水稻抗病相關(guān)基因pal4的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一個(gè)水稻抗病相關(guān)基因PAL4的功能驗(yàn)證及應(yīng)用。本發(fā)明驗(yàn)證的PAL4基因是水稻抗病反應(yīng)中的正調(diào)控因子,它參于調(diào)控水稻抵抗從根部侵染的稻瘟病菌。所述的PAL4基因的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO:1所示,其編碼對(duì)pH值和溫度敏感的苯丙氨酸解氨酶,該苯丙氨酸解氨酶的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表SEQ?ID?NO:2所示。本發(fā)明還公開了所述基因在水稻遺傳改良中的應(yīng)用。
【專利說明】水稻抗病相關(guān)基因 PAL4
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一個(gè)水稻抗病相關(guān)基因 PAL4的功 能驗(yàn)證。本發(fā)明驗(yàn)證的PAL4基因是水稻抗病反應(yīng)中的正調(diào)控因子,它參于調(diào)控水稻抵抗從 根部侵染的稻瘟病菌。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物在生長的過程中,受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多,包括病 毒、細(xì)菌、真菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果:(1)寄主植物內(nèi)的病原菌成功繁 殖引起相關(guān)的病癥;(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng),殺死病原物或阻止其生長。通過利用抗性 基因資源來改良植物抗病性既可以預(yù)防病害又能夠減少噴施農(nóng)藥帶來的環(huán)境危害。
[0003] 水稻是世界上重要的糧食作物,但病害的影響常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。水 稻稻癌病由稻癌病菌(Magnaporthe oryzae)引起,是世界上對(duì)水稻危害最大的真菌性病害 之一。目前普遍認(rèn)為稻瘟菌是一種典型的地上組織(比如葉片等)侵染的半活體營養(yǎng)型的 病原菌,其侵染途徑是:分生孢子在病谷和染病的殘留稻草中越冬,當(dāng)氣溫和濕度合適的條 件下病原菌產(chǎn)生大量分生孢子,而這些孢子通過空氣擴(kuò)散到水稻的地上組織,完成侵染水 稻細(xì)胞的過程導(dǎo)致水稻出現(xiàn)病癥。而這些被侵染的細(xì)胞又產(chǎn)生新的菌絲分生孢子釋放到環(huán) 境中再次擴(kuò)散到其他水稻完成重復(fù)侵染,從而導(dǎo)致病害的迅速蔓延。然而隨著人們對(duì)稻瘟 病菌的不斷認(rèn)識(shí),研究者發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌可以由根部侵染水稻,在根部和地上部分產(chǎn)生病斑, 并稻瘟菌根部侵染也和葉部侵染一樣適用于基因?qū)蚣僬f(Sesma和0sb 〇Urn,2004)。進(jìn) 一步的研究表明,稻瘟菌從根部侵染水稻屬于活性營養(yǎng)型,可以在整個(gè)植株上產(chǎn)生系統(tǒng)性 侵染,具有典型的土傳病原菌的特征和特性(Marcel等,2010)。近年來真菌分類學(xué)家又把 稻癌病菌劃分到了新建立的包含上傳病原菌的Magnaporthaceae家族(Rossman等,2007), 改變了人們對(duì)稻瘟病菌只能從地上組織侵染的傳統(tǒng)觀點(diǎn)。而這一發(fā)現(xiàn)也對(duì)稻瘟病菌的流行 病學(xué)方面的觀點(diǎn)產(chǎn)生了重要的意義,從根部侵染可能是稻瘟病菌的初侵染源之一,是稻瘟 病菌發(fā)生和流行的一個(gè)重要影響因素。也有研究指出稻瘟病菌的循環(huán)是由帶病的水稻種子 在萌發(fā)的過程中由于稻瘟病菌的不斷積累導(dǎo)致這些帶病的種子在很小就死亡,而這些死亡 的染病水稻苗就作為最初的感染源侵染附近健康植株的根和葉片,感染新萌發(fā)秧苗根和葉 形成菌絲,然后這些染病的植株再發(fā)展病癥直到再次感染種子完成循環(huán)(Faivre-Rampant 等,2012)。對(duì)于水稻來說,不同的侵染途徑會(huì)導(dǎo)致水稻防御反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)強(qiáng)度以及時(shí) 空的差異。因此,研究水稻抗稻瘟根部侵染的病程相關(guān)基因有助于理解水稻抗稻瘟病的抗 性機(jī)制,對(duì)于抗稻瘟品種的選育也提供了新的策略,在學(xué)術(shù)上以及生產(chǎn)應(yīng)用上都有深遠(yuǎn)的 意義。
[0004] 植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為 兩類:⑴主效抗病基因,又稱MR (major resistance)基因和⑵抗病相關(guān)基因。目前人 們普遍認(rèn)為主效抗病基因編碼蛋白的主要功能是作為受體直接或間接與病原物質(zhì)相互作 用來啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑(Kou和Wang,2010 ;Zhang和Wang,2013)。抗病基 因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強(qiáng),是很好的基因資源。但是在運(yùn)用抗病基因改良植物抗性的過程 中受到以下幾點(diǎn)的限制:(1)主效抗病基因的資源有限,如目前知道的抵抗水稻重要病害 白葉枯病的主效抗病基因大約只有37個(gè);(2)主效抗病基因具有病原種類和病原生理小種 特異性,導(dǎo)致抗病范圍有限;(3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔儯粋€(gè)主效抗病基因的作用往往不能 持久。抗病相關(guān)基因是指除主效抗病基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因,通常認(rèn)為它們的編 碼產(chǎn)物參于合成植物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參于信號(hào)傳導(dǎo)、阻止信號(hào)傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng)等。 這類基因的共同特點(diǎn)是病原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少,因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo) 前后基因的表達(dá)量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Maleck等,2000 ;Schenk等, 2000 ;Zhou等,2002)。目前,人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)已有報(bào)道,絕大多數(shù)抗 病相關(guān)基因單獨(dú)作用時(shí)的抗性能力可能比抗病基因小。但基于以下原因,它們是值得大力 開發(fā)的基因資源:(1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用, 這類基因是具有持久抗性的基因資源;(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參于的抗病反應(yīng)沒有病原 特異性,因此它們是具有廣譜抗性的基因資源;(3)這類基因的資源豐富。但是,水稻中雖 然鑒定了很多抗病相關(guān)基因(Zhou等,2002 ;Chu等,2004),這些基因在水稻抗病反應(yīng)中的 作用機(jī)理、以及單個(gè)抗病相關(guān)基因是否會(huì)引起水稻抗病表型的改變都不清楚。分離克隆抗 病相關(guān)基因?qū)λ究共C(jī)理的研究有重大意義,同時(shí)抗病相關(guān)基因在應(yīng)用上比抗病基因提 供了更為廣譜以及長效的抗性。了解病害的發(fā)病機(jī)制,有助于利用高效途徑改良水稻品種 的抗性,控制病害的發(fā)生。通過超量表達(dá)作為抗病反應(yīng)正調(diào)控因子的抗病相關(guān)基因進(jìn)行水 稻品種的改良,將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性,拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育 種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。
[0005] 本發(fā)明所描述的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因?qū)?于一個(gè)基因家族,廣泛存在于植物中,是植物體內(nèi)多種次生代謝途徑的關(guān)鍵酶。莽草酸途徑 產(chǎn)生的苯丙氨酸經(jīng)過PAL解氨作用后生成肉桂酸,進(jìn)入苯丙烷類代謝途徑,可生成類黃酮、 木質(zhì)素等多種次生代謝產(chǎn)物,一切含苯丙烷骨架的物質(zhì)都是由這一途徑直接或者間接生成 的,而產(chǎn)生的次生產(chǎn)物在植物的生長發(fā)育、抗病、抗逆反應(yīng)中都起著重要的作用。近些年 來,隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)許多黃酮類物質(zhì)具有抗自由基,調(diào)解血脂,抗癌,抗菌抗炎的 作用,掀起了黃酮類物質(zhì)研究開發(fā)利用的熱潮。苯丙烷類和黃酮類化合物的代謝途徑是植 物重要的次生代謝途徑之一,黃酮類化合物的生物合成都是通過苯丙烷類生物合成途徑而 來,而PAL是其中極為關(guān)鍵的酶。由此產(chǎn)生的黃酮類化合物柚皮素具有多種生物活性,可以 被多種酶類進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾生成衍生物,是許多代謝產(chǎn)物的前體,具有抗菌、抗炎、清除自由 基、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗癌抗腫瘤等作用,可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。柚 皮素經(jīng)過轉(zhuǎn)甲基酶轉(zhuǎn)入一個(gè)甲基可以形成櫻花素,櫻花素是一種很好的黃烷酮類植物抗 毒素,是植物防御體系的重要組成部分。
[0006] 綜上所述,發(fā)掘和利用優(yōu)良抗性基因資源改良水稻是控制稻瘟病害的發(fā)生、減少 或避免水稻病害所帶來的損失最經(jīng)濟(jì)有效的措施。另一方面,PAL是苯丙烷類和黃酮類化合 物代謝途徑中極為重要的酶,通過對(duì)它的發(fā)掘?qū)τ谘芯看紊x反應(yīng)有很大的利用價(jià)值, 同時(shí)也能更好的將黃酮類代謝產(chǎn)物運(yùn)用于醫(yī)藥,食品領(lǐng)域。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明的目的是鑒定一個(gè)水稻PAL基因在水稻-病原互作中的功能,為利用這個(gè) 基因改良水稻品種或其它植物抵御病害的能力奠定基礎(chǔ)。 申請(qǐng)人:將這個(gè)基因命名為PAL4。
[0008] 本發(fā)明涉及的PAL4基因賦予水稻對(duì)由從其根部侵染的稻瘟病菌所引起的病害產(chǎn) 生抗病反應(yīng)。該基因的DNA序列如序列表SEQ ID N0:1所示,或者基本上相當(dāng)于SEQ ID N0:1所示的DNA序列,或者其功能相當(dāng)于SEQ ID N0:1所示序列的亞片段。對(duì)其序列進(jìn)行 分析表明,它編碼一種苯丙氨酸解氨酶。阻止這種酶的表達(dá),減弱水稻對(duì)稻瘟病的抗性,同 時(shí)降低其根中黃酮類次生代謝產(chǎn)物如植物抗毒素的含量。
[0009] 本發(fā)明涉及分離一種包含0sPAL4基因的DNA片段并鑒定其功能,提供了該基因 的核苷酸序列和氨基酸序列。其中,所述片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :1所示, 或者基本上相當(dāng)于SEQ ID N0 :1所示的核苷酸序列,也包括在添加、取代、插入或缺失一 個(gè)或多個(gè)核苷酸而產(chǎn)生的突變體等位基因或衍生物,或者其功能相當(dāng)于SEQ ID N0 :1所 示序列的亞片段。對(duì)其序列進(jìn)行分析表明它編碼一種苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase),將苯丙氨酸解氨基形成肉桂酸。
[0010] 在本發(fā)明的實(shí)施例部分, 申請(qǐng)人:闡述了對(duì)PAL4基因的功能驗(yàn)證過程以及其編碼 的苯丙氨酸解氨酶的特點(diǎn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 序列表SEQ ID N0 :1 :是PAL4基因的核苷酸序列。序列全長為2261bp。
[0012] 序列表SEQ ID NO :2 :是PAL4基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。編碼713個(gè)氨基 酸。
[0013] 圖1 :本發(fā)明鑒定和分離克隆水稻抗病相關(guān)基因 PAL4以及驗(yàn)證該基因功能的流程 圖。
[0014] 圖 2 :用定量反轉(zhuǎn)錄-PCR(quantitative reverse transcription-PCR,qRT-PCR) 技術(shù)檢測(cè)感病水稻品種C039和抗病水稻家系C101A51接稻瘟病菌菌株CHL358后PAL4基 因的表達(dá)模式。水稻樣品來源于接種CHL358后0. 5、1、2、24、72、120、168小時(shí)后的材料。
[0015] 圖3 :PAL4基因結(jié)構(gòu)以及T-DNA插入突變體05Z11DD35中T-DNA插入位點(diǎn)⑷和 突變體基因型的驗(yàn)證分析(B)。圖中橫線條代表PAL4基因的內(nèi)含子,黑色橫柱條表示外顯 子的編碼序列。數(shù)字表示每一種結(jié)構(gòu)的核苷酸數(shù)目和T-DNA插入位點(diǎn)前核苷酸數(shù)目(按 序列表SEQ ID NO :1.所示序列編號(hào))。"ATG"和"TAG"分別是翻譯起始密碼和終止密碼。 箭頭PAL-1F、PAL1R-2、NTLB5分別表示用來驗(yàn)證突變體是否正確的PCR引物;其中PAL-1F 和PAL1R-2引物是根據(jù)PAL4基因序列設(shè)計(jì),分別位于T-DNA插入位點(diǎn)兩側(cè);NTLB5是根據(jù) T-DNA內(nèi)部序列設(shè)計(jì)的引物。圖3,B中的WT(對(duì)照)表示野生型(非轉(zhuǎn)基因)水稻品種中 花11。
[0016] 圖4 :是本發(fā)明涉及的原核表達(dá)載體pMAL_c2示意圖。
[0017] 圖5 :PAL4蛋白具有苯丙氨酸解氨基的活性。PAL4蛋白催化底物L(fēng)-苯丙氨酸脫 氨基形成產(chǎn)物反式肉桂酸。ck:原核表達(dá)標(biāo)簽蛋白。
[0018] 圖6 :溫度和pH值影響PAL4蛋白的酶活性。
[0019] 圖7 :PAL4基因 T-DNA插入突變體植株(05Z11DD35)對(duì)稻瘟病抗病性減弱。C039 是水稻稻瘟病感病品種。對(duì)照為水稻品種中花11 (野生型),是T-DNA插入突變體遺傳轉(zhuǎn)化 的受體。對(duì)照1是從05Z11DD35株系后代中分離出的陰性植株。突變體的病斑面積較對(duì)照 顯著增加。感染率是指每個(gè)水稻細(xì)胞中含有的稻瘟病菌細(xì)胞的比率。突變體植株中的感染 率高于中花11野生型對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0020] 圖8 :PAL4基因 T-DNA插入突變體植株(05Z11DD35)植株根中的PAL酶活、水楊酸 和黃酮類植保素的含量降低。對(duì)照為水稻品種中花11 (野生型),是T-DNA插入突變體遺傳 轉(zhuǎn)化的受體,對(duì)照1是從05Z11DD35株系后代中分離出的陰性植株。酶活的下降導(dǎo)致水楊 酸下降到原來的三分之一,導(dǎo)致櫻花素和柚皮素的含量減少95%以上。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 本發(fā)明的前期研究工作結(jié)果揭示,在水稻-細(xì)菌性病原互作中,PAL4(原文獻(xiàn)中命 名PAL)基因的表達(dá)量發(fā)生改變,提示該基因可能參于水稻抵抗病原菌反應(yīng)(Qiu等,2007)。 為了驗(yàn)證這一分析推測(cè),產(chǎn)生了本發(fā)明。
[0022] 以下實(shí)施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明,圖1描述了鑒定PAL4基因功能的流程。根據(jù)以 上的描述和這些實(shí)施例,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征,并且在不偏離本發(fā) 明精神和范圍的情況下,可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改,以使其適用各種用途和條件。
[0023] 實(shí)施例1 :PAL4基因在不同水稻品種中的表達(dá)模式分析
[0024] 用 PAL 結(jié)構(gòu)域 PF00221 (Pfam database,http://pfam. sanger. ac. uk/)在水稻全 基因組序列中進(jìn)行Blastp檢索,得到9個(gè)PAL家族成員。本發(fā)明所研究的基因在MSU Rice Genome Annotation Project (http://rice. plantbiology. msu. edu/)中的編號(hào)為 L0C_ 0s02g41680,按照各個(gè)PAL家族成員在染色體的位置排列, 申請(qǐng)人:將該基因命名為PAL4。
[0025] 為了證實(shí)PAL4基因是否參與抗病反應(yīng)的調(diào)控,本發(fā)明采用定量反轉(zhuǎn) 錄 _PCR(quantitative reverse transcription-PCR,qRT-PCR)技術(shù)(Qiu 等,2007)分析 了 PAL4基因在感病水稻品種C039和抗病水稻家系C101A51中接種稻瘟病菌CHL358后的 表達(dá)模式。CHL358是常用稻瘟病菌株(Fu等,2011)。C039是國際上常用的稻瘟病感病水 稻品種,C101A51是以C039為背景的含有抗稻瘟病主效基因 Pi-2的近等基因系(Jiang和 Wang,2002)。稻瘟病菌接種采用噴霧法對(duì)3-4葉期的水稻進(jìn)行接種(Fu等,2011)。接種后 分不同時(shí)間點(diǎn)取接種葉片抽提總RNA(Zhou等,2002)。取1?5 μ g總RNA用DNasel (美國 Invitrogen公司)處理15分鐘以去除基因組DNA污染,然后參照Zhou等(2002)的方法, 使用〇lig〇(dT) 15寡聚引物和M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(購自美國Promega公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用 實(shí)時(shí)定量PCR分析試劑盒SYBR?GreenPCR Master Mix (寶生物工程(大連)有限公司), 并根據(jù)試劑盒使用說明書,在 ABI 7500Real_Time PCR system(美國 Applied Biosystems 公司)儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。用水稻內(nèi)源肌動(dòng)蛋白(actin)基因的表達(dá)量衡量、并 均一化樣品RNA含量(Qiu等,2007)。qRT-PCR分析中的PAL4基因特異PCR引物是DL-〇sP AL4F(5, -GGGCAACCCAGTGACCAA-3')和DL-〇sPAL4R(5, -CGATTGCCTCGTCGGTCTT-3'), 肌動(dòng)蛋白基因 PCR 引物是 actinFb' -TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3')和 actinRb' -A ATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3 ; )〇
[0026] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示接種稻瘟病菌CHL358后,PAL4基因在感病品種C039中被迅速誘導(dǎo) 直至72小時(shí)出現(xiàn)表達(dá)高峰,而抗病品種中PAL4的表達(dá)首先有個(gè)抑制過程,直至72小時(shí)才 被誘導(dǎo)上升(圖2)。C101A51攜帶抗稻瘟病主效基因 Pi-2,在沒有稻瘟病菌侵染時(shí),PAL4 基因在抗病水稻C101A51中的表達(dá)量顯著高于在感病水稻C039中的表達(dá)量(圖2)。這一 結(jié)果提示:PAL4基因可能參與抗稻瘟病反應(yīng)的調(diào)控。
[0027] 實(shí)施例2 :確定水稻品種中花11中的PAL4基因的序列和結(jié)構(gòu)
[0028] 1.分離水稻品種中花11中的PAL4基因的序列
[0029] 水稻全基因組序列數(shù)據(jù)庫的L0C_0s02g41680位點(diǎn)信息中包含有PAL4基因的cDNA 序列[GenBank(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)注冊(cè)號(hào):AK068993],該 cDNA 序列編碼 713 個(gè)氨基酸。水稻全基因組序列數(shù)據(jù)庫中的水稻序列來自于粳稻品種日本晴(Oryza sativa ssp. Japonica),cDNA序列AK068993也來自于日本晴。
[0030] 我們根據(jù)水稻品種日本晴中的PAL4基因編碼區(qū)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR引物: EC0R1-0SPAL4F(5 ; -ATGAATTCATGGAGTGCGAGAACGGCCGC-3 ')(下劃線代表用于載體連接 的接頭中EcoRI限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn))和XBA1-0SPAL4R(5 ' -ATTCTAGATCAGCAGATTGGCA GGGGCTC-3')(下劃線代表用于載體連接的接頭中的Xbal限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn))。利用 這對(duì)PCR引物從粳稻品種中花11中擴(kuò)增包含PAL4基因的cDNA片段并將這個(gè)片段克隆到 載體上。中花11是常用水稻品種(Wu等,2003)。利用美國Applied Biosystems公司的測(cè) 序試劑盒,以雙脫氧核苷酸末端終止法(美國Applied Biosystems公司)從載體兩端測(cè)序 得到PAL4的編碼區(qū)序列。同時(shí)利用位于基因內(nèi)部的PCR引物PAL3RC -TGAGTCAGGTGGTC GGTGTA-3 測(cè)量內(nèi)含子的序列,序列拼接后得到一長2261bp的DNA序列(見序列表SEQ ID NO :1),它包含完整的PAL4基因的編碼序列(圖3, A)。
[0031] 2.水稻品種中花11中的PAL4基因結(jié)構(gòu)分析
[0032] 申請(qǐng)人:將中花11中的PAL4基因組測(cè)序以后,與水稻品種日本晴中的PAL4基因序 列進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)以及內(nèi)含子的序列與日本晴中完全相同。比較中花11中的PAL4 基因的基因組序列和cDNA序列,確定中花11中的PAL4基因編碼區(qū)包含兩個(gè)外顯子和一個(gè) 內(nèi)含子(圖3,A)。第一個(gè)外顯子由395個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID N0:1的l-395bp 處),第一個(gè)內(nèi)含子由119個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID NO :1的396-514bp處),第 二個(gè)外顯子由1747個(gè)核苷酸組成(位于序列表SEQ ID N0:1的515-2258bp處)(圖3,A)。 下文中涉及的PAL4基因均來自水稻品種中花11。
[0033] 3.PAL4基因編碼產(chǎn)物的分析
[0034] PAL4基因編碼一個(gè)由713個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)(序列表SEQ ID N0 :2),具有苯 丙氨酸/組氨酸解氨酶保守結(jié)構(gòu)域(MacDonald和Cunha,2007)。已知苯丙氨酸解氨酶 可以催化L-苯丙氨酸形成反式肉桂酸(Koukol和Conn, 1961)。為了驗(yàn)證PAL4蛋白具有 苯丙氨酸解氨酶活性,本發(fā)明在大腸桿菌中表達(dá)PAL4蛋白,分離純化該蛋白用于酶活性分 析。具體操作如下:從水稻品種中花11中抽取總RNA和通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以此為模板 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增PAL4基因的編碼區(qū)的cDNA片段。用于擴(kuò)增的PCR引物為EC0R1-0SPAL 4F(5 ; -ATGMTTCATGGAGTGCGAGAACGGCCGC-3 ;)(下劃線代表用于載體連接的接頭中EcoRI 限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn))和 XBA1-0SPAL4R(5 ' -ATTCTAGATCAGCAGATTGGCAGGGGCTC-3 ;) (下劃線代表用于載體連接的接頭中的Xbal限制性內(nèi)切酶消化位點(diǎn))。將PCR產(chǎn)物與TA 克隆載體PMD18-T(購自寶生物工程(大連)有限公司)連接,通過酶切篩選陽性克隆,再 經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證無核苷酸突變。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xbal消化帶有PAL4基因編碼區(qū)段 的陽性克隆和PMAL-C2載體[見圖4 ;購自紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司];酶切完畢 在65°C水浴10分鐘滅活限制性內(nèi)切酶。將酶切片段在0. 8%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收 目的條帶。用包含PAL4基因的酶切片段和酶切后的載體做連接反應(yīng)。通過酶切及測(cè)序驗(yàn) 證陽性克隆,將獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化(電轉(zhuǎn)儀為eppendorf公司產(chǎn)品,本實(shí)施例所用電壓 為1800v,具體操作參考該儀器的使用說明書)進(jìn)入大腸桿菌表達(dá)用宿主菌株BL21 (購自德 國Novagen公司)進(jìn)行原核表達(dá)。將pMAL-c2空載體也導(dǎo)入BL21作為對(duì)照。pMAL-c2載 體帶有麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein, MBP)標(biāo)簽。挑取單克隆培養(yǎng)過夜,以 1 : 100 (體積比)擴(kuò)大培養(yǎng)2-3小時(shí),待其0D值達(dá)到0. 5,加入異丙基硫代-β -D-半乳糖 苷(IPTG)至終濃度為ImM/L,誘導(dǎo)3小時(shí),收集菌體,表達(dá)蛋白(空載體對(duì)照帶有ΜΒΡ標(biāo)簽, PAL4重組蛋白氨基端帶有MBP標(biāo)簽)用麥芽糖親和樹脂Amy lose Resin[購自紐英倫生物 技術(shù)(北京)有限公司]進(jìn)行純化,操作參照說明書。PAL4蛋白酶反應(yīng)程序參照前人的方 法略作修改(Hu等,2011)。具體操作如下:在lmL Tris-HCl緩沖液中加入500yL 20mM底 物L(fēng)-苯丙氨酸和3μ L純化的PAL4蛋白,以空載體表達(dá)出的標(biāo)簽蛋白作為對(duì)照,在37°C反 應(yīng)lh后,加入0. 25mL 4M的鹽酸終止反應(yīng)。用甲醇:水(體積比)為1 : 1的溶劑將反應(yīng) 產(chǎn)物稀釋10倍后進(jìn)超快速液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(UFLC-MS/MS) (SHIMADZU,日本) 做定性分析。用Tecan光柵型酶標(biāo)儀(INFINITE 200,奧地利)測(cè)量290nm的吸光值計(jì)算樣 品酶活做定量分析。樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Bradf〇rd(1976)報(bào)道的方法。L-苯丙 氨酸和反式肉桂酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品分別從Duchefa和Sigma公司購得。
[0035] 結(jié)果顯示,加入MBP-PAL4重組蛋白進(jìn)行反應(yīng)后會(huì)生成產(chǎn)物反式肉桂酸,而MBP標(biāo) 簽蛋白對(duì)照不能生成反式肉桂酸,證明PAL4蛋白是苯丙氨酸解氨酶(圖5)。MBP-PAL4蛋 白在堿性環(huán)境下酶活性更高,且酶活隨著溫度的升高逐漸上升,直到55°C達(dá)到峰值后隨溫 度的上升快速下降(圖6)。這些結(jié)果說明PAL4是對(duì)pH值和溫度敏感的苯丙氨酸解氨酶。
[0036] 實(shí)施例3 :PAL4基因在水稻-病原互作中的功能驗(yàn)證
[0037] 1.篩選水稻突變體庫和突變體植株插入位點(diǎn)共分離分析
[0038] 為了驗(yàn)證PAL4基因在水稻-病原互作中的功能, 申請(qǐng)人:利用PAL4基因的序列檢 索水稻T-DNA插入突變體數(shù)據(jù)庫RMD (Zhang等,2006),發(fā)現(xiàn)該數(shù)據(jù)庫中的突變體05Z11DD35 具有375bp的側(cè)翼序列,該側(cè)翼序列與PAL4基因的一段序列(序列表SEQ ID N0 :1中的 483-857bp)同源。提示T-DNA插入在PAL4基因內(nèi)部。序列比較分析提示T-DNA插入在 序列表SEQ ID N0:1所示序列的857bp后,即T-DNA插入在PAL4基因的第2個(gè)外顯子內(nèi) (圖3,A)。PAL4基因 T-DNA插入突變體(05Z11DD35)具有粳稻中花11的遺傳背景(Wu等, 2003)。
[0039] 為了驗(yàn)證所獲得的突變體的正確性, 申請(qǐng)人:根據(jù)PAL4基因的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)位 于 T-DNA 插入位點(diǎn)兩側(cè)的 PCR 引物(圖 3, A) :PAL1F(5 ' -TCACGGAGTTGATCTCACGC-3 ') 和 PAL1R-2 (5 ' -CACAGGAGGACCAAGGAGGG-3 ')。另外,根據(jù) T-DNA 序列設(shè)計(jì)了 PCR 引物 N TLB5 (5 ' -AATCCAGATCCCCCGAATTA-3 ' ) (Wu 等,2003)。利用這 3 條 PCR 引物分析所獲得突 變體的T-DNA是否插入在PAL4基因的內(nèi)部。這一分析的基本原理是:在05Z11DD35純合突 變體(一對(duì)同源染色體中都有T-DNA的插入)植株中,由于插入的T-DNA片段大約14kb(Wu 等,2003),利用引物PAL1F和PAL1R-2、采用常規(guī)PCR方法無法擴(kuò)增如此大的DNA片段,而用 弓丨物PAL1R-2和NTLB5可以擴(kuò)增一段大小已知的水稻基因組和T-DNA的雜合DNA片段;在 05Z11DD35的雜合突變體(一對(duì)同源染色體中只有一條染色體中有T-DNA插入)植株中,用 引物PAL1F和PAL1R-2可以擴(kuò)增一段大小已知的水稻基因組的DNA片段,用引物PAL1R-2 和NTLB5也可以擴(kuò)增一段大小已知的水稻基因組和T-DNA的雜合DNA片段;在05Z11DD35 的陰性(家系中分離出的沒有T-DNA插入的)植株中,用引物PAL1F和PAL1R-2可以擴(kuò)增 一段大小已知的水稻基因組DNA片段,但是用引物PAL1R-2和NTLB5不能夠擴(kuò)增出DNA片 段。 申請(qǐng)人:對(duì)隨機(jī)選取的10株05Z11DD35家系的?\植株進(jìn)行了上述PCR分析。結(jié)果顯示 其中6株(1、2、3、4、6、7)是純合突變體,4株(5、8、9、10)是雜合突變體(圖,3Β)。這些結(jié) 果說明 申請(qǐng)人:獲得的水稻材料05Z11DD35是PAL4基因突變體。
[0040] 2.突變體植株對(duì)稻瘟病的抗性分析
[0041] 申請(qǐng)人:對(duì)純合的PAL4基因 T-DNA插入突變體(05Z11DD35)以及分離出來的陰性 對(duì)照(05Z11DD35陰性)植株和具有同樣遺傳背景的野生型對(duì)照水稻品種中花11進(jìn)行了根 部接種稻瘟病菌RBll(Fu等,2011)。具體方法如下:培養(yǎng)管底部填充3厘米厚的蛭石(蛭 石用蒸餾水浸泡1小時(shí)后浙干),放入和培養(yǎng)管孔徑一樣大小的生長均勻并鋪滿稻瘟病菌 的菌絲塊,然后鋪上1厘米厚的蛭石,放入正常發(fā)芽后的水稻種子,再在表層鋪上少許蛭石 以固定種子。密封培養(yǎng)管以阻止水分的流失,放入生化培養(yǎng)箱內(nèi)生長。光強(qiáng)為12000-15000 勒克司,設(shè)置溫度28°C,16小時(shí)光照8小時(shí)黑暗循環(huán)處理。直至水稻長至3葉期(大約 15天左右),調(diào)查葉片上出現(xiàn)的病斑。同時(shí)取水稻葉片DNA樣品進(jìn)行稻瘟病菌侵染率分析 (Kawano等,2010)。DNA的抽提方法是:樣品在抽提緩沖液[50mM Tris-HCl (ρΗ8· 0),150mM NaCl,100mM EDTA(pH8.0)]中充分研磨,加入50yL 10%SDS,37°C處理1-3小時(shí),處理后加 入 75 μ L5M NaCl,混勻后加入 65 μ L CTAB/NaCl 溶液(10% CTAB 溶于 0· 7M NaCl)與 65°C 處理30-60分鐘,加入等體積氯仿:異戊醇(體積比24 : 1)混勻15分鐘,10000g離心10 分鐘,小心吸取上清。加入0. 6倍體積異丙醇與-20°C沉淀1小時(shí)后10000g離心10分鐘。 棄上清,沉淀加入75 %乙醇,10000g離心5分鐘,吹干后溶水。得到的DNA采用實(shí)時(shí)定量PCR 分析試劑盒SYBR?Green PCR Master Mix(寶生物工程(大連)有限公司),并根據(jù)試劑盒 使用說明書,在 ABI7500 Real-Time PCR system(美國 Applied Biosystems 公司)儀器上 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。分別用水稻內(nèi)源泛素(ubiquitin)基因的PCR引物ubiquitinF(5 ' -AACCAGCTGAGGCCCAAGA-3')和 ubiquitinR(5' -ACGATTGAITTAACCAGTCCATGA-3')擴(kuò)增的 樣品含量定量DNA樣品中含有的水稻細(xì)胞量,用稻瘟病菌內(nèi)源的基因 Pot2的PCR引物Pot2 F(5'-ACGACCCGTCTTTACTTATTTGG-3')和 Pot2R(5'-AAGTAGCGTTGGTTTTGTTGGAT-3')擴(kuò)增的 樣品含量定量DNA樣品中含有的稻瘟病菌細(xì)胞量。由于泛素基因在水稻中僅有1個(gè)拷貝而 Pot2基因在稻瘟病菌中有100個(gè)拷貝,所以感染率計(jì)算的公式為I = U(NubiquitinX 100) (Kawano 等,2010)。
[0042] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示接種稻瘟病菌后,感病對(duì)照C039對(duì)稻瘟病菌株RB11表現(xiàn)為感病,野 生型中花11 (對(duì)照)和05Z11DD35陰性植株(對(duì)照)的病情指數(shù)分別為15. 2和11. 5,而純 合PAL4基因 T-DNA插入突變體的病情指數(shù)為23(表1);說明與對(duì)照相比,抑制PAL4基因 功能造成抗性減弱(圖7的左圖)。同時(shí)基于DNA擴(kuò)增的實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果也顯示,純合 PAL4基因 T-DNA插入突變體的感染率要高于對(duì)照植株(圖7的右圖)。該結(jié)果說明PAL4 基因是一個(gè)在抗稻瘟病育種中有應(yīng)用前景的基因。
[0043] 表1. PAL4基因 T-DNA插入突變體(05Z11DD35)對(duì)稻瘟病菌株RB11的反應(yīng)
[0044]
【權(quán)利要求】
1. 一種增強(qiáng)水稻對(duì)從根部侵染的稻瘟病菌產(chǎn)生抗性的PAL4基因,其核苷酸序列如序 列表SEQ ID NO :1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的基因,其特征在于,所述的基因編碼對(duì)pH值和溫度敏感的苯丙氨 酸解氨酶,該苯丙氨酸解氨酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述的基因在增強(qiáng)水稻對(duì)從根部侵染的稻瘟病菌抗性中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/88GK104059930SQ201310086104
【公開日】2014年9月24日 申請(qǐng)日期:2013年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月18日
【發(fā)明者】王石平, 段柳 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)