一種適合富含多糖類(lèi)植物的干燥葉片dna提取方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種適合多糖類(lèi)植物干燥葉片的DNA提取方法，包括干燥葉片研磨、去糖、裂解、抽提、沉淀、洗滌和檢測(cè)等步驟。其中，去糖是本發(fā)明的關(guān)鍵，在核膜沒(méi)有裂解釋放出基因組DNA之前，加入預(yù)熱的去糖緩沖液，在65℃水浴條件下懸浮葉片組織溶液，可以使多糖及其他次生代謝物質(zhì)溶解于緩沖液中，再通過(guò)低速離心去除多糖等雜質(zhì)，使最后沉淀得到的DNA具有較高的濃度和純度。本發(fā)明適用于所有櫻屬植物及其它富含多糖類(lèi)植物的干燥成熟葉片，如果是幼嫩葉片則會(huì)增加所得DNA的濃度，在成熟葉片中一樣能夠得到較多較高質(zhì)量的DNA。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種適合富含多糖類(lèi)植物的干燥葉片DNA提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種適合富含多糖類(lèi)植物的干燥葉片DNA提取方法，尤其涉及一種適合櫻屬植物的干燥葉片的DNA提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]獲得高質(zhì)量(高濃度、高純度、高完整性)的DNA是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)最關(guān)鍵的第一步，目前，已經(jīng)發(fā)展了多種方法，成功地從植物葉片、愈傷組織、組培苗、果實(shí)、韌皮部等組織器官中提取出DNA。但是植物材料由于大都含有種類(lèi)繁多的次生代謝物質(zhì)，有些情況下，不同植物甚至是同一種類(lèi)植物組織材料的來(lái)源、部位外在性質(zhì)的不同以及化學(xué)成分、組織結(jié)構(gòu)等內(nèi)在特點(diǎn)的差異，在提取基因組DNA時(shí)需要選擇不同的方法或作一些特殊的處理。從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質(zhì)的木本植物中提取的方法難度就相對(duì)大于大多數(shù)的禾谷類(lèi)及蔬菜類(lèi)植物，獲得的DNA溶液常常黏度大乃至呈膠狀，是植物DNA提取中最常見(jiàn)現(xiàn)象，主要原因是多糖、酚類(lèi)在提取過(guò)程中與DNA共沉淀，形成包裹DNA的黏稠膠狀物，難以溶解或產(chǎn)生褐變，獲得的DNA常出現(xiàn)產(chǎn)量低、質(zhì)量差、易降解，嚴(yán)重影響了 DNA質(zhì)量和純度，不能被限制 性?xún)?nèi)切酶酶切，嚴(yán)重的甚至不能作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所以，如何高效簡(jiǎn)便地去除多糖、多酚等次生代謝物質(zhì)，對(duì)提取純化植物DNA來(lái)說(shuō)至關(guān)重要。
[0003]櫻屬植物為典型的多年生木本果樹(shù)作物，其成熟葉片中富含大量酚類(lèi)物質(zhì)和多糖，尤其多糖含量極為豐富，所得DNA粗提液為粘稠膠狀物，流動(dòng)性極差，嚴(yán)重限制后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。目前傳統(tǒng)方法一般都是采取春季幼嫩未完全展開(kāi)的葉片進(jìn)行提取且多采用新鮮或冷凍的材料，其相對(duì)于干燥成熟葉片所含的此生代謝物質(zhì)較少，所得DNA勉強(qiáng)可以供后續(xù)對(duì)DNA質(zhì)量要求不高的實(shí)驗(yàn)使用。但由于受時(shí)間和實(shí)驗(yàn)進(jìn)度的影響，再加上春季取樣時(shí)間極短及取樣地距離的影響，獲得幼嫩葉片難度較大，通常需在夏季取硅膠干燥的成熟葉片。對(duì)于干燥的成熟葉片采用傳統(tǒng)的提取方法很難的到理想的DNA。
[0004]因此，針對(duì)櫻屬及其它植物干燥成熟葉片富含多糖、多酚及其它次生代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)，高效簡(jiǎn)便地去除多糖、多酚等次生物質(zhì)，對(duì)提取純化植物DNA來(lái)說(shuō)至關(guān)重要，同時(shí)為夏秋季無(wú)法獲得幼葉等其它幼嫩材料時(shí)從事果樹(shù)基因組研究提供新的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服櫻屬及其它富含多糖類(lèi)植物干燥成熟葉片DNA提取難度大的問(wèn)題，提供一種適合多糖類(lèi)植物干燥葉片的DNA提取方法。本發(fā)明采用中國(guó)櫻桃地方品種、中國(guó)櫻桃野生植株、毛櫻桃和歐洲甜櫻桃的硅膠干燥成熟葉片為材料，提取高質(zhì)量的DNA。
[0006]其技術(shù)方案為:
[0007]一種適合多糖類(lèi)植物干燥葉片的DNA提取方法，包括以下步驟:
[0008]I)取變色硅膠干燥的葉片0.5-1.0g,加PVP與V。的研缽中加液氮研磨成粉；
[0009]2)將研磨好的葉片粉末轉(zhuǎn)入2.0ml離心管中，每管0.2-0.4g，加入1.5ml65°C預(yù)熱的去糖緩沖液和10 μ I β -巰基乙醇，充分混合后在65°C水浴IOmin ；
[0010]3)在常溫下5000rpm離心3min,棄上清,收集沉淀；
[0011]4)在沉淀中加入lml65 °C預(yù)熱的3 %的CTAB和10 μ I β -巰基乙醇，65 V水浴40min或Ih時(shí)，期間每隔5_10min顛倒離心管以使液體混勻，然后常溫下12500rpm離心IOmin ；
[0012]5)取上清液轉(zhuǎn)入新的2.0ml的離心管中，加入等體積的氯仿，輕搖萃取5min，直到氯仿相溶液變色，在8°C下12500rpm離心IOmin ；
[0013]6)上清液轉(zhuǎn)入新的2.0ml離心管中，重復(fù)步驟5)；
[0014]7)取上清液約600 μ I轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，加入2倍體積經(jīng)_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉,顛倒混勻_20放置30min, 1000Orpm離心15min,棄
上清，收集沉淀；
[0015]8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800μ 1，輕搖并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗兩次，再用無(wú)水乙醇清洗一次，置于通風(fēng)處過(guò)夜吹干；
[0016]9) DNA沉淀用50 μ I TE溶解，置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0017]10)取2 μ I溶解的DNA溶液，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白質(zhì)分析儀上檢測(cè)260nm、280nm處的吸收值和DNA的濃度，并根據(jù)0D260/0D280值來(lái)判斷 DNA的純度。
[0018]步驟I)中所述的去糖緩沖液為lmol/L氯化鈉；0.lmol/L Tris-HCl PH8.0 ；
0.02mol/L EDTAPH8.0 ；0.4mol/L 葡萄糖。
[0019]步驟4)中所述的 CTAB 為 1.5mol/lNaCl ；0.lmol/L Tris-Hcl PH8.0 ；0.02mol/LEDTAPH8.0 ;2% PVP。
[0020]其中上述步驟I)中所述的研磨時(shí)加PVP與V。各0.2-0.5g，材料干燥良好時(shí)可以選擇不加，研磨一定要充分、快速。
[0021]步驟2)中在向2.0ml離心管中加粉末前，可預(yù)先在離心管中加入去糖緩沖液在65°C水浴中預(yù)熱，待材料研磨成粉末后迅速加入離心管，搖勻水浴即可。
[0022]步驟3)中在常溫離心，離心轉(zhuǎn)速為3000-6000rpm，否則沉淀積到管底很難分散。
[0023]步驟4)中加入CTAB裂解液后應(yīng)及時(shí)充分搖勻，盡可能的呈懸浮液，水浴過(guò)程中隔3-5min上下輕搖一次，保證裂解充分。
[0024]步驟5)中抽提時(shí)只用氯仿即可，加苯酚效果反而不好，加入氯仿后充分搖勻。
[0025]步驟6)中可根據(jù)抽提離心后兩個(gè)液相之間的蛋白質(zhì)層的多少確定抽提次數(shù)，直到中間沒(méi)有蛋白質(zhì)層為止。
[0026]步驟7)中沉淀所有無(wú)水乙醇最少要加2倍體積，若沉淀液顏色較深的話適量多加醋酸鈉可有效去除顏色。
[0027]步驟8)中洗滌沉淀的75%乙醇至少要800 μ 1，洗滌次數(shù)可根據(jù)情況增加，最后用無(wú)水乙醇洗滌吹干。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0029]本發(fā)明采用多糖含量很多的櫻屬植物干燥成熟葉片為材料提取DNA，采用本發(fā)明所述的提取方法流程能有效去除葉片組織中的多糖，所得到的DNA純度高，0D260/0D280 =
1.76-1.87 ；0D260/0D230 = 1.93-2.16、完整性和流動(dòng)性好，可迅速溶解于水或者TE，溶解后不會(huì)析出沉淀，溶液不粘稠，0.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小集中于40K-60K之間。
[0030]1、本發(fā)明所述方法采用干燥的成熟葉片為提取材料，相較于以往用新鮮或冰凍的幼嫩才來(lái)來(lái)說(shuō)，該方法對(duì)提取材料的要求寬松，可以在葉片生長(zhǎng)的任何時(shí)候取材，獲得的基因組DNA能夠滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
[0031]2、本發(fā)明方法在懸浮液裂解前，采用去糖緩沖液水浴懸浮葉片組織溶液，可以使在核膜裂解前多糖和其它此生代謝物質(zhì)充分溶解于緩沖液當(dāng)中，通過(guò)低速離心可以使細(xì)胞核及其它組分沉淀，而多糖和其它此生代謝物質(zhì)一同被除去。相對(duì)于在沉淀時(shí)去多糖的方法更有效的防治DNA的損失。
[0032]3、采用本發(fā)明的方法可以縮短提取時(shí)間至2.5小時(shí)，實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)簡(jiǎn)化。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1是用傳統(tǒng)方法提取的櫻屬植物的總基因DNA，經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果;
[0034]圖2是用本發(fā)明的方法提取的櫻屬植物的總基因組DNA，經(jīng)過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合附圖和 【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0036]一種適合多糖類(lèi)植物干燥葉片的DNA提取方法，包括以下步驟:
[0037]I)取變色硅膠干燥的中國(guó)櫻桃、歐洲甜櫻桃(紅燈)、野生中國(guó)櫻桃以及毛櫻桃葉片各0.5-1.0g,加0.3gPVP與V。的研缽中加液氮迅速研磨成粉，若研磨不充分，則增加液氮研磨次數(shù)；
[0038]2)將研磨好的葉片粉末迅速轉(zhuǎn)入2.0ml離心管中，每個(gè)樣品3管，每管大約
0.2-0.4g 加入 1.5ml65°C預(yù)熱的去糖緩沖液(lmol/L 氯化鈉；0.lmol/L Tris-HCl PH8.0 ；
0.02mol/L EDTAPH8.0 ；0.4mol/L葡萄糖;)和10 μ I β -巰基乙醇，充分混合后在65°C水浴IOmin ；
[0039]3)在常溫下5000rpm離心3min,棄上清,收集沉淀；
[0040]4)在沉淀中加入 lml65°C預(yù)熱的 3% 的 CTAB(1.5mol/lNaCl ；0.1moI/LTris-HcIPH8.0 ；0.02mol/LEDTAPH8.0 ；2% PVP ；3% CTAB)和 10 μ I β -巰基乙醇，65°C水浴 lh，其間每隔5min顛倒離心管以使液體混勻,然后常溫下12500rpm離心IOnin ；
[0041]5)取上清液轉(zhuǎn)入新的2.0ml的離心管中，加入等體積的氯仿，輕搖萃取5min，直到氯仿相溶液變色，在8°C下12500rpm離心IOmin ；
[0042]6)上清液轉(zhuǎn)入新的2.0ml離心管中，重復(fù)步驟5)(可多次重復(fù));
[0043]7)取上清液約600 μ I轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，加入2倍體積經(jīng)_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，輕輕顛倒混勻-20放置30min, 1000Orpm離心15min,棄上清,收集沉淀；
[0044]8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800 μ 1，輕搖并放置5min，輕輕倒掉乙醇，如此清洗兩次，再用無(wú)水乙醇清洗一次，置于通風(fēng)處過(guò)夜吹干；
[0045]9) DNA沉淀用40 μ I TE溶解，置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩0046]10)取2 μ I溶解的DNA溶液，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖2所示，從左往右依次為中國(guó)櫻桃、歐洲甜櫻桃、野生中國(guó)櫻桃、毛櫻桃各3個(gè)。
[0047]11)取2 μ I溶解的DNA溶液稀釋50倍后，在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白質(zhì)分析儀上檢測(cè)260nm、280nm處的吸收值和DNA的濃度，并根據(jù)0D260/0D280及0D260/0D230值來(lái)判斷DNA的純度，如表1所示。
[0048]表1
【權(quán)利要求】
1.一種適合多糖類(lèi)植物干燥葉片的DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)取變色硅膠干燥的葉片0.5-1.0gJP PVP與V。的研缽中加液氮研磨成粉； 2)將研磨好的葉片粉末轉(zhuǎn)入2.0ml離心管中，每管0.2-0.4g，加入1.5ml65°C預(yù)熱的去糖緩沖液和10 μ I β -巰基乙醇，充分混合后在65°C水浴IOmin ； 3)在常溫下5000rpm離心3min,棄上清,收集沉淀； 4)在沉淀中加入lml65°C預(yù)熱的3%的CTAB和10μ I β -巰基乙醇，65°C水浴40min或Ih時(shí),期間每隔5-10min顛倒離心管以使液體混勻,然后常溫下12500rpm離心IOmin ； 5)取上清液轉(zhuǎn)入新的2.0ml的離心管中，加入等體積的氯仿，輕搖萃取5min，直到氯仿相溶液變色，在8°C下12500rpm離心IOmin ； 6)上清液轉(zhuǎn)入新的2.0ml離心管中，重復(fù)步驟5)； 7)取上清液約600μ I轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，加入2倍體積經(jīng)_20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，顛倒混勻-20放置30min, 1000Orpm離心15min,棄上清，收集沉淀； 8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800μ 1，輕搖并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗兩次，再用無(wú)水乙醇清洗一次，置于通風(fēng)處過(guò)夜吹干； 9)DNA沉淀用50 μ I TE溶解，置于_20°C冰箱保存?zhèn)溆茫? 10)取2μ I溶解的DNA溶液，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白質(zhì)分析儀上`檢測(cè)260nm、280nm處的吸收值和DNA的濃度，并根據(jù)0D260/0D280值來(lái)判斷DNA的純度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合多糖類(lèi)植物干燥葉片的DNA提取方法，其特證在于，步驟I)中所述的去糖緩沖液為lmol/L氯化鈉；0.lmol/L Tris-HCl PH8.0 ；0.02mol/LEDTAPH8.0 ；0.4mol/L 葡萄糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的適合多糖類(lèi)植物干燥葉片的DNA提取方法，其特征在于，步驟 4)中所述的 CTAB 為 1.5mol/lNaCl ；0.lmol/L Tris-Hcl PH8.0 ；0.02mol/L EDTAPH8.0 ；2% PVP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)適合多糖類(lèi)植物干燥葉片的DNA提取方法，其特征在于，所述多糖類(lèi)植物為櫻屬植物。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103756994SQ201310091005
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2013年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月21日
【發(fā)明者】王小蓉, 陳濤, 湯浩茹, 劉澤靜, 陳清, 張勇, 羅婭, 黃曉姣, 陳嬌 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)