一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法，屬真菌分子生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，其特征在于包括如下步驟：（1）提取待測煙曲霉菌株的總DNA；（2）選取RPB2基因作為分子標(biāo)記，即目的片段，設(shè)計(jì)特異性引物3條；（3）待測煙曲霉菌株目的片段PCR擴(kuò)增；（4）瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳檢測結(jié)果判斷待測菌株是否為煙曲霉菌。本發(fā)明的檢測方法能快速鑒定出煙曲霉菌，具有快速、準(zhǔn)確、高效的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法，屬真菌分子生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。 一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法

【背景技術(shù)】：
[0002] 真菌存在于幾乎所有的陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)中，與人類生產(chǎn)活動和生活關(guān)系密 切。許多真菌具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，但也有些種類的真菌會引起植物、動物和人類的病害或 產(chǎn)生毒素，會危害人類的健康。
[0003] 煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus)是自然界中廣泛存在的腐生真菌，也是重要 的機(jī)會致病菌。隨著免疫受損人群的增多，系統(tǒng)性曲霉病的90%是由煙曲霉菌引起的。同 時(shí)，煙曲霉菌產(chǎn)生的毒素嚴(yán)重污染糧食與飼料制品，危害人和動物的健康，造成重大的經(jīng)濟(jì) 損失，煙曲霉菌已成為臨床醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)微生物家們關(guān)注的熱點(diǎn)。
[0004] 煙曲霉菌的檢測技術(shù)經(jīng)歷了傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒別、層析法及色譜法等化學(xué)方法檢測、免 疫學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測等。
[0005] 近年來，隨著高效基因擴(kuò)增平臺、引物設(shè)計(jì)方案以及定量擴(kuò)增技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用， 包括真菌在內(nèi)的微生物快速檢測與鑒定對于病害診斷、監(jiān)測和防治具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測 方法，具有快速、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)。
[0007] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述目的的。
[0008] 本發(fā)明提供的一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法，包括如下步驟：
[0009] (1)提取待測煙曲霉囷株的總DNA ; _〇] (2)選取RPB2基因作為分子標(biāo)記，即目的片段，設(shè)計(jì)特異性引物3條，分別為：
[0011] 1)引物名稱 F2255,引物序列 CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG ;
[0012] 2)引物名稱 R3044,引物序列 TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT ;
[0013] 3)引物名稱 R3438,引物序列 CTGCCGGGTCAGAATCTGT ;
[0014] (3)待測煙曲霉菌株目的片段PCR擴(kuò)增；
[0015] (4)瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳檢測結(jié)果判斷待測菌株是否為煙曲霉菌。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有如下有益效果：
[0017] 本發(fā)明基于已公布的曲霉屬真菌煙曲霉、棒曲霉、費(fèi)氏曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑 曲霉、米曲霉和土曲霉等的基因組序列，通過基因組同源性分析，選擇RPB2基因作為研究 對象，根據(jù)RPB2基因存在的12個(gè)保守區(qū)域的序列比對結(jié)果和變異位點(diǎn)，篩選出可用于煙曲 霉快速鑒定的特異性引物。通過設(shè)計(jì)3條引物，對待測煙曲霉菌株的目的基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測方法判斷待測菌株是否為煙曲霉菌。

【具體實(shí)施方式】：
[0018] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0019] 1、待測曲霉菌株的培養(yǎng)
[0020] 待測曲霉菌樣品來源于中國科學(xué)院微生物研究所、北京大學(xué)真菌和真菌病研究中 心、吉林大學(xué)真菌研究中心，接種至PDA培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)箱28°C培養(yǎng)。
[0021] 2、待測曲霉菌株的DNA提取
[0022] 挑取直徑5mm的曲霉菌株菌絲塊接種至100ml 液體培養(yǎng)基中，室溫下?lián)u床培養(yǎng) (250rpm) 2-4周，收集菌體并用無菌生理鹽水沖洗數(shù)次，滅菌濾紙吸干。取0. lg菌體在液 氮中迅速研磨成粉末，用2%(w/v) CTAB緩沖液抽提DNA，0. 8%瓊脂糖凝膠檢測DNA樣品。
[0023] 3、目的片段PCR擴(kuò)增
[0024] PCR反應(yīng)在ABI2720PCR儀（美國加州ABI公司）上進(jìn)行，25 μ 1反應(yīng)體系包 括：超純水 17.5yl，10Xbuffer2.5yl，引物（ΙΟμΜ)各 Ιμ?，TaqDNA 聚合酶（1.25U/ μ 1)0. 5μ 1，dNTP(2. 5πιΜ)1μ 1，模板 DNAly 1。
[0025] PCR反應(yīng)條件為：94° C預(yù)變性4min;94° C變性30s，66° C(或64° C)退火 30s，72° C 延伸 45s，30 個(gè)循環(huán)；72° C 延伸 7min。
[0026] 引物列表： 引物名稱引物序列(5' -3'） F2255 CCMCAAGCGTGTTCGTTCAG
[0027] R3044 TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT R3438 CTGCCGGGTCAGAATCTGT
[0028] 4、瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0029] 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，引物F2255-R3044和F2255-R3438的擴(kuò)增產(chǎn) 物分別約800bp和1200bp。
[0030] 5、序列測定驗(yàn)證
[0031] 目的片段PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司，ABI3730XL測序儀雙 向測序。
[0032] 弓丨物F2255/R3044擴(kuò)增煙曲霉得到的序列為790bp :
[0033] CCAACAAGCGTGTTCGTTCAGTCCTCAGTCAAAAGGCACACACTTGGACGCATTGCGAGATTCACC
[0034] CCAGTATGATTCTTGGTGTTTGTGCCAGTATCATTCCCTTCCCGGACCACAACCAGTCGCCTCGTA
[0035] ATACCTACCAGTCTGCAATGGGCAAACAAGCCATGGGTGTGTTTTTGACCAACTTTGACCAACGAA
[0036] TGGAGACAATGGCAAATATTCTCTATTACCCGCAGAAACCGCTAGCCACAACACGGTCCATGGAAT
[0037] TCCTTCGATTCCGTGAACTACCAGCTGGGCAGAATGCCATCGTCGCCATTGCTTGCTACTCCGGAT
[0038] ACAACCAAGAAGATTCGGTCATCATGAACCAGAGCAGCATCGATCGTGGTCTCTTCCGAAGTCTCT
[0039] TCTATCGCACATACACGGATAGCGAGAAAATGGTTGGCCTGACTGTTGTCGAGCGGTTTGAGAAGC
[0040] CCATGCGCTCGGATACGATCGGTATGAGAAAGGGCACCTACGATAAGCTCGATGAGGACGGTATCA
[0041] TTGCCCCTGGTGTGCGTGTCTCCGGAGAGGATATTATCATCGGCAAGACCGCCCCGTTGGCACCCG
【權(quán)利要求】
1. 一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 提取待測煙曲霉囷株的總DNA ; (2) 選取RPB2基因作為分子標(biāo)記，即目的片段，設(shè)計(jì)特異性引物3條； (3) 待測煙曲霉菌株目的片段PCR擴(kuò)增； (4) 瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳檢測結(jié)果判斷待測菌株是否為煙曲霉菌。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速鑒定煙曲霉菌的檢測方法，其特征在于設(shè)計(jì)特異性 引物3條，分別為： 1) 引物名稱 F2255,引物序列 CCAACAAGCGTGTTCGTTCAG ; 2) 引物名稱 R3044,引物序列 TGTCCGTGACGAGAGGCAAAT ; 3) 引物名稱 R3438,引物序列 CTGCCGGGTCAGAATCTGT。
【文檔編號】C12Q1/04GK104046681SQ201310078921
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月13日
【發(fā)明者】余知和, 曾昭清, 周建芬, 程云方 申請人:長江大學(xué)