專利名稱：一種定量測定血液循環(huán)dna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血液循環(huán)DNA測定技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種定量測定血液循環(huán)DNA的方法。
背景技術(shù)：
血液循環(huán)DNA (Circulating DNA, ctDNA)，又稱游離 DNA 或無細胞 DNA (Cell-freeDNA)，主要來源于細胞的凋亡和死亡?？勺鳛槟[瘤、自身免疫病及胎兒遺傳學檢測的依據(jù)。目前的檢測方法均需要先從血清或血漿中提取DNA，然后擴增基因組中某個基因的方式，計算ctDNA的濃度或基因組拷貝數(shù)。由于個體間、不同病理狀態(tài)間ctDNA含量及片段完整程度存在較大差異，即便不考慮操作者的因素，所用提取方法和試劑的不同就會造成提取效率存在巨大差別。在此基礎(chǔ)上的ctDNA測定結(jié)果誤差會更大。但直接用血漿或血清擴增，血清或血漿中含有的蛋白質(zhì)等會嚴重干擾PCR，使標本間的擴增效率不一致。此外，以SYBR Green為染料的定量PCR技術(shù)存在熒光染料信號強度低，靈敏度不高，對于低拷貝數(shù)的模板不容易檢測到。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服以上技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種快速準確的定量測定血液循環(huán)DNA的方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為，一種定量測定血液循環(huán)DNA的方法，其步驟如下:1、取Iml同一個腫瘤患者外周靜脈血，置于EDTA抗凝管中，10°C _20°C靜置4小時，2000g離心5分鐘，取上層血漿100ul-200ul，加入相同體積的緩沖液，充分混勻，95°C靜置5-10分鐘，16000g離心10分鐘，取上清液為模板直接用于定量PCR擴增；2、取IOul上述處理后的血漿DNA，加入90ul的0.5X緩沖液稀釋10倍，再取IOul稀釋后的血漿DNA，加入90ul的0.5 X緩沖液再稀釋10倍，依次稀釋下去，制備出不同稀釋倍數(shù)的血漿；3、分別取2ul不同稀釋倍數(shù)的血漿直接進行定量PCR擴增，取PCR體系共20ul，包括快速復活熱啟動DNA聚合酶Iul、SuperGreen染料Iul、2x混合物IOul、終濃度為300nM的引物4ul以及H204ul ；95°C 5分鐘；95°C 5秒，60°C 20秒，72°C 20秒，重復45個循環(huán)；4、得出 Cp 值為 23.51±0.03,26.87±0.03,30.45±0.12。進一步，所述2x混合物包括2x反應緩沖液、終濃度為3mM的氯化鎂、三磷酸脫氧核苷。進一步，所述三磷酸脫氧核苷包括終濃度均為0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。進一步，所述不同稀釋倍數(shù)的血漿的稀釋倍數(shù)為1: 1、1: 10或者1: 100。進一步，進行定量PCR擴增使用ROCHE LightCycler480定量PCR儀。本發(fā)明所產(chǎn)生的有益效果為:1、通過特殊的技術(shù)工藝處理，可以直接用血漿或血清進行定量PCR反應，不影響PCR反應，擴增效率與提純DNA相比一致，減少了 DNA提取步驟和實驗誤差。2、采用新型的突光染料SuperGreen,對PCR擴增過程中的抑制作用更輕微,可使用較高濃度，熒光信號值高、反應靈敏度高可精確檢測出低至納克水平的血漿游離DNA。
3、試劑價錢便宜，減少了使用DNA提取試劑盒的費用等，操作簡便。4、可用于大規(guī)模腫瘤高危人群篩查、腫瘤的早期診斷及療效預后的動態(tài)觀察。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
進行詳細說明圖1為患者ctDNA的PCR擴增后的熒光信號分析2為血漿ctDNA含量與熒光強度的相關(guān)性曲線圖
具體實施例方式下面結(jié)合實例，對本發(fā)明進一步說明。1.直接用血漿檢測ctDNA與提純的DNA為模板的擴增效率幾乎一致；證明直接用血漿進行定量PCR反應，不影響PCR反應的效率，同時減少了 DNA提取步驟和實驗誤差。(I)取Iml同一個腫瘤患者外周靜脈血，置于EDTA抗凝管中，10°C _20°C靜置4小時，2000g離心5分鐘，取上層血漿100ul-200ul，加入相同體積的緩沖液，充分混勻，95°C靜置5-10分鐘，16000g離心10分鐘，取上清液為模板直接用于定量PCR擴增；(2)取IOul上述處理后的血漿DNA，加入90ul的0.5 X緩沖液稀釋10倍，再取IOul稀釋后的血漿DNA，加入90ul的0.5 X緩沖液再稀釋10倍，依次稀釋下去，制備出不同稀釋倍數(shù)的血漿；所述 不同稀釋倍數(shù)的血漿的稀釋倍數(shù)為1: 1、1: 10或者1: 100。(3)分別取2ul不同稀釋倍數(shù)的血漿直接進行定量PCR擴增，進行定量PCR擴增使用ROCHE LightCycler480定量PCR儀，取PCR體系共20ul，包括快速復活熱啟動DNA聚合酶Iul、SuperGreen染料Iul、2x混合物IOul、終濃度為300nM的引物4ul以及H204ul ；95°C 5分鐘；95°C 5秒，60°C 20秒，72°C 20秒，重復45個循環(huán)；所述2x混合物包括2x反應緩沖液、終濃度為3mM的氯化鎂、三磷酸脫氧核苷。所述三磷酸脫氧核苷包括終濃度均為0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。(4)得出 Cp 值為 23.51 ±0.03,26.87±0.03,30.45±0.12。如圖1和圖2所示為DNA含量與熒光強度呈明顯線性關(guān)系，計算擴增效率為
1.948，線性關(guān)系R2 = 99.97% ;與提純的DNA為模板的擴增效率幾乎一致；證明直接用血漿進行定量PCR反應，不影響PCR反應的效率，同時減少了 DNA提取步驟和實驗誤差。2、與傳統(tǒng)DNA提取后擴增法比較將5個患者血漿(2ml)均先分為A、B兩份，然后在A份中加入已知量的人基因組DNA (來源于WBC)，終濃度為100ng/ml，然后將血漿再一分為二(A1、A2和B1、B2)，標為Al/BI的樣本Omega公司的游離DNA提取試劑盒提取血漿ctDNA，標為A2/B2的樣本采用本技術(shù)處理，然后進行定量PCR測定，血漿ctDNA含量均換算為ng/ml，Al-Bl為經(jīng)DNA提取的外源DNA測定值，A2-B2為本技術(shù)直接測定的外源DNA含量。結(jié)果:使用試劑盒提取的血漿DNA通過PCR定量檢測后，外源DNA的摻入量為48.8 + 10.2ng/ml ;本方法測定的外源DNA摻入量為103.2±3.6ng/ml。傳統(tǒng)DNA提取后測定法CV值為20.9%，測定值為實際摻入量的48.8%。本方法測定CV值為3.5%，測定值基本和摻入量一致。表明本技術(shù)不僅操作方便，節(jié)省費用 ，而且可以顯著提高檢測的精密度和準確度。
權(quán)利要求
1.一種定量測定血液循環(huán)DNA的方法，其特征在于，其步驟如下: (1)取Iml同一個腫瘤患者外周靜脈血，置于EDTA抗凝管中，10°C_20°C靜置4小時，2000g離心5分鐘，取上層血漿100ul-200ul，加入相同體積的緩沖液，充分混勻，95°C靜置5-10分鐘，16000g離心10分鐘，取上清液為模板直接用于定量PCR擴增； (2)取IOul上述處理后的血漿DNA，加入90ul的0.5 X緩沖液稀釋10倍，再取IOul稀釋后的血漿DNA，加入90ul的0.5 X緩沖液再稀釋10倍，依次稀釋下去，制備出不同稀釋倍數(shù)的血漿； (3)分別取2ul不同稀釋倍數(shù)的血漿直接進行定量PCR擴增，取PCR體系共20ul，包括快速復活熱啟動DNA聚合酶lul、SuperGreen染料Iul、2x混合物IOul、終濃度為300nM的引物4ul以及H204ul ；95°C 5分鐘；95°C 5秒，60°C 20秒，72°C 20秒，重復45個循環(huán)；(4)得出Cp 值為 23.51±0.03,26.87±0.03,30.45±0.12。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定血液循環(huán)DNA的方法，其特征在于，所述2x混合物包括2x反應緩沖液、終濃度為3mM的氯化鎂、三磷酸脫氧核苷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定血液循環(huán)DNA的方法，其特征在于，所述三磷酸脫氧核苷包括終濃度均為0.4mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定血液循環(huán)DNA的方法，其特征在于，所述不同稀釋倍數(shù)的血漿的稀釋倍數(shù)為1: 1、1: 10或者1: 100。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量測定血液循環(huán)DNA的方法，其特征在于，進行定量PCR擴增使用 ROCHE LightCycler480 定量 PCR 儀。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種定量測定血液循環(huán)DNA的方法，取1ml同一個腫瘤患者外周靜脈血，置于EDTA抗凝管中，10℃-20℃靜置4小時，2000g離心5分鐘，取上層血漿100ul-200ul，加入相同體積的緩沖液，充分混勻，95℃靜置5-10分鐘，16000g離心10分鐘，取上清液為模板直接用于定量PCR擴增；本發(fā)明所產(chǎn)生的有益效果為1、通過特殊的技術(shù)工藝處理，可以直接用血漿或血清進行定量PCR反應，不影響PCR反應，擴增效率與提純DNA相比一致，減少了DNA提取步驟和實驗誤差。2、采用新型的熒光染料SuperGreen，對PCR擴增過程中的抑制作用更輕微，可使用較高濃度，熒光信號值高、反應靈敏度高可精確檢測出低至納克水平的血漿游離DNA。
文檔編號C12Q1/68GK103146826SQ20131007203
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者宋現(xiàn)讓 申請人:宋現(xiàn)讓