專利名稱：鏈霉菌產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鏈霉菌產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
目前，工業(yè)生產(chǎn)上對于鏈霉菌的發(fā)酵多采用的是優(yōu)化單一拮抗物質(zhì)納他霉素的發(fā)酵方法。例如I960年，Cynamadi報道了用傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)納他霉素的方法。此后人們對于發(fā)酵納他霉素的研究很少，生產(chǎn)納他霉素直到近些年來才被人們重新拾起。1993年，M.A.艾森申克報道了生產(chǎn)納他霉素的方法。2002年，何艷玲等人對納他霉素產(chǎn)量的工藝進行了研究，在IOL自動發(fā)酵罐發(fā)酵條件下，最終使納他霉素的產(chǎn)量提高到疒3g/L。2010年，李衛(wèi)寧等，研究了褐黃孢鏈霉菌菌株WZ-18產(chǎn)納他霉素的培養(yǎng)條件及發(fā)酵培養(yǎng)基成分，優(yōu)化后，納他霉素產(chǎn)量達到3.51 g/L。但是，上述方法都是單一優(yōu)化鏈霉菌所產(chǎn)生的一種抗生素，通過抗生作用抑制病原菌而達到生物防治目的，但是沒有研究另一個重要拮抗因子幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生及作用。幾丁質(zhì)酶在生物防治中具有如下重要作用:(I)水解病原菌細胞壁；(2)提高植物的防御能力；(3)與其他防御反應(yīng)酶的協(xié)同增效作 用。因此很有必要研究納他霉素與幾丁質(zhì)酶協(xié)同表達方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有發(fā)酵技術(shù)只優(yōu)化一種拮抗物質(zhì)的不足，提供一種能夠有效誘導(dǎo)鏈霉菌協(xié)同產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法，實現(xiàn)了在一種培養(yǎng)基中同時誘導(dǎo)兩種拮抗物質(zhì)協(xié)同高效表達，使得發(fā)酵液抑菌活性大大增加。本發(fā)明通過不同時間添加不同誘導(dǎo)物解決了納他霉素產(chǎn)生的阻遏問題。本發(fā)明方法以鏈霉菌為研究對象，誘導(dǎo)其產(chǎn)生兩種拮抗物質(zhì)幾丁質(zhì)酶與納他霉素，實現(xiàn)了誘導(dǎo)抗性、降解病原菌細胞壁與抗生作用三種生防機制，可以防治多種作物病害，為新型復(fù)合生物農(nóng)藥的建立奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種鏈霉菌產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法，為:在一種培養(yǎng)基中不同時間分別添加納他霉素誘導(dǎo)物與幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物對鏈霉菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，在誘導(dǎo)初始階段添加納他霉素誘導(dǎo)物，在所述納他霉素誘導(dǎo)物消耗殆盡時，添加幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物。一種鏈霉菌產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法，包括以下步驟:
O將鏈霉菌在如下發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵:納他霉素誘導(dǎo)物40.38g/L，黃豆粉28.llg/L,大豆蛋白胨 14.91g/L，CaCO3 5g/L，MgSO4.7H20 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L ;發(fā)酵條件為:初始pH 6.0,3%的接種量，裝液量50/250mL，溫度28°C，轉(zhuǎn)速180r/min ；
2)在發(fā)酵第4天，納他霉素誘導(dǎo)物消耗殆盡時添加幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物llg/L；
3)發(fā)酵8天后得到發(fā)酵液。優(yōu)選地，所述納他霉素誘導(dǎo)物為葡萄糖。優(yōu)選地，所述幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物為幾丁質(zhì)粉。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下:
第一.本發(fā)明克服了傳統(tǒng)發(fā)酵過程中都是以提高單一抗生素產(chǎn)量為發(fā)酵目的，提出了一種誘導(dǎo)納他霉素與幾丁質(zhì)酶協(xié)同發(fā)酵的方法，具體通過在發(fā)酵初期添加納他霉素誘導(dǎo)物，發(fā)酵一段時間后待納他霉素誘導(dǎo)物消耗殆盡時，添加幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物，解決了納他霉素誘導(dǎo)物對于幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生過程的阻遏作用，大大促進了菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶的能力；
第二.本發(fā)明方法以鏈霉菌為研究對象，誘導(dǎo)其產(chǎn)生兩種拮抗物質(zhì)幾丁質(zhì)酶與納他霉素，實現(xiàn)了誘導(dǎo)抗性、降解病原菌細胞壁與抗生作用三種生防機制，可以防治多種作物病害，為新型復(fù)合生物農(nóng)藥的建立奠定了基礎(chǔ)；
第三.本發(fā)明的協(xié)同發(fā)酵思想還可用于其它生防菌發(fā)酵，能實現(xiàn)同一生防菌在同一種培養(yǎng)基中高效表達不同的拮抗物質(zhì)，通過不同的作用機制來達到協(xié)同防治病蟲害的目的。當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有優(yōu)點。
具體實施例方式下方結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述。
實施例本實施例采用的鏈霉菌為拮抗木霉菌株，利迪鏈霉菌A01-cAii33CT(,Streptomyces),來自上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點
實驗室。本實施例的鏈霉菌采用如下方法發(fā)酵培養(yǎng): O首先，將鏈霉菌在如下發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵:葡萄糖40.38g/L，黃豆粉28.Hg/L，大豆蛋白胨 14.91 g/L, CaCO3 5g/L，MgSO4.7H20 0.5g/L, K2HPO4 0.5g/L ;發(fā)酵條件為:初始pH 6.0,3%的接種量，裝液量50/250mL，溫度28。。，轉(zhuǎn)速180r/min ；
2)在發(fā)酵第4天，葡萄糖消耗殆盡時添加幾丁質(zhì)粉llg/L；
3)發(fā)酵8天后得到發(fā)酵液。該發(fā)酵液中納他霉素和幾丁質(zhì)酶產(chǎn)量分別達到2.32g/L和1049U/mL。由上述方法制備的發(fā)酵液為產(chǎn)納他霉素和幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基發(fā)酵液(標(biāo)記為I)與同樣條件下制備的不添加幾丁質(zhì)粉的單獨產(chǎn)納他霉素培養(yǎng)基發(fā)酵液(標(biāo)記為2)和單獨產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基發(fā)酵液(標(biāo)記為3)分別進行如下的田間防治植物病害的實驗，比較防治效果:
在番茄生長20d左右，先分別噴灑上述三種發(fā)酵液，空白對照組(標(biāo)記為CK)噴灑清水，發(fā)酵液或清水的噴灑程度以葉面滴水為宜，待葉面干后，再對上述四組樣品用同樣的方法噴施番茄灰霉病病原菌的孢子懸浮液，接種后放于22°C溫室，用塑料薄膜遮蓋保濕2d，并以加濕器加濕。待空白對照組發(fā)病后調(diào)查發(fā)病情況，根據(jù)下列公式計算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果，并對數(shù)據(jù)做方差分析。發(fā)病率(％)=發(fā)病葉數(shù)/調(diào)查總?cè)~數(shù)X 100
病情指數(shù)(％)=[(病級葉數(shù)X代表數(shù)值)]/ (調(diào)查的總?cè)~數(shù)X發(fā)病最重級的代表數(shù)值)XlOO
防治效果(％)=(對照病情指數(shù)一發(fā)酵液處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)X100 灰霉病的調(diào)查以葉片為單位，全部調(diào)查。參照農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥鑒定所生測室制定的《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則(一)》(1997)確定病害分級標(biāo)準(zhǔn):0級一無病斑；1級一單葉片有病斑3個；3級一單葉片有病斑4 6個；5級一單葉片有病斑7 10個；7級一單葉片有病斑11 20個，部分密集成片；9級一單葉片病斑密集占葉面積1/4以上。病情調(diào)查結(jié)果及鏈霉菌發(fā)酵液對番茄灰霉病的溫室防治效果如表I所示。該結(jié)果表明，鏈霉菌的培養(yǎng)基發(fā)酵液(標(biāo)號為1、2、3 )對番爺灰霉病具有很好的抑制作用，處理后的植物發(fā)病率和病情指數(shù)明顯低于對照(標(biāo)號為CK)。其中，產(chǎn)納他霉素和幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基發(fā)酵液(標(biāo)號為I)對番茄灰霉病的抑制作用相對更明顯，防治效果達78.9% ;單獨的產(chǎn)納他霉素培養(yǎng)基發(fā)酵液對番茄灰霉病的抑制作用次之，防治效果在70.3%左右，單獨的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶培養(yǎng)基發(fā)酵液對番茄灰霉病的抑制作用較弱，防治效果只有50%左右。表I鏈霉菌A01_chit33CT發(fā)酵液對番茄灰霉病的溫室防治效果
權(quán)利要求
1.一種鏈霉菌產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于，在一種培養(yǎng)基中不同時間分別添加納他霉素誘導(dǎo)物與幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物對鏈霉菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，在誘導(dǎo)初始階段添加納他霉素誘導(dǎo)物，在所述納他霉素誘導(dǎo)物消耗殆盡時，添加幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物。
2.一種鏈霉菌產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于，包括以下步驟: (O將鏈霉菌在如下發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵:納他霉素誘導(dǎo)物40.38g/L，黃豆粉28.llg/L，大豆蛋白胨 14.91g/L，CaCO3 5g/L, MgSO4.7H20 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L ;發(fā)酵條件為:初始pH 6.0,3%的接種量，裝液量50/250mL，溫度28。。，轉(zhuǎn)速180r/min ； (2)在發(fā)酵第4天，納他霉素誘導(dǎo)物消耗殆盡時添加幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物llg/L； (3)發(fā)酵8天后得到發(fā)酵液。
3.如權(quán)利要求2所述的鏈霉菌產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于，所述納他霉素誘導(dǎo)物為葡萄糖。
4.如權(quán)利要求2所述的鏈霉菌產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法，其特征在于，所述幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物為幾丁質(zhì)粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鏈霉菌產(chǎn)生納他霉素與幾丁質(zhì)酶的協(xié)同發(fā)酵方法，在一種培養(yǎng)基中不同時間分別添加納他霉素誘導(dǎo)物與幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物對鏈霉菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，在誘導(dǎo)初始階段添加納他霉素誘導(dǎo)物，在所述納他霉素誘導(dǎo)物消耗殆盡時，添加幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)物。本發(fā)明通過不同時間添加不同誘導(dǎo)物解決了納他霉素誘導(dǎo)物對于幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生過程的阻遏作用。本發(fā)明方法以鏈霉菌為研究對象，誘導(dǎo)其產(chǎn)生兩種拮抗物質(zhì)幾丁質(zhì)酶與納他霉素，實現(xiàn)了誘導(dǎo)抗性、降解病原菌細胞壁與抗生作用三種生防機制，可以防治多種作物病害，為新型復(fù)合生物農(nóng)藥的建立奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12R1/465GK103215327SQ201310081250
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者陳捷, 林振亞, 吳瓊, 馬佳, 余傳金, 高金欣, 范莉莉, 李雅乾 申請人:上海交通大學(xué)