專利名稱：用于促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌及其微生物有機(jī)肥料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌及其微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生姜土傳枯萎病是一種典型的土傳病害，嚴(yán)重影響生姜的產(chǎn)量與質(zhì)量。生姜枯萎病主要危害地下塊莖，該病病原菌為姜尖孢鐮刀菌和腐皮尖孢鐮刀菌，在連作2 3茬后即可發(fā)病，連作5年后越發(fā)嚴(yán)重。如果沒(méi)有防控該病害的方法與途徑，生姜植株生長(zhǎng)將難以維繼。我們的研究結(jié)果表明，連作作物土傳枯萎病的關(guān)鍵問(wèn)題不是養(yǎng)分缺乏或不平衡，也不是土壤次生鹽潰化問(wèn)題，而是土壤中的微生物區(qū)系及其次生物質(zhì)的致毒問(wèn)題。我國(guó)作物秸桿就地焚燒、規(guī)?；B(yǎng)殖后的畜禽糞便隨地棄置等不僅嚴(yán)重污染了環(huán)境，也極大地浪費(fèi)了能作為有機(jī)肥和生物有機(jī)肥產(chǎn)品的原料；大量的養(yǎng)分資源流失于土壤-植物系統(tǒng)之外，明顯地削弱了我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的能力。如何將從土壤中因作物收獲而帶走的營(yíng)養(yǎng)元素最大限度地歸還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機(jī)廢棄物制成商品有機(jī)肥料再施入土壤。如果將這些固體有機(jī)廢棄物高溫發(fā)酵制備成腐熟堆肥，再將其用作制備生物(含特定有益微生物)有機(jī)肥料的載體將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。生物有機(jī)肥是指特定功能微生物與主要以動(dòng)植物殘?bào)w(如農(nóng)作物秸桿、畜禽糞便等)為來(lái)源并經(jīng)無(wú)害化處理、腐熟的有機(jī)物料復(fù)合而成的一類兼具微生物肥料和有機(jī)肥效應(yīng)的肥料。其本質(zhì)特征是含有特定功能的、表現(xiàn)出一定肥料效應(yīng)的有益微生物，這些特定有益微生物的生命活動(dòng)是生物有機(jī)肥優(yōu)于其它肥料的關(guān)鍵因素。大量研究表明:農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物有機(jī)肥在增強(qiáng)作物抗逆性、提供作物養(yǎng)分、增加肥效、改善作物對(duì)養(yǎng)分的吸收、調(diào)節(jié)土壤酸堿度等方面發(fā)揮著積極的作 用。本研究擬從生姜土傳枯萎病發(fā)病嚴(yán)重的田塊中生長(zhǎng)健康的生姜植株根系及根際土壤中篩選促生菌株，再與腐熟堆肥和其他合適載體采用合適的工藝生產(chǎn)促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的微生物有機(jī)肥料，為生姜規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
1.技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供用于促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌及其微生物有機(jī)肥料，防效高，并且有增產(chǎn)功能，使生姜連作生物障礙土壤得到生物修復(fù)，確保集約化農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。2.技術(shù)方案用于促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌NJPRHSDAQ-1，屬解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillus amyloliquefaciens), 2012年12月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，NJPRHSDAQ-1 菌種保藏號(hào)為；CGMCC N0.6963。NJPRHSDAQ-1菌株的主要生物學(xué)特性為菌體革蘭氏染色陽(yáng)性，桿狀，中生芽孢，兼性厭氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性、氧化酶陽(yáng)性、V.P.反應(yīng)陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，硝酸還原酶陽(yáng)性，淀粉水解陽(yáng)性，明膠水解陽(yáng)性。用上述促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌所生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料，該微生物有機(jī)肥料中含有I X IO8個(gè)/g以上的NJPRHSDAQ-1、全氮含量質(zhì)量比為4 5%,全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)含量質(zhì)量比為30 35%。所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其特征為:(I)將權(quán)利要求1所述的促生菌NJPRHSDAQ-1，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:培養(yǎng)液為NA培養(yǎng)基，pH7.0，發(fā)酵溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300/轉(zhuǎn)分鐘，發(fā)酵時(shí)間為48hr.，發(fā)酵液的含菌或芽孢量> I X 101°個(gè)/ml ;所用NA培養(yǎng)液配制方法為，以配制IL培養(yǎng)基為例:葡萄糖IOg,蛋白胨5g,酵母粉0.5g,牛肉膏3g,加蒸懼水定容至IOOOmL, pH 值調(diào)至 7.0，115°C滅菌 30min。(2)分別將NJPRHSDAQ-1發(fā)酵液按50L/噸的量接種到腐熟的豬糞堆肥和菜柏的微生物分解混合物中進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中每天翻堆I次，溫度不超過(guò)50°C，發(fā)酵5天，發(fā)酵結(jié)束后促生菌NJPRHSDAQ-1含量均達(dá)到I X IO8個(gè)/g以上，分別獲得含促生菌NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑和含促生菌NJPRHSDAQ-1的菜柏微生物分解混合物固體菌劑。所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)含量> 35%，有機(jī)氮含量為1.2-2.0%，含水量25-30%。菜柏的微生物酶解物制備方法為，將保藏號(hào)為CGMCCN0.1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發(fā)酵液加入到菜柏原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進(jìn)行開(kāi)放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時(shí)立即開(kāi)始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開(kāi)始后，堆物的PH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和pH，使它們分別維持在55-65%和6.0-7.0，發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物pH調(diào)整為5.0，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜柏的微生物酶解物。(3)再將含促生菌NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑和含促生菌NJPRHSDAQ-1的菜柏微生物分解混合物固體菌劑按體積比50-70%: 30-50%的比例充分混合，并后熟
2-3天，后熟過(guò)程中翻堆2次，最后在溫度不超過(guò)60°C的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為能促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的微生物有機(jī)肥。所述微生物有機(jī)肥料可專用于促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及生姜土傳枯萎病的生物防控。3.有益效果本發(fā)明與目前市場(chǎng)上的有機(jī)肥料產(chǎn)品相比具有如下優(yōu)點(diǎn):I)該肥料產(chǎn)品中含有促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及抑制生姜土傳枯萎病原真菌生長(zhǎng)的專一性高效菌株NJPRHSDAQ-1，其抑制效果非常顯著。盆 栽試驗(yàn)結(jié)果表明，生姜土傳枯萎病的防控率達(dá)到75%以上，如果在開(kāi)始種植生姜的土壤中連年施用本肥料產(chǎn)品，可以有效控制生姜土傳枯萎病的發(fā)生。2)該肥料為有機(jī)肥，含有豐富的有機(jī)質(zhì)(30 35% )，有機(jī)氮含量為4%，而且大部分為氨基酸和小分子多肽。本產(chǎn)品總磷含量為4%，而且生物有效性特別高，使用本產(chǎn)品后能使作物順利度過(guò)苗期磷素敏感期。3)由于是生物菌株制劑，完全沒(méi)有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來(lái)的一系列問(wèn)題，因而有利于蔬菜的無(wú)公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他防治疫病化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開(kāi)支，而且有利于農(nóng)產(chǎn)品的出口。同時(shí)，該微生物肥料還有增產(chǎn)功能，可為農(nóng)民增加收入。4)該微生物有機(jī)肥可以在營(yíng)養(yǎng)缽使用，也可以在大田使用，不僅具有有機(jī)肥的功能，而且其中所含的促生菌通過(guò)多種促生及生防機(jī)制起作用，從而達(dá)到促生及防控生姜土傳枯萎病的效果。
四

圖1NJPRHSDAQ-1菌株的拮抗效果圖2NJPRHSDAQ-1菌株的的盆栽效果(注:CK為對(duì)照，T為施用含有NJPRHSDAQ-1的微生物有機(jī)肥)
五具體實(shí)施例方式(一 )促生菌株的分離促生菌株的初篩:采集生姜連作田塊中健康生姜植株的根際土壤，采用PDA+NA加入生姜土傳枯萎病病原菌-尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)(從山東安丘生姜土傳枯萎病發(fā)病嚴(yán)重的田塊中采集的發(fā)病植株中經(jīng)分離純化所得，經(jīng)回接試驗(yàn)鑒定后證實(shí)為生姜土傳枯萎病病原菌)孢子懸液的雙層平板初篩目標(biāo)菌株，初篩共獲得14株目標(biāo)菌株，將菌種凍干_20°C保存，用于進(jìn)一步篩選。促生菌株的復(fù)篩:取初篩后的促生菌株和病原菌，在PDA平板上進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，進(jìn)行復(fù)篩。用打孔器(5_)從長(zhǎng)滿病原菌的平板上挖取一塊病原菌菌塊至PDA平板中央，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。ld(24h)后在PDA平板中央，距病原菌塊四周2cm處用滅菌牙簽接種待測(cè)目標(biāo)菌，28°C培養(yǎng)3 5d，觀察測(cè)試目標(biāo)菌菌落對(duì)病原菌的抑制情況。最終篩選得到菌株NJPRHSDAQ-1，其拮抗效果見(jiàn)圖1。( 二)促生菌株的鑒定促生菌株NJPRHSDAQ-1鑒定為解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillusamyloliquefaciens)。NJPRHSDAQ-1菌株的主要生物學(xué)特性為菌體革蘭氏染色陽(yáng)性，桿狀，中生芽孢，兼性厭氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性、氧化酶陽(yáng)性、V.P.反應(yīng)陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，硝酸還原酶陽(yáng)性，淀粉水解陽(yáng)性，明膠水解陽(yáng)性。(三)菌劑生產(chǎn) (I)將促生菌株NJPRHSDAQ-1，接種到NA培養(yǎng)液進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:pH7.0，發(fā)酵溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為48hr.，發(fā)酵液的含菌或芽孢量彡I X IOltl個(gè)/ml。(2)分別將NJPRHSDAQ-1發(fā)酵液按50L/噸的量接種到腐熟的豬糞堆肥和菜柏經(jīng)微生物分解混合物中進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中每天翻堆I次，溫度不超過(guò)50°C，發(fā)酵5天，發(fā)酵結(jié)束后促生菌NJPRHSDAQ-1含量均達(dá)到I X IO8個(gè)/g以上，獲得含促生菌株NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑、和含促生菌株NJPRHSDAQ-1的菜柏經(jīng)微生物分解混合物的固體菌劑。所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)含量> 35%，有機(jī)氮含量為
1.2-2.0 %，含水量 25-30 %。其中菜柏經(jīng)微生物分解混合物的制備方法為(公知公用，見(jiàn)發(fā)明專利ZL200610086126.0，一種農(nóng)用氨基酸的生物制取方法及其肥料產(chǎn)品)，菌株37_1發(fā)酵液加入到菜柏原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進(jìn)行開(kāi)放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時(shí)立即開(kāi)始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C (共5天)，固體發(fā)酵開(kāi)始后，堆物的PH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65 %和6.0-7.0，發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物pH調(diào)整為5.0左右，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜柏的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)_菜柏堆肥?！?3)再將含促生菌株NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑、和含促生菌株NJPRHSDAQ-1的菜柏經(jīng)微生物分解混合物的固體菌劑按體積比50-70%: 30-50%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟過(guò)程中翻堆2次，最后在溫度不超過(guò)60°C的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為能促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的微生物有機(jī)肥。該微生物有機(jī)肥料(促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控生姜土傳枯萎病的專用微生物有機(jī)肥)中含有I X IO8個(gè)/g以上的NJPRHSDAQ-1、全氮含量質(zhì)量比為4 5%，全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)含量質(zhì)量比為30 35%。(四)盆栽防效試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理:CK1-對(duì)照，未施用微生物有機(jī)肥料；T_施用含NJPRHSDAQ-1菌株的微生物有機(jī)肥料。微生物有機(jī)肥料用量:將催好芽的生姜移栽到生姜土傳枯萎病連作土壤中(生姜土傳枯萎病病原孢子達(dá)到I X 105/g 土)，處理T中按土重I %的用量施入微生物有機(jī)肥料。所有處理的氮磷鉀用量一致，常規(guī)管理。之后觀察其發(fā)病情況，記錄發(fā)病率，確認(rèn)促生菌株是否有抑制生姜枯萎病的效果。生姜植株培育30天后，發(fā)現(xiàn)CK (對(duì)照，未施微生物有機(jī)肥料)處理有發(fā)病植株，再過(guò)20天后,CK處理有80%的植株發(fā)病。生姜培育50天后的植株發(fā)病率和生姜土傳枯萎病的防控率結(jié)果如表I所示。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明:施用含有NJPRHSDAQ-1的微生物有機(jī)肥，能顯著增加生姜連作土壤中細(xì)菌和防線菌的數(shù)量，降低真菌的數(shù)量(表I)，有效防控生姜土傳枯萎病的發(fā)生，其防控率為75% (表2)。表I不同生物有機(jī)肥對(duì)生姜連作枯萎病土壤微生物區(qū)系的影響
權(quán)利要求
1.用于促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌，菌株 NJPRHSDAQ-1，為解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillus amyloliquefaciens)，2012 年 12 月 10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，NJPRHSDAQ-1菌種保藏號(hào)為:CGMCC N0.6963o NJPRHSDAQ-1菌株的主要生物學(xué)特性為菌體革蘭氏染色陽(yáng)性，桿狀，中生芽孢，兼性厭氧生長(zhǎng)，接觸酶陽(yáng)性、氧化酶陽(yáng)性、V.P.反應(yīng)陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，硝酸還原酶陽(yáng)性，淀粉水解陽(yáng)性，明膠水解陽(yáng)性。
2.用權(quán)利要求1所述用于促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌所生產(chǎn)的微生物有機(jī)肥料，該微生物有機(jī)肥料中含有l(wèi)X108cfu/g以上的NJPRHSDAQ-1、全氮含量質(zhì)量比為4 5%,全氮中質(zhì)量比90%以上為有機(jī)氮,總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機(jī)質(zhì)含量質(zhì)量比> 45%。
3.權(quán)利要求2所述微生物有機(jī)肥料的生產(chǎn)方法，其特征為: (1)將權(quán)利要求1所述的促生菌株NJPRHSDAQ-1，接種到NA培養(yǎng)液，進(jìn)行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:pH7.0，發(fā)酵溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時(shí)間為48hr.，發(fā)酵液的含菌或芽孢量> I X 101°個(gè)/ml ;所用NA培養(yǎng)液配制方法為:葡萄糖IOg,蛋白胨5g,酵母粉0.5g,牛肉膏3g,加蒸懼水定容至IOOOmL,pH值調(diào)至7.0,115°C 滅菌 30min。
(2)分別將NJPRHSDAQ-1發(fā)酵液按50L/噸的量接種到腐熟的豬糞堆肥和菜柏的微生物分解混合物中進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中每天翻堆I次，溫度不超過(guò)50°C，發(fā)酵5天，發(fā)酵結(jié)束后促生菌NJPRHSDAQ-1含量均達(dá)到I X 108cfu/g以上，分別獲得含促生菌NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑和含促 生菌NJPRHSDAQ-1的菜柏微生物分解混合物固體菌劑，其中: 腐熟后的豬糞堆肥:所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機(jī)質(zhì)質(zhì)量比含量彡45%，有機(jī)氮質(zhì)量比含量為1.2-2.0%，含水量質(zhì)量比25-30% ； 菜柏的微生物酶解物制備方法為，將保藏號(hào)為CGMCC N0.1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發(fā)酵液加入到菜柏原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進(jìn)行開(kāi)放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時(shí)立即開(kāi)始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開(kāi)始后，堆物的pH會(huì)不斷上升，每次翻堆時(shí)用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65%和6.0-7.0，發(fā)酵終止時(shí)再用含酸液體進(jìn)行噴灑，直至堆物PH調(diào)整為5.0，再進(jìn)行低溫干燥或自然涼干，即為菜柏的微生物酶解物； (3)再將含促生菌NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑和含促生菌NJPRHSDAQ-1的菜柏微生物分解混合物固體菌劑按體積比50-70%: 30-50%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟過(guò)程中翻堆2次，最后在溫度不超過(guò)60°C的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為能促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的微生物有機(jī)肥。
4.權(quán)利要求2所述微生物有機(jī)肥料在促進(jìn)生姜生長(zhǎng)和防控連作生姜土傳枯萎病方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于促進(jìn)生姜生長(zhǎng)及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌及其微生物有機(jī)肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明分離得到了一株促生菌NJPRHSDAQ-1，接種到腐熟的豬糞堆肥和菜粕的微生物分解混合物中進(jìn)行固體發(fā)酵制成微生物有機(jī)肥料，肥料中含有1×108cfu/g以上的促生菌、全氮含量為4～5％(90％以上為有機(jī)氮)，總氮磷鉀養(yǎng)分為6～10％、有機(jī)質(zhì)含量≥45％。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，生姜土傳枯萎病的防控率達(dá)到75％以上，如果在開(kāi)始種植生姜的土壤中連年施用本肥料產(chǎn)品，可以有效控制生姜土傳枯萎病的發(fā)生。
文檔編號(hào)C12R1/07GK103194405SQ20131008109
公開(kāi)日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者沈其榮, 黃啟為, 潘汝浩, 張楠 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)