Premix Ex Taq(Takara)擴(kuò)增體系中,力口入轉(zhuǎn)基因玉米MIR162模板DNA,先95°C擴(kuò)增5min,再95°C擴(kuò)增30s,再58°C擴(kuò)增30s,然后72°C擴(kuò)增30s,這樣進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后在72°C擴(kuò)增7min。
5.權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒分子作為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品的替代品在SYBRGreenI實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)基因玉米MIR162成分中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求5所述的應(yīng)用方法,其特征是,步驟為: (I)建立MIR162基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn): 先將質(zhì)粒分子PVZ進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)缓笙蚋飨♂屢褐屑尤隡IR162基因特異性引物,以及zSSIIb基因的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物,進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增后,測(cè)定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值,該Ct值與拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系,據(jù)此繪制MIR162的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn); (2)提取待檢測(cè)樣品基因組DNA,得基因組DNA提取液,然后向基因組DNA提取液中加入MIR162基因特異性引物,以及zSSIIb基因的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物,進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增后,測(cè)定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值,然后根據(jù)上述繪制的MIR162基因的SYBR GreenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算出相應(yīng)的拷貝數(shù),則轉(zhuǎn)基因玉米MIR162基因的拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比,即為待檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法,其特征是,步驟(I)、(2)中所述的MIR162基因特異性引物序列如下:Vip3Aa20-F:5’-CTTCGAGTTCTACCTGAA-3’Vip3Aa20-R:5’-CACGATCAGGAAGTTGTA-3’ ; 步驟(I)、(2)中所述的zSSIIb引物序列如下: zSSIIb-F:5’-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3’ zSSIIb-R:5’-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3’ 。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法,其特征是,步驟(1)、(2)中所述的擴(kuò)增條件均為:擴(kuò)增反應(yīng)體積為 20 μ L, 2XPremix Ex Taq(Rox) 10 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Forwardprimer0.4 μ L,濃度為 10 μ mol/L 的 Reverse primer0.4 μ L, ddH208.2 μ L, DNA 模板 I μ L,擴(kuò)增反應(yīng)條件:95°C IOmin預(yù)變性;95°C 15s,60°C 30s,在60°C收集熒光信號(hào),共計(jì)40個(gè)循環(huán)。
9.權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒分子作為轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)品的替代品在TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)玉米及其相關(guān)產(chǎn)品是否含有轉(zhuǎn)基因玉米MIR162成分中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求9所述的應(yīng)用方法,其特征是,步驟為: (1)建立轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn): ①對(duì)質(zhì)粒分子PVZ進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)缓笙蚋飨♂屢褐屑尤朕D(zhuǎn)基因玉米MIR162轉(zhuǎn)化體特異性引物和熒光標(biāo)記探針,以及zSSIIb基因的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針,進(jìn)行擴(kuò)增; ②擴(kuò)增后,測(cè)定各稀釋液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值,該Ct值與拷貝數(shù)的自然對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系,據(jù)此繪制轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn); (2)提取待檢測(cè)樣品基因組DNA,得基因組DNA提取液,然后向基因組DNA提取液中加入轉(zhuǎn)基因玉米MIR162基因特異性引物和熒光標(biāo)記探針,以及zSSIIb基因的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物和熒光標(biāo)記探針,進(jìn)行擴(kuò)增;擴(kuò)增后,測(cè)定基因組DNA提取液中相關(guān)熒光標(biāo)記物的Ct值,然后根據(jù)上述繪制的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和zSSIIb基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算出相應(yīng)的拷貝數(shù),則轉(zhuǎn)基因玉米 MIR162拷貝數(shù)與玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb基因的拷貝數(shù)之比,即為待檢測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162的百分含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米基因特異性檢測(cè)的質(zhì)粒分子及其制備和應(yīng)用方法,質(zhì)粒分子以pMD19-T為載體,通過(guò)連接酶連接PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物包括含轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb特異性序列;其構(gòu)建需先設(shè)計(jì)引物,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得含轉(zhuǎn)基因玉米MIR162Vip3Aa20基因特異性序列和玉米內(nèi)標(biāo)基因zSSIIb特異性序列的DNA片段,將得到的PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α培養(yǎng)后提取質(zhì)粒得到質(zhì)粒分子pVZ。本發(fā)明構(gòu)建的質(zhì)粒分子pVZ可用于檢測(cè)玉米及其相關(guān)產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因玉米MIR162含量,其適用性強(qiáng),穩(wěn)定性好,具有極高的應(yīng)用價(jià)值與市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103205498SQ20131012238
公開(kāi)日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2013年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月9日
發(fā)明者孫紅煒, 楊淑珂, 張廣遠(yuǎn), 高瑞, 徐曉輝, 李凡, 路興波 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
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