專利名稱：農(nóng)桿菌介導的侵染月季芽點轉基因的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程中對植物進行轉基因的方法，特別是涉及一種農(nóng)桿菌介導的侵染月季芽點轉基因的方法。
背景技術：
將外源基因或者經(jīng)過修飾后的內(nèi)源基因轉入植物體內(nèi)以改變植物某一特性，是改善作物品質(zhì)的重要途徑。自1983年首次培育出世界第一個轉基因植物一轉基因煙草以來，科學家試圖不同的轉基因方法，將外源基因或經(jīng)體外修飾后的內(nèi)源基因?qū)胫参铮牧贾参锏男誀?，并探索出了多種植物轉基因方法?；?qū)胫参锏姆椒ㄖ饕袃纱箢?根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化和DNA直接導入的轉化法，后者主要包括基因槍法、花粉管通道法、子房注射法、PEG法、電 擊法、陽離子轉化法、超聲波介導法等。目前絕大部分的轉基因木本植物都是通過農(nóng)桿菌侵染來進行的，也有一些植物用基因槍法，還可以通過電擊法和PEG[1_3]法用原生質(zhì)體進行轉化。從目前的研究來看，農(nóng)桿菌介導的木本植物轉基因技術更加成熟有效，還沒有一個更好的直接轉化的方法可以代替它。在進行農(nóng)桿菌介導的轉基因試驗時，要根據(jù)植物種類來挑選不同的農(nóng)桿菌，環(huán)境因子如溫度、PH值也會對轉化效率產(chǎn)生影響[4]。采用一些特殊處理也會影響轉化效率，Yu等發(fā)現(xiàn)將桔子的上胚軸徑向切開，可以顯著提高轉化效率[5]。從細胞全能性的理論出發(fā)，所有外植體均可以作為受體進行轉基因試驗。目前應用較多的外植體有葉片、葉柄、上胚軸、下胚軸、子葉、胚、胚性愈傷組織、體細胞胚、原生質(zhì)體等材料。Pythoud等在1987詳細研究了根癌農(nóng)桿菌對針葉樹細胞的侵染過程，發(fā)現(xiàn)雖然被侵染部位不一定被誘導出明顯的腫瘤，但Ti質(zhì)粒上的部分DNA片斷是可以轉移到針葉樹細胞中去[6]。Pena等在2001年將LFY和APl基因?qū)氲借壮戎?，縮短了植株的童期，促使植株提前開花，且這些性狀在后代中也得到了穩(wěn)定的表達。Costa等在2002年成功將幾種與類胡蘿卜素合成有關的基因轉入到柚子中，提高了轉基因植株胡蘿卜素的表達水平。2005年葉霞等獲得了轉鐵結合蛋白(Ferritin)基因的蘋果，該基因已經(jīng)在植株葉片中得至IJ表達m。對柑橘的研究表明，相同條件下，未成熟外植體的轉化效率要比成熟外植體的轉化效率高。但如果選用未成熟的外植體，還需要等待相當長的時間才能開花結果，因此選用合適的外植體，提高成年外植體的轉化效率或者縮短外植體的童期都是比較可行的方法。距今為止，有關月季轉基因的報道還很少，目前只有日本學者在2007年利用月季莖尖分生組織為外植體通過農(nóng)桿菌介導的植物轉基因方法通過篩選成功的獲得了開藍色花的月季轉基因植株M，但是并沒有詳細介紹其轉基因的過程。由以上報道不難看出，木本植物尤其是月季轉基因的完善的體系還沒有完全建立，本專利所發(fā)明的這種月季莖尖生長點轉基因方法克服了以前方法周期長、操作復雜、成本高的缺陷，優(yōu)化了木本植物轉基因過程，簡化了木本植物轉基因的操作，并探索出了木本植物基因高轉化率的新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種農(nóng)桿菌介導的侵染月季芽點轉基因的方法。將月季的枝條沖洗干凈，經(jīng)過消毒處理后剪成2 4cm的莖段，隨后在超凈臺中將莖段形態(tài)學的下端插入MS固體培養(yǎng)基上。待莖段上長出芽點時，將其從莖段上切下，用刀片將芽點劃傷，然后將其浸入農(nóng)桿菌侵染液中，通過抽真空處理后，將浸染過農(nóng)桿菌侵染液的芽點接種在MS固體培養(yǎng)基上進行共培養(yǎng)，共培養(yǎng)后再經(jīng)過篩選得到轉基因陽性植株，經(jīng)過生根后將其移栽至溫室，本發(fā)明避免了通過單細胞和愈傷組織的植株再生的繁雜過程，縮短了木本植物的童期，簡便快捷，轉化的后代可直接成株，克服了現(xiàn)有技術中工作量大、耗時長的植物組織培養(yǎng)過程。木本植物芽點轉基因技術體系構建時間較現(xiàn)有技術顯著縮短，轉化效率也較高，不受季節(jié)影響，可應用于各種常見的木本植物，因此對木本植物遺傳育種具有重大意義。本發(fā)明提供的一種農(nóng)桿菌介導的侵染月季芽點轉基因的方法包括如下步驟:
獲得木本植物芽點轉基因所需無菌莖段；將莖段接種至MS固體培養(yǎng)基使其長出芽點；
將芽點從莖段上切下，并將其劃傷；制備用于木本植物芽點轉基因的農(nóng)桿菌侵染液B ;真空條件下用侵染液B侵染受傷的芽點；然后將侵染過根癌農(nóng)桿菌侵染液B的芽點及根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；將共培過的芽點接種在篩選培養(yǎng)基C上進行篩選培養(yǎng)；經(jīng)過篩選后的生根苗移栽至溫室中；對經(jīng)過木本植物芽點轉基因的木本植物植株做分子檢測；具體步驟:
I)外植體莖段的制備:將月季的莖桿或枝條的葉子去除掉，先用自來水沖洗1(Γ30分鐘，用剪刀將其剪成2飛cm的莖段，接著用75%的乙醇溶液浸泡30秒進行表面消毒，用無菌水沖洗2 4次，再用2% (m/v)的次氯酸鈉浸泡8 10分鐘，然后用無菌水沖洗4次以上后所得的無菌莖段。2)外植體莖段的培養(yǎng):將無菌月季的莖段接種至經(jīng)過高溫高壓滅菌的MS固體培養(yǎng)基中，使其長出芽點。使其長出 芽點是指在無菌操作的條件下將無菌的月季莖段形態(tài)學的下端插入經(jīng)過高溫高壓滅菌的MS固體培養(yǎng)基中，使莖段直立在培養(yǎng)基中，將其密封好，放在組培室中培養(yǎng)7天左右，待莖段上長出長度為0.5cm左右的幼芽。3)外植體芽點的獲得:在無菌操作的條件下將長有幼芽的月季莖段從MS固體培養(yǎng)基中取出放在無菌濾紙上，用無菌的刀片將芽點從莖段上切下或剝落，然后用無菌刀片或無菌的7號針頭將月季幼芽的生長點劃傷或刺傷。4)侵染液B的制備:挑取攜帶有質(zhì)粒pCambia2300的根癌農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于50ml卡那霉素濃度為100mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，水浴搖床28攝氏度、150轉/分鐘，12^16小時，培養(yǎng)至根癌農(nóng)桿菌菌液0D_=0.6^0.8時，取出后在離心機上以4000轉/分鐘的轉速離心10分鐘后將上清倒掉，然后加入與上清液等體積的MS液體培養(yǎng)基后將農(nóng)桿菌充分懸浮后所得的懸濁液。5)外植體芽點與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)和轉化:將劃傷或刺傷的月季的幼芽浸泡在浸染液c中，保持無菌的情況下放入真空泵，打開真空泵處理20-30分鐘；將浸染過的幼芽先用無菌的MS液體培養(yǎng)基沖洗一次，放在無菌濾紙上晾干后接種在MS固體培養(yǎng)基上在25-30攝氏度、黑暗條件下培養(yǎng)3-7天。6)抗性芽的篩選:將經(jīng)過共培養(yǎng)的芽點在無菌條件下從MS固體培養(yǎng)基上轉移至含有100mg/L的硫酸卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上，每隔20天更換一次含硫酸卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基，直至未轉基因的幼芽全部死掉。7)抗性植株的馴化與篩選:將經(jīng)篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后仍存活的植株移植至新的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2-3周至生根后將其從培養(yǎng)基中取出，用自來水將根部培養(yǎng)基沖洗干凈后移栽至花盆的栽培基質(zhì)(蛭石:珍珠巖:營養(yǎng)土 = 4:1:1)中，經(jīng)過一周的馴化，其光照強度4500 Lx, 250C，光周期為晝/夜=12h/12h，空氣濕度80%，后放入溫室中，以后每周澆水2 3次。8)轉基因植株的分子生物學鑒定:對所得月季植株進行基因組PCR檢測，并對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析驗證。所述的單菌落為通過平板劃線的方法在含有100mg/L硫酸卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上分離出來的生長最快的菌落。所述的含100mg/L的LB液體培養(yǎng)基組成為:10g/L胰蛋白胨(Tryptone) +5g/L酵母提取物(Yeast extract) +10g/L氯化鈉(NaCl) +pH5.4 (高壓滅菌處理冷卻至50攝氏度后)+ 100mg/L 硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)。所述的含100mg/L的LB固體培養(yǎng)基是指:10g/L胰蛋白胨(Tryptone) +5g/L酵母提取物(Yeast extract) +10g/L氯化鈉(NaCl) +15g/L瓊脂+ρΗ5.4 (高壓滅菌處理冷卻至50攝氏度后)+ 100mg/L硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)。本發(fā)明提供的一種農(nóng)桿菌介導的侵染月季芽點轉基因的方法，避免了組織培養(yǎng)和植株再生的繁雜過程，簡便快捷，轉化的后代可直接成株，省掉現(xiàn)有技術中工作量大、耗時長的植物組織培養(yǎng)階段。生產(chǎn)周期短，操作簡單，便于管理和控制，且轉化率高(4%左右)，成活率也高，是一種低成本、具有較大推廣價值的轉基因方法。



圖1質(zhì)粒pCambia2300不意圖。圖2為用木本植物月季芽點轉基因的方法轉入JicA#基因后植物基因組PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果(500bp左右)。圖中M:markerIII ; P:正對照；WT:負對照1- 13為木本植物芽點轉基因處理后轉基因月季基因組PCR瓊脂糖凝膠電泳結果圖，圖中490bp處條帶為檢測到的目的基因條帶；1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13是木本植物芽點轉基因月季基因組PCR陽性植株。
具體實施方式
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本發(fā)明參照實施例詳細說明如下:
本發(fā)所述的的質(zhì)粒pCambia2300(商業(yè)化購買)為圖2所示，其上的T- DNA區(qū)含有新霉素磷酸轉移酶基因糖II,為載體本身攜帶),Atchyb基因為本實驗室連接上去的目的片段，其序列網(wǎng)上已公布。所述的根癌農(nóng)桿菌為EHA105 (為本實驗室保藏菌株，其特征在互連網(wǎng)上已經(jīng)公布)。實施例1
I)用于月季芽點轉基因的方法根癌農(nóng)桿菌EHA105菌液的獲得:載體pCambia2300-Atchyb的構建及轉化根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞過程如下:以基因(網(wǎng)上已公布其序列號)為模板，上下游引物兩端分別引入BamH I和Pst I酶切位點進行PCR擴增。然后，PCR產(chǎn)物與pCambia2300質(zhì)粒分別BamH I和Pst I雙酶切，將二者酶切產(chǎn)物連接:16°c，連接16h。連接產(chǎn)物轉化raWi Competent Cell (購買于天根生化科技有限公司Cat#CB104，Lot#J8713)，涂布于含卡那霉素的LB平板。以目的基因為模板進行PCR得到490bp產(chǎn)物，用BamH I和Pst I酶切鑒定得到1209bp目的條帶，最后測序驗證結果表明載體構建正確。然后將構建好的質(zhì)粒載體通過電激轉化的方法轉入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中，設置電擊轉化參數(shù)為25 yF,400 olm, 1500 V, 5 ms。1將攜帶質(zhì)粒pCambia2300_Atchyb (如圖2所示)土壤根癌農(nóng)桿菌EHA105復壯，挑取_80°C保存的菌種，取少許冰凍的菌塊接種于IOml含硫酸卡那霉素100mg/L的培養(yǎng)基a 上，28°C，150r/min，水浴搖床遙至菌液 OD6tltl=0.6 1.0。培養(yǎng)基a:10g/L胰蛋白胨(Tryptone) +5g/L酵母提取物(Yeast extract) +IOg/L 氯化鈉(NaCl) + 100mg/L 硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate) + ρΗ5.4。I平板劃線分離生長狀態(tài)優(yōu)良的ΕΗΑ105菌株
用接種環(huán)蘸取培養(yǎng)好的菌液在含有相應抗生素的培養(yǎng)基b上接種，放入28°C恒溫培養(yǎng)箱，黑暗條件下培養(yǎng)三天后觀察菌落生長情況。培養(yǎng)基b: 10g/L 胰蛋白胨(Tryptone) +5g/L 酵母提取物(Yeast extract)+10g/L 氯化鈉(NaCl)+15g/L 瓊脂(agar)+ 100mg/L 硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate)+pH5.4。'T挑取最大且邊緣光滑的一個農(nóng)桿菌EHA105菌落接種在裝有50ml的培養(yǎng)基B的玻璃三角瓶中，放在28°C、150轉/分鐘的水浴搖床培養(yǎng)12 16小時，待菌液達到最適浸染濃度OD6qq=0.6^0.8時取出備用。2)獲得月季芽點轉基因的所需的無菌莖段
將月季的莖桿或枝條的葉子去除掉，先用自來水沖洗15分鐘左右，用剪刀將其建成2飛cm的莖段，接著用75%的乙醇溶液浸泡30秒進行表面消毒，用無菌水沖洗2 4次，再用2% (m/v)的次氯酸鈉浸泡8 10分鐘，然后用無菌水沖洗4次以上后的莖段。3)將莖段接種至固體MS培養(yǎng)基上使其長出芽點；
在無菌操作的條件下將無菌的月季莖段形態(tài)學的下端插入經(jīng)過高溫高壓滅菌的固體MS培養(yǎng)基中，使莖段直立在培養(yǎng)基中，將其密封好，放在組培室中培養(yǎng)7天左右，待莖段上長出長度為0.5cm左右的幼芽。4)將芽點從莖段上切下，并將其劃傷
在無菌操作的條件下將長有幼芽的莖段從培養(yǎng)基中取出放在無菌濾紙上，用無菌的刀片將芽點從莖段上切下或剝落，然后用無菌刀片或無菌的7號針頭將幼芽的生長點劃傷或刺傷，使其易于農(nóng)桿菌易于附著并侵染月季幼芽的生長點。5)制備用于木本植物芽點轉基因的農(nóng)桿菌侵染液c
取50m步驟I)所得的農(nóng)桿菌EHA105的菌液倒入經(jīng)高溫高壓滅菌的離心管中，在離心機上以4000轉/分鐘的轉速離心10分鐘后將上清倒掉，在無菌條件下加入與上清液等體積的MS液體培養(yǎng)基后將農(nóng)桿菌充分懸浮，然后將所得的農(nóng)桿菌懸濁液倒入無菌的IOOml的廣口玻璃瓶備用。6)真空條件下用侵染液c浸染受傷的芽點
將用無菌刀片劃傷或用無菌針頭刺傷的月季的幼芽浸泡在侵染液c中，保持無菌的情況下放入真空泵，打開真空泵處理30分鐘左右。7)浸染過根癌農(nóng)桿菌浸染液c的芽點與根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)
在無菌條件下將浸染過的幼芽先用無菌的MS液體培養(yǎng)基沖洗一次，放在無菌濾紙上晾干后接種在MS固體培養(yǎng)基上在28攝氏度、黑暗條件下培養(yǎng)3天。8)芽點轉基因月季植株的抗生素篩選
將經(jīng)過共培養(yǎng)的芽點在無菌條件下從MS固體培養(yǎng)基上轉移至含有100mg/L的硫酸卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上，每隔20天左右更換一次MS固體培養(yǎng)基，直至未轉基因的幼芽全部死掉。7)移栽:將經(jīng)篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)后仍存活的植株移植至新的MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)數(shù)周至生根后將其從培養(yǎng)基中取出，用自來水將根部培養(yǎng)基沖洗干凈后移栽至花盆的栽培基質(zhì)(蛭石:珍珠巖:營養(yǎng)土 = 4:1:1)中，經(jīng)過一周的馴化(光照強度4500 Lx，25°C，光周期為晝/夜=12h/12h，空氣濕度80%左右)后放入溫室中，以后每周澆水2 3次。8)對經(jīng)木本植物芽點轉基因方法所得月季植株做分子檢測
對經(jīng)木本植物芽點轉基因方法所得月季植株進行基因組PCR檢測，并對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，過程如下:
一、CTAB法提取轉基因月季植株葉片基因組
I取IOOmg新鮮月季葉片，剪成小塊置于研缽中，用液氮磨至粉末狀，轉入1.5 ml離心管中。

f加入2% CTAB提取液600 μ I,混勻。'I在65 °C水浴中溫浴I h。I冷卻到室溫后，加入600 μ I的氯仿-異戊醇，充分振蕩混勻。'ο 離心:室溫，12000 r/min, 10 min。I取上清，重復步驟3，再次抽提。:Γ取上清，加等體積異丙醇或無水乙醇，室溫沉淀10-30 min,室溫,12000 r/min,離心10 min。-1棄上清，用75%乙醇洗兩次。I烘干沉淀，溶于50-100 μ IddH2O中備用。二、轉基因月季植株葉片基因組PCR 以月季葉片基因組為模板進行PCR擴增 Atchyb基因引物:
Atchyb基因上游引物為SEQ ID N0.2所示的序列-Atchyb基因下游引物為SEQ IDN0.3所示的序列。PCR 反應體系(25 μ L):
組分名稱加入體積
IOXBuffer2.5 μ L
dNTP (2.5 mM)2 μ L
引物(Forward) 10 μ MIuL引物(Reverse) 10 μ MI μ L
植物基因組溶液I μ L
Taq Polymerase(5 U/μ L)0.25 μ L
ddH2017.25 μ L
PCR程序:
預變性94°C4 min
變性9 4°C30 s
退火58 °C30 s
延伸72 °CImin
循環(huán)重復步驟2-430次
總延伸72 °C8 min
保持4°CIh
取5 UL PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳驗證。瓊脂糖濃度0.7%
電壓120V
電泳時間30min
三、原位轉基因月季植株葉片基因組PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳驗證電泳結束后取出膠片，在凝膠成像系統(tǒng)中查看結果，并拍下照片，結果在490bp大小處出現(xiàn)特異的目的片段，可初步認為用原位轉基因法將目的基因成功轉入月季中(結果如圖2所示)。
權利要求
1.一種農(nóng)桿菌介導的侵染木本植物芽點轉基因的方法，其特征在包括如下步驟:獲得木本植物芽點轉基因所需無菌莖段；將莖段接種至培養(yǎng)基A使其長出芽點；將芽點從莖段上切下，并將其劃傷；制備用于木本植物芽點轉基因的農(nóng)桿菌侵染液B ;真空條件下用侵染液B侵染受傷的芽點；然后將侵染過根癌農(nóng)桿菌侵染液B的芽點及根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；將共培過的芽點接種在篩選培養(yǎng)基C上進行篩選培養(yǎng)；經(jīng)過篩選后的生根苗移栽至溫室中；對原位轉基因月季植株做分子檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的獲得木本植物芽點轉基因所需無菌莖段是指將木本植物的莖桿或枝條將葉子去除掉，先用自來水沖洗1(Γ30分鐘，用剪刀將其建成2飛cm的莖段，接著用75%的乙醇溶液浸泡30秒進行表面消毒，用無菌水沖洗2 4次，再用2% (m/v)的次氯酸鈉浸泡8 10分鐘，然后用無菌水沖洗4次以上后的莖段。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的將莖段接種至培養(yǎng)基使其長出芽點的培養(yǎng)基是指經(jīng)過高溫高壓滅菌的MS固體培養(yǎng)基，其基本成分是MS+7g/L瓊脂。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的將莖段接種至培養(yǎng)基使其長出芽點是指在無菌操作的條件下將無菌的莖段形態(tài)學的下端插入經(jīng)過高溫高壓滅菌的固體MS培養(yǎng)基中，是莖段直立在培養(yǎng)基中，將其密封好，放在組培室中培養(yǎng)7天左右，待莖段上長出長度為0.5cm左右的幼芽。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的將芽點從莖段上切下，并將其劃傷是指在無菌操作的條件下將長有幼芽的莖段從培養(yǎng)基中取出放在無菌濾紙上，用無菌的刀片將芽點從莖段上切下或剝落，然后用無菌刀片或無菌的7號針頭將幼芽的生長點劃傷或刺傷。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的制備用于木本植物芽點轉基因的農(nóng)桿菌侵染液B是指挑取攜帶有質(zhì)粒pCambia2300的根癌農(nóng)桿菌EHA105單菌落接種于50ml含100mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，水浴搖床28攝氏度、150轉/分鐘，12 16小時，培養(yǎng)至根癌農(nóng)桿菌菌液OD6tltl=0.6^0.8時，取出后在離心機上以4000轉/分鐘的轉速離心10分鐘后將上清倒掉，然后加入與上清液等體積的MS液體培養(yǎng)基后將農(nóng)桿菌充分懸浮后所得的懸濁液。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的真空條件下用浸染液B浸染受傷的芽點是指將用無菌刀片劃傷或用無菌針頭刺傷的木本植物的幼芽浸泡在浸染液B中，保持無菌的情況下放入真空泵，打開真空泵處理30分鐘左右。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的將浸染過根癌農(nóng)桿菌浸染液B的芽點及根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)是指在無菌條件下將浸染過幼芽先用無菌的MS液體培養(yǎng)基沖洗一次，放在無菌濾紙上晾干后接種在含有MS固體培養(yǎng)基上在28攝氏度、黑暗條件下培養(yǎng)3 7天。
9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的將共培過的芽點接種在篩選培養(yǎng)基C上是指將經(jīng)過共培養(yǎng)的芽點在無菌條件下從MS固體培養(yǎng)基上轉移至含有100mg/L的硫酸卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上，每隔20天做更換一次培養(yǎng)基。
10.一種農(nóng)桿菌介導的侵染月季芽點轉基因的方法，其特征在于它包括的步驟: I)獲得月季芽點轉基因的所需的無菌莖段:將月季的莖段的葉子先剪掉，然后通過自來水沖洗后剪成2 5cm的莖段，并進行75%酒精表面消毒、2%次氯酸鈉滅菌后備用；2)將莖段接種至固體MS培養(yǎng)基上使其長出芽點:在無菌操作的條件下將I)中所得無菌莖段形態(tài)學的下端插入經(jīng)過高溫高壓滅菌的固體MS培養(yǎng)基中，使莖段直立在培養(yǎng)基中，將其密封好，放在組培室中培養(yǎng)7天左右，待莖段上長出長度為0.5cm左右的幼芽； 3)將芽點從莖段上切下，并將其劃傷:在無菌操作的條件下將長有幼芽的莖段從培養(yǎng)基中取出，用無菌的刀片將芽點從莖段上切下或剝落，然后用無菌刀片或無菌的7號針頭將幼芽的生長點劃傷或刺傷； 4)制備用于月季芽點轉基因的農(nóng)桿菌侵染液 5)真空條件下用浸染液浸染受傷的芽點:將用無菌刀片劃傷或用無菌針頭刺傷的月季的幼芽浸泡在浸染液中，保持無菌的情況下放入真空泵，打開真空泵處理30分鐘左右； 6)將浸染過根癌農(nóng)桿菌浸染液的芽點和根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)3 7天； 7)對芽點轉基因月季植株進行抗生素篩選 8)移栽經(jīng)篩選后仍能存活的轉基因植株 9)對經(jīng)月季芽點轉基因方法所得月季植株做分子檢測 對經(jīng)月季芽點轉基因方法所得月季植株進行基因組PCR檢測，Atchyb基因PCR引物為: 上弓丨 5 -3 tcaaccgccg ttacattc 下弓丨 5 -3 cgagaccatc gtggacaa 并對PCR產(chǎn)物進行 瓊脂糖凝膠電泳分析抗性植株的轉基因成功與否。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導的侵染月季芽點轉基因的方法。首先獲得月季芽點轉基因所需無菌莖段；將莖段接種至固體培養(yǎng)基使其長出芽點；將芽點從莖段上切下，并將其劃傷；制備用于月季芽點轉基因的農(nóng)桿菌侵染液；真空條件下用侵染液侵染受傷的芽點；然后將侵染過根癌農(nóng)桿菌侵染液的芽點及根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；將共培過的芽點接種在篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)；經(jīng)過篩選后的生根苗移栽至溫室中；對月季芽點轉基因的月季植株做分子檢測。本發(fā)明的方法對月季的芽點進行轉基因，通過對被轉基因的幼芽行篩選轉基因植株和分子檢測進一步驗證PCR陽性植株，方法簡單高效，轉化率可達4%，對木本植物基因工程和遺傳育種具有重大意義。
文檔編號C12N15/84GK103146748SQ20131005773
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月25日 優(yōu)先權日2012年4月13日
發(fā)明者季靜, 王罡, 武衛(wèi)黨, 張迅強 申請人:天津大學