專(zhuān)利名稱：熒光定量pcr檢測(cè)醋醅中巴斯德醋酸桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于固態(tài)釀醋微生物群落中特定種屬微生物的定量研究。
背景技術(shù)：
我國(guó)食醋的生產(chǎn)歷史悠久，根據(jù)產(chǎn)地、品種的不同，食醋中醋酸含量也不盡相同。例如山西老陳醋的酸味較濃，而鎮(zhèn)江香醋的酸味酸中帶柔，酸而不烈。各地釀醋工藝、口感等的不同，造就了山西老陳醋、鎮(zhèn)江恒順香醋、福建永春老醋、保寧醋“四大名醋”。但眾多的食醋生產(chǎn)廠家的發(fā)酵過(guò)程都以傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)為主，工藝可控性較差，并且產(chǎn)品品質(zhì)存在批次差異，尤其是風(fēng)味差異較大。這主要是由于釀造過(guò)程中微生物復(fù)雜多樣，對(duì)醋醅發(fā)酵過(guò)程中的微生物作用機(jī)制不清楚。中國(guó)食醋的釀造工藝是多菌種混合發(fā)酵工藝，通過(guò)多種微生物的代謝作用產(chǎn)生風(fēng)味飽滿、酸味柔和的食醋。食醋的生產(chǎn)中有兩個(gè)主要的發(fā)酵階段:酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵。在酒精發(fā)酵階段，淀粉質(zhì)原料如糯米、高粱等經(jīng)過(guò)霉菌和酵母菌的一系列代謝，最終生成酒精；而在 醋酸發(fā)酵階段是包括醋酸菌、乳酸菌在內(nèi)的眾多細(xì)菌起主要的作用，該階段是決定食醋風(fēng)味和品質(zhì)的關(guān)鍵步驟。其中包括巴斯德醋酸菌在內(nèi)的醋酸菌是醋酸發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)微生物。熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了 DNA模板的定量，而且具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、高通量、全封閉反應(yīng)、定量準(zhǔn)確、速度快及自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。本發(fā)明成功運(yùn)用了熒光定量PCR技術(shù)對(duì)醋醅中巴斯德醋酸桿菌進(jìn)行定量，并得到其生物量在食醋發(fā)酵過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有食醋固態(tài)釀造分析技術(shù)的不足，提供了一種分子生態(tài)技術(shù)用于定量檢測(cè)固態(tài)釀造食醋發(fā)酵過(guò)程中巴斯德醋酸桿菌Uaiohcterpasteurianus)的動(dòng)態(tài)變化，以指導(dǎo)實(shí)踐。本發(fā)明是通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明針對(duì)醋醅群落中的巴斯德醋酸桿菌設(shè)計(jì)特異性引物，提取分離純化得到的巴斯德醋酸桿菌的基因組，然后利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR得到特異性目的片段，再將目的片段與pMD19-T Vector連接，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得高濃度質(zhì)粒，然將此高濃度質(zhì)粒做10倍比稀釋?zhuān)鳛闊晒舛縋CR的標(biāo)準(zhǔn)品。利用液氮研磨、酶法和高鹽結(jié)合的方法提取發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)醋醅群落的總DNA作為待測(cè)樣品，將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中巴斯德醋酸桿菌的含量。對(duì)于巴斯德醋酸桿菌的熒光定量PCR方法，檢測(cè)拷貝數(shù)在3.66X 104-3.66 X IO11copies/μ L范圍時(shí)，Real-time PCR的擴(kuò)增曲線為一組典型的倒S曲線,擴(kuò)增曲線基線平整，指數(shù)區(qū)較明顯且陡度大，平臺(tái)區(qū)能夠匯于一起，線性范圍比較寬。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度越高，循環(huán)閾值CT越低。該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程是y=_0.3395X+15.607，線性相關(guān)系數(shù)為
0.9980，具有較好的線性關(guān)系，根據(jù)公式E=10_k-1 (k-標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)，算得Real-timePCR的擴(kuò)增效率為1.18，在0.8-1.2之間，擴(kuò)增效率理想。另外巴斯德醋酸桿菌Real-timePCR熔解曲線，在83.5°C左右出現(xiàn)單一的熔解峰，無(wú)引物二聚體及非特異性產(chǎn)物，曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，說(shuō)明各濃度質(zhì)粒的熔解溫度均一，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行定量是可靠的。熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)醋醅微生物群落中巴斯德醋酸桿菌的方法，具體步驟如下:
1、設(shè)計(jì)、合成針對(duì)巴斯德醋酸桿菌的特異性引物。2、對(duì)分離純化得到的巴斯德醋酸桿菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，利用細(xì)菌提取試劑盒對(duì)其培養(yǎng)液進(jìn)行DNA提取。3、以巴斯德醋酸桿菌的DNA為模板，以Ap-F/Ap-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段，并將PCR產(chǎn)物割膠回收。4、構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的片段與PMD19-T Vector連接，連接后轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并用PCR驗(yàn)證目的片段是否插入PMD19-TVector,驗(yàn)證成功的質(zhì)粒作為突光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)樣品。5、利用液氮研磨、酶消化和高鹽提取結(jié)合的方法提取發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)醋醅群落的總DNA作為待測(cè)樣品。 6、突光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的確立。通過(guò)反復(fù)試驗(yàn),確定最優(yōu)反應(yīng)體系和循環(huán)條件。7、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，重組質(zhì)粒倍比稀釋8個(gè)梯度，與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)與CT值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的CT值對(duì)醋酸發(fā)酵過(guò)程不同時(shí)間醋醅群落中巴斯德醋酸桿菌進(jìn)行定量分析。所述的巴斯德醋酸桿菌的特異性引物，其序列為(5' — 3'):
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)醋醅中巴斯德醋酸桿菌的方法，其特征及具體步驟如下: ①設(shè)計(jì)、合成針對(duì)巴斯德醋酸桿菌deioAacierpasteurianus)的特異性引物； ②對(duì)分離純化得到的巴斯德醋酸桿菌進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，利用細(xì)菌提取試劑盒對(duì)其培養(yǎng)液進(jìn)行DNA提??； ③以巴斯德醋酸桿菌的DNA為模板，以Ap-F/Ap-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段，并將PCR產(chǎn)物割膠回收； ④構(gòu)建重組質(zhì)粒，將目的片段與PMD19-TVector連接，連接后轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取轉(zhuǎn)化子擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并用PCR驗(yàn)證目的片段是否插入PMD19-TVector,驗(yàn)證成功的質(zhì)粒作為突光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)樣品； ⑤利用液氮研磨、酶消化和高鹽提取結(jié)合的方法提取發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)醋醅群落的總DNA作為待測(cè)樣品； ⑥確立熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件； ⑦重組質(zhì)粒倍比稀釋8個(gè)梯度，與待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)與CT值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測(cè)樣品的CT值對(duì)醋酸發(fā)酵過(guò)程不同時(shí)間醋醅群落中巴斯德醋酸桿菌進(jìn)行定量分析。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，步驟①中針對(duì)巴斯德醋酸桿菌的特異性引物序列(5' — 3')為:Ap-F: TCAAGTCCTCATGGCCCTTATGAp-R: TCGAGTTGCAGAGTGCAATCC
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，步驟⑤所述的利用液氮研磨、酶消化和高鹽提取結(jié)合的方法提取發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)醋醅群落的總DNA作為待測(cè)樣品的方法具體操作為: 稱取2 g醋醅，在研缽中加入液氮充分研磨，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管；向離心管中加入6mL DNA抽提緩沖液，再加入100 μ L溶菌酶(50 mg/mL)，于225 rpm搖床上37°C搖動(dòng)30min;向離心管中加入1.5 mL 10% SDS,65°C水浴2 h,每隔15 20 min輕輕顛倒幾下，室溫6000Xg離心10 min ;收集上清；將上清液用等體積的氯仿-異戊醇(24:1體積比)，抽提一次，以0.6倍體積的異丙醇室溫沉淀lh, 16000g離心20 min,收集核酸沉淀,用70%乙醇洗滌沉淀，DNA沉淀干燥后溶于100 μ L TE或ddH20中，加入終濃度為0.5 μ g/mlRNaseA,并在37 °C下水浴消化2 h,以去除RNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證DNA提取的效果，如果在10 kb左右出現(xiàn)條帶，則DNA提取成功，將成功提取的DNA溶液置于-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為，步驟⑥確立的熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下: 反應(yīng)體系采用20 μ L體系,其中SsoFast EvaGreen預(yù)混液10 yL,正向引物I μ L,反向引物I μ L，模板DNAlO ng，ddH20加至20 μ L ;反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性30 s ;95°C變性5 s，57°C退火10 S，讀取熒光信號(hào)數(shù)據(jù)，共循環(huán)擴(kuò)增40次。
全文摘要
本發(fā)明采用熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)醋醅群落中巴斯德醋酸桿菌的動(dòng)態(tài)變化。本發(fā)明針對(duì)醋醅群落中的巴斯德醋酸桿菌設(shè)計(jì)特異性引物，提取分離純化得到的巴斯德醋酸桿菌的基因組，然后利用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR得到特異性目的片段，再將目的片段與pMD19-TVector連接，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，挑取成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得高濃度質(zhì)粒，然將此高濃度質(zhì)粒做10倍比稀釋?zhuān)鳛闊晒舛縋CR的標(biāo)準(zhǔn)品。利用液氮研磨、酶法和高鹽結(jié)合的方法提取發(fā)酵過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)醋醅群落的總DNA作為待測(cè)樣品，將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中巴斯德醋酸桿菌的含量。本發(fā)明提供了一種熒光定量PCR的分子生態(tài)技術(shù)對(duì)醋醅中的巴斯德醋酸桿菌進(jìn)行定量分析，為其他微生物群落的研究提供技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK103146839SQ201310105770
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月29日
發(fā)明者許正宏, 史勁松, 陸震鳴, 王宗敏, 李國(guó)權(quán), 錢(qián)建瑛 申請(qǐng)人:江南大學(xué)