專利名稱：可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的gck基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助診斷2型糖尿病的檢測(cè)試劑盒，尤其是涉及一種可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用
背景技術(shù)：
糖尿病是血中胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足，導(dǎo)致血糖過高，出現(xiàn)糖尿，進(jìn)而引起脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，臨床上可出現(xiàn)多尿、煩渴、多飲、多食，消瘦等表現(xiàn)，重者容易發(fā)生酮癥酸中毒等急性并發(fā)癥或血管、神經(jīng)等慢性并發(fā)癥。糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝性疾病，其患病率隨著生活條件的改善生活水平提高都呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前中國(guó)糖尿病患病人數(shù)接近一億，患病率高達(dá)9.7%。糖尿病不是單一疾病，是由遺傳及環(huán)境因素在內(nèi)的多種因素共同作用的結(jié)果。其中2型糖尿病發(fā)病人數(shù)約占糖尿病總發(fā)病人數(shù)的97%。2型糖尿病過去主要在超過40歲的成年人中發(fā)病，而現(xiàn)在2型糖尿病的發(fā)病正趨向低齡化。葡萄糖激酶(GCK)是影響2型糖尿病的重要基因，葡萄糖激酶(GCK)基因編碼葡萄糖激酶的生成，葡萄糖激酶可催化葡萄糖轉(zhuǎn)變成6-磷酸葡萄糖，是葡萄糖代謝的關(guān)鍵酶和限速酶。當(dāng)GCK基因編碼的葡萄糖激酶生成減少時(shí)，葡萄糖代謝會(huì)受影響，也不能維持血糖穩(wěn)態(tài)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)糖尿病機(jī)制的研究也越來越多。有研究背景表明基因的甲基化是在不改變DNA序列情況下，影響基因表達(dá)。但目前沒有研究闡述證明基因甲基化和與2型糖尿病存在相關(guān)性。同時(shí)，國(guó)內(nèi)外還沒有公開任何關(guān)于可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒的相關(guān)研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決 的技術(shù)問題是提供一種可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，其中GCK基因甲基化水平與男性人群2型糖尿病患病率呈正相關(guān)，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為:一種可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒，該試劑盒包括一對(duì)GCK基因甲基化特異性擴(kuò)增引物及甲基化特異性測(cè)序引物，其中
所述的甲基化特異性擴(kuò)增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示 5，-TGGATGGTTTAGTGTATAAGTTGTATT-3，
所述的甲基化特異性擴(kuò)增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示:
5，-Biotin-CACCTCATCCTCCACATTCAT-3，
所述的甲基化特異性測(cè)序引物如SEQ ID N0.3所示 5， -AAGTGGGGTTTAAAAAG-3，。一種可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒的應(yīng)用，在外周血檢測(cè)中，該試劑盒可用于男性人群2型糖尿病的輔助診斷、檢測(cè)或篩查藥物中。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明首次公開了可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，GCK基因高甲基化水平導(dǎo)致GCK基因的低表達(dá)，從而使與糖尿病密切相關(guān)的葡萄糖激酶表達(dá)減少，從而使體內(nèi)血糖發(fā)生變化導(dǎo)致胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)生。因此，GCK基因甲基化水平與2糖尿病的發(fā)生型呈正相關(guān)，以檢測(cè)GCK基因甲基化水平為基礎(chǔ)的診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)2型糖尿病的檢測(cè)，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)，同時(shí)，以GCK基因甲基化為靶點(diǎn)的藥物有望成為2型糖尿病輔助診斷、檢測(cè)和篩選的一種新手段。


圖1為GCK基因被檢測(cè)序列所在區(qū)域以及所檢測(cè)的4個(gè)CpG點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果(例如CpGl與CpG2的相關(guān)系數(shù)為0.685，CpG2與CpG3的相關(guān)系數(shù)為0.765)；
圖2為甲基化水平檢測(cè)結(jié)果示例，圖中所示百分?jǐn)?shù)為對(duì)應(yīng)CpG位點(diǎn)的甲基化程度，如圖示CpGl到CpG4的甲基化程度分別為43%，42%，53%，44%，圖中陰影部分顯示的是對(duì)應(yīng)CpG位點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)合該位點(diǎn)附近堿基種類可分析得到其甲基化水平(即陰影框?qū)?yīng)的上方數(shù)字);
圖3為在男性人群及女性人群中膽固醇與CpG4島的DNA甲基化程度的相關(guān)性線性圖； 圖4為總?cè)巳褐嘘P(guān)于CpG4島及CpGl-3島的甲基化水平的ROC曲線 圖5為男性人群中關(guān)于CpG4島及CpGl-3島的甲基化水平的ROC曲線 圖6為女性人群中關(guān)于CpG4島及CpGl-3島的甲基化水平的ROC曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
具體實(shí)施例1、研究對(duì)象的收集
從某醫(yī)院收集48例2型糖尿病患者(24名男性+24名女性)，同時(shí)也收集了年齡性別匹配的48例正常者作為對(duì)照(24名男性+24名女性)。2、基因組DNA的提取
應(yīng)用Lab-Aid 820全自動(dòng)核酸提取儀(中國(guó)廈門致善生物科技有限公司，500ul體系)提取樣本的全血基因組DNA，再通過核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)所得DNA的濃度，以供GCK基因DNA甲基化水平的檢測(cè)。3、DNA甲基化水平測(cè)定
本研究采用重亞硫酸鹽焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)GCK基因的4個(gè)CpG位點(diǎn)(如圖1)進(jìn)行了DNA甲基化水平檢測(cè)。此技術(shù)的基本原理:用試劑盒中的重亞硫酸鹽處理DNA樣品后，再應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，可使發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)堿基保持不變，而使未發(fā)生甲基化的C轉(zhuǎn)變成了尿嘧啶(U)，然后通過測(cè)序引物進(jìn)行PCR測(cè)序，從而得到哪個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了甲基化。本次研究采用PyroMark Assay Design軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì),用于實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增引物和測(cè)序引物如下:
(1)甲基化特異性上游引物(Forward primer):5’ -TGGATGGTTTAGTGTATAAGTTGTATT-3’ (SEQ ID N0.1),
(2)甲基化特異性下游引物(Reverseprimer):
5J -Biotin-CACCTCATCCTCCACATTCAT-3J (SEQ ID N0.2),
(3)甲基化特異性測(cè)序引物(Sequencingprimer)
5， -AAGTGGGGTTTAAAAAG-3，
上述擴(kuò)增的具體步驟為:
(1)采用QIAGEN EpiTect 亞硫酸氫鹽處理試劑盒(EpiTech Bisulfite Kits;Qiagen; #59104)對(duì)樣本DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；
(2)取步驟(I)中轉(zhuǎn)化過的DNA樣本20ng加入到PyromarkPCR試劑盒(Pyromark PCRKit; Qiagen; #978703)，并加入設(shè)計(jì)好的PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件:首先95°C 15分鐘的變性；接著95°C 15秒，Tm 30秒，72°C 20秒，共50個(gè)循環(huán)的退火反應(yīng)；然后延伸反應(yīng)72°C 5分鐘。(注:Tm在實(shí)驗(yàn)中根據(jù)跑PCR梯度溫度確定)
(3)焦磷酸測(cè)序的前期準(zhǔn)備:在PSQ96板中預(yù)先加入45μ I含有0.3 μ M測(cè)序引物的退火緩沖液；將需要使用的混勻的瓊脂糖凝膠磁珠總量(每樣本3 μ I)轉(zhuǎn)移到一個(gè)小離心管中；在瓊脂糖凝膠磁珠中加入結(jié)合緩沖液，使得平均每個(gè)樣品約有50 μ I的體積，將混合物混勻；將以上混合物加入PCR產(chǎn)物(50μ I反應(yīng)體積)中，每樣本50μ I ^fPCR產(chǎn)物在常溫下混勻10分鐘，使得磁珠與生物素結(jié)合； 在真空預(yù)備工作站中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml的高純水、70%乙醇、洗滌緩沖液和120ml的變形緩沖液；打開真空預(yù)備工作站的泵，將真空準(zhǔn)備工具在高純水中清洗30秒；然后將真空準(zhǔn)備工具移到PCR板中，抓取瓊脂糖凝膠磁珠(在磁珠與PCR產(chǎn)物結(jié)合后三分鐘內(nèi)完成此操作);拿起PCR板，檢查是否大部分beads都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上；將真空準(zhǔn)備工具放入70%乙醇中5秒；然后移到變形緩沖液中5秒；再移到洗滌緩沖液中清洗5 - 10秒；關(guān)掉泵；將真空準(zhǔn)備工具放入含有測(cè)序引物的板中，搖動(dòng)，釋放瓊脂糖凝膠磁珠(測(cè)序引物也可最后加入)；使用高純水清洗真空準(zhǔn)備工具；將放有樣品的PSQ96板放在ThermoPlate上加熱到80°C 2分鐘，再冷卻到室溫，即可進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)；
(4)焦磷酸測(cè)序:在PyroMarkQ24焦磷酸測(cè)序儀上,采用Pyromark Gold Q24試劑盒(Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)對(duì)步驟(3)的 PSQ96 板中的樣本進(jìn)行測(cè)序，然后應(yīng)用PyroMark CpG軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析(甲基化水平檢測(cè)結(jié)果示例見組圖3)。4、數(shù)據(jù)分析
本次研究采用SPSS 16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，我們發(fā)現(xiàn):被檢測(cè)的4個(gè)CpG位點(diǎn)，CpG2和CpG4之間沒有相關(guān)性(Ρ>0.05)，CpGl和CpG4之間有一定相關(guān)性(R=0.281，P=0.006)，CpG3 和 CpG4 之間有顯著相關(guān)性(R=0.438，P<0.001),其它(CpGl、CpG2、CpG3 )之間也有顯著相關(guān)性(R>0.5，P〈0.001)(如表I及圖1所示)，因此選取CpGl、CpG2、CpG3三個(gè)甲基化水平求平均值后參與到后續(xù)的分析中。從表2中可以看出，在總?cè)后w、男性群體、女性群體甲基化程度與2型糖尿病的相關(guān)程度是不相同。其中在總?cè)后w、男性群體、女性群體的病例對(duì)照中，年齡、膽固醇、甘油三脂、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿酸這四個(gè)表型及CpGl-3的平均DNA甲基化程度與2型糖尿病的發(fā)生沒有相關(guān)性。而CpG4 DNA甲基化程度在病例對(duì)照中有顯著的差異。在總?cè)巳褐蠧pG4位點(diǎn)甲基化程度在2型糖尿病患者與正常對(duì)照者中有差異，同時(shí)在男性群體中此差異更顯著，而在女性群體中幾乎無差異。即CpG4位點(diǎn)甲基化程度與2型糖尿病的發(fā)生有相關(guān)性，尤其是在男性群體中。另外在膽固醇和CpG4甲基化程度的相關(guān)性研究中，我們發(fā)現(xiàn)在男性群體中兩者成正相關(guān)(r=0.304，P=0.036)(如圖3所示)。通過SPSS 16.0軟件分析得到的ROC曲線(受試者工作特征曲線)圖中，不論是在總?cè)巳?圖4)還是男性人群(圖5)，女性人群(圖6)中，每條曲線下面積(AUC)都大于0.5，而由CpG4所代表的曲線下面積更大，尤其是在男性中此曲線的可信度更大(P=0.008)，這說明CpG4島的甲基化程度用來輔助診斷2型糖尿病有一定診斷價(jià)值。通過試劑盒檢測(cè)GCK基因甲基化程度來輔助診斷糖尿病是有一定意義，當(dāng)然在男性人群中更明顯。注:參考線即機(jī)會(huì)對(duì)角線，參考線下面積(AUC)為0.5，此線之下則該診斷方法完全沒有診斷價(jià)值。
通過試劑盒對(duì)甲基化程度的測(cè)量分析，我們發(fā)現(xiàn):在總?cè)后w中2型糖尿病患者與對(duì)照組之間有差別，在男性群體中則更有明顯的差別，即在男性群體中2型糖尿病患者的甲基化程度要明顯高于對(duì)照組。本發(fā)明可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒具有準(zhǔn)確可靠、靈活快速和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明采用上述試劑盒對(duì)GCK基因甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，能夠快速可靠地為2型糖尿病的輔助診斷、檢測(cè)或篩查藥物提供借鑒。上述說明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范 圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括一對(duì)GCK基因甲基化特異性擴(kuò)增引物及甲基化特異性測(cè)序引物，其中 所述的甲基化特異性擴(kuò)增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:5’ -TGGATGGTTTAGTGTATAAGTTGTATT-3’ ; 所述的甲基化特異性擴(kuò)增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示:5，-Biotin-CACCTCATCCTCCACATTCAT-3， 所述的甲基化特 異性測(cè)序引物如SEQ ID N0.3所示:5， -AAGTGGGGTTTAAAAAG-3，。
2.一種如權(quán)利要求1所述的可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于:在外周血檢測(cè)中，該試劑盒可用于男性人群2型糖尿病的輔助診斷、檢測(cè)或篩查藥物中。
全文摘要
本發(fā)明公開了可用于檢測(cè)與2型糖尿病相關(guān)的GCK基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，特點(diǎn)是該試劑盒包括一對(duì)GCK基因甲基化特異性擴(kuò)增引物及甲基化特異性測(cè)序引物，其中上游引物具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，下游引物具有如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，甲基化特異性測(cè)序引物如SEQIDNO.3所示，優(yōu)點(diǎn)是該診斷試劑盒可以方便快捷地在分子水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)2型糖尿病的檢測(cè)，檢測(cè)效率高，針對(duì)性強(qiáng)，同時(shí)，以GCK基因甲基化為靶點(diǎn)的藥物有望成為2型糖尿病輔助診斷、檢測(cè)和篩選的一種新手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103160582SQ20131008229
公開日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者湯琳琳, 段世偉, 王欽文, 張莉娜, 徐雷艇, 步世忠 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)