專利名稱：鹽藻肌醇磷酸合酶基因、其編碼蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及其應(yīng)用。特別涉及一種鹽藻^Dunaliella Firit/is)肌醇憐酸合酶(myo-1nositol-l-phosphate synthase, MIPS)基因DvMIPS,其編碼蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
世界人口日益增長，耕地面積日趨減少，提高農(nóng)作物產(chǎn)量成為了解決這對矛盾的重要途徑。然而土壤鹽潰化、干旱、營養(yǎng)貧瘠和極端溫度等各種環(huán)境脅迫嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的生長和發(fā)育，并降低其產(chǎn)量。世界可耕土地中有20%出現(xiàn)嚴(yán)重的鹽潰化，嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量。研究生物的抗鹽機(jī)制，利用分子生物學(xué)技術(shù)來獲得抗性基因，揭示生物與逆境之間的關(guān)系，輔助作物育種，已經(jīng)成為了提高農(nóng)作物產(chǎn)量的有效途徑之一。植物在長期的進(jìn)化過程當(dāng)中，針對鹽脅迫產(chǎn)生了一整套的應(yīng)答機(jī)制。如激活植物脅迫應(yīng)答的細(xì)胞信號通路，引起細(xì)胞應(yīng)答如積累大量的滲透保護(hù)物質(zhì)、維持細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)平衡、修復(fù)被破壞的蛋白和膜系統(tǒng)、清除活性氧自由基等。目前人們已經(jīng)通過對擬南芥等模式植物的研究，在植物耐鹽方面取得了巨大的研究成果。但是以非鹽生植物作為研究的模式植物，不可能完全揭示植物的耐鹽機(jī)制。鹽生模式植物正受到世界范圍內(nèi)學(xué)者們的關(guān)注。其中杜氏藻屬是自然界中廣泛存在的真核單細(xì)胞綠藻。它廣泛分布于鹽湖、海洋、鹽土等高鹽度的環(huán)境中，是高鹽水域中的主要的生物種群，很容易從自然環(huán)境中分離得到。^MQDunaliella ririt/is)是杜氏藻屬中具有代表性的一個種。該種又稱杜氏鹽藻、綠色杜氏藻、鹽生綠色杜氏藻等。鹽藻對環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，可在從0.05mol/L到飽和NaCl (約5.5 mol/L)的條件下生長,是已知最耐鹽的真核生物之一。鹽藻極強(qiáng)的耐鹽能力、簡單的細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及便利的培養(yǎng)條件使鹽藻成為研究植物適應(yīng)高鹽脅迫的分子機(jī)制的重要模式生物。鹽藻很容易從自然環(huán)境中分離得到，也可以向藻種保存中心索取。因此，鹽藻成為了一個重要的耐逆基因資源寶庫。
肌醇憐酸合酶(myo-1nositol-l-phosphatesynthase, MIPS)是一種在真核和原核生物界高度保守的酶。在大多數(shù)真核生物和個別原核生物系統(tǒng)中，MIPS的催化反應(yīng)需要NAD+輔因子。NAD+輔因子的結(jié)合基序在MIPS氨基酸序列的功能域中是保守的。MIPS可以催化六憐酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)向肌醇憐酸(L-myo-1nositol 1-phosphate)的轉(zhuǎn)化。肌醇及其衍生物參與多種生物化學(xué)及生理學(xué)過程，包括:細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、膜建成和轉(zhuǎn)運(yùn)、膜相關(guān)蛋白定位以及細(xì)胞壁的形成等。植物細(xì)胞中的肌醇分子還參與了更多的生命過程，包括形成植酸等儲存物質(zhì)、調(diào)節(jié)植物細(xì)胞抗逆、促進(jìn)種子脫水、修飾生長素、參與細(xì)胞壁組成等。在植物組織中已報導(dǎo)的MIPS有兩種:細(xì)胞質(zhì)類型和葉綠體類型。葉綠體類型與類囊體膜相關(guān)，受光條件的調(diào)控，而細(xì)胞質(zhì)類型參與各種重要代謝反應(yīng)。在生物學(xué)和免疫學(xué)的特性上，葉綠體類型與細(xì)胞質(zhì)類型的MIPS是相似的。它們在脅迫反應(yīng)中起著重要作用，如耐鹽，耐干旱，參與細(xì)胞程序化死亡的過程等。在肌醇和肌醇衍生物的合成過程中，MIPS基因的合成受光和鹽的調(diào)控。目前還沒有文獻(xiàn)報道鹽藻中MIPS蛋白的功能?？寺》治鳆}藻中基因有助于深入理解鹽藻抗鹽機(jī)制，同時也為生物耐鹽基因工程和分子育種提供了新的基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種鹽藻肌醇磷酸合酶(myo-1nositol-1-phosphatesynthase,MIPS)基因。該基因是從鹽藻iMmmliella virit/is)中分離出來的,爾、％DvMIPS。本發(fā)明的目的之二在于提供該基因的編碼蛋白。本發(fā)明的目的之三在于提供該基因在催化六磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)向肌醇磷酸(L-myo-1nositol 1-phosphate)轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的之四在于提供了該基因在提高生物耐鹽性狀中的應(yīng)用。為達(dá)以上目的，本發(fā)明通過下述方案實現(xiàn):
O 一種鹽藻肌醇磷酸合酶基因，其特征在于該基因為SEQ ID NO I所示的堿基序
列；
2)—種上述的基因的編碼蛋白，該蛋白為SEQ ID NO 2所不的氣基酸序列；
3)上述的基因，具有可以 催化六磷酸葡萄糖(glucose 6-phosphate)向肌醇磷酸(L-myo-1nositol 1-phosphate)轉(zhuǎn)化的肌醇磷酸合酶的應(yīng)用功能。4)上述的基因在提高生物耐鹽性狀中的應(yīng)用。本發(fā)明通過鹽脅迫處理，采用酵母功能互補(bǔ)系統(tǒng)，首次從鹽藻中克隆到了一個肌醇磷酸合酶基因，并通過實驗證明了該基因還具有提高生物耐鹽性狀的應(yīng)用價值。


圖1為本發(fā)明基因編碼的肌醇磷酸合酶蛋白進(jìn)化樹分析圖。圖2為本發(fā)明融合His標(biāo)簽的伽#//5基因編碼蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。M:蛋白 marker ;1:pET32a 未誘導(dǎo)的全菌；2:pET32a 全菌；3:pET32a 上清；4:pET32a 沉淀；5:pET32a_DvMIPS 未誘導(dǎo)的全菌；6:pET32a_DvMIPS 全菌；7:pET32a_DvMIPS上清；8:PET32a-DvMIPS沉淀；箭頭所示為誘導(dǎo)表達(dá)融合His標(biāo)簽的辦#//5基因編碼蛋白。圖3為本發(fā)明基因編碼蛋白的肌醇磷酸合酶活性測定圖。**表示融合His標(biāo)簽的基因編碼蛋白與空載蛋白相比，兩者的肌醇磷酸合酶活性具有極顯著的差異(Ρ〈0.01)。圖4為本發(fā)明基因在酵母突變體G19中的耐鹽功能分析。即 .含DvMIPS完整ORF的EST序列(Contig 187)插入到酵母表達(dá)載體pAJ401中，轉(zhuǎn)化酵母鹽敏感突變體G19，在含不同濃度NaCl的 表型展示培養(yǎng)基上進(jìn)行耐鹽表型測定。具體實施方法
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遺傳學(xué)方法(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual,Adams A et.al.編，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例一全長編碼區(qū)的克隆與分析
對鹽藻(ft ririi/is)受不同濃度鹽誘導(dǎo)的cDNA文庫EST序列(表達(dá)序列標(biāo)簽)進(jìn)行分析，重點分析表達(dá)量明顯受鹽誘導(dǎo)的序列。通過序列比對，從編號contig 187的EST序列中分離到了一個鹽藻肌醇磷酸合酶基因，命名為DvMIPS。DvMIPS的開放閱讀框(ORF)為1548 bp，cDNA全長2194 bp，含有綠藻基因特異的加尾信號TGTAA及poly (A)結(jié)構(gòu)。實施例二編碼的蛋白結(jié)構(gòu)、同源分析
Vector NTI軟件的分析結(jié)果顯示:該基因編碼一個含516個氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小為56.9 kDa，等電點為5.38。與其他物種的MIPS基因具有較高的同源性，該基因編碼的蛋白還具有 inos-1-P-synth domain 和 NAD_binding-5 domain。DvMIPS 在同源區(qū)段中含有在所有物種肌醇-1-磷酸合成酶中都有保守的GWGGNNG氨基酸基序，是NAD+的結(jié)合活性位點。在DvMIPS的序列中還發(fā)現(xiàn)了在真核生物肌醇-1-磷酸合成酶中高度保守的NGSPQNTFVPGL基序、SYNHLGNNDG基序和LWTANTERY基序，暗示該蛋白在物種進(jìn)化上是高度保守的。圖1為本發(fā)明的基因編碼的蛋白進(jìn)化分析圖，表明該編碼蛋白屬于inos-1-P-synth蛋白超家族。實施例三'DvMIPS編碼蛋白的定位預(yù)測及原核表達(dá)分析
通過WoLFPSORT軟件預(yù)測，DvMIPS定位于細(xì)胞質(zhì)中。通過PCR的方法，在DvMIPS基因的ORF兩端加入限制性內(nèi)切酶位點EcoRl和通ο I，連接T載體測序正確后，EcoRl和通ol雙酶切目的片段連接到同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pET32a上，得到重組質(zhì)粒pET32a-1V#775。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中，I mM IPTG，16 °C誘導(dǎo)8 h后，加入適量體積的PBS緩沖液超聲破碎菌體。離心得到的上清即為粗蛋白提取物。圖2為融合His標(biāo)簽的DvMIPS蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。 實施例四'DvMIPS編碼蛋白的肌醇磷酸合酶活性測定
1.將100-200 Ug提取的粗蛋白溶液與相應(yīng)體積的酶活反應(yīng)液[50 mM Tris.HCl(PH=7.5), 14 mM NH4Cl, 0.8 mM NAD+, 5 mM β -ME, 5 mM G-6-P]混合，總體積為 500 ul，37°C反應(yīng)I h。同時設(shè)置對照:空白對照O (無蛋白，僅加入PBS緩沖液)，對照I (在反應(yīng)Oh時加入TCA終止反應(yīng)。)
2.1 h后加入200 ul TCA終止酶活反應(yīng)。3.12000 rpm離心2 min,上清轉(zhuǎn)移至新的離心管(約700 ul)
4.加700 ul NaIO4,(設(shè)對照2不加NaIO4,改加同體積的水)37 °C反應(yīng)I h。5.加入1.4 ml Na2SO3，(設(shè)對照3加入同體積水)總體積為2.8 ml。加入等體積p1-reagent [H2SO4 (6N):10% 抗壞血酸:2.5% 鑰酸銨:H20=1:1:1:2]，37°C反應(yīng) 1.5 h。6.分光光 度計測定OD66tl。DvMIPS編碼蛋白的肌醇磷酸合酶活性測定值見圖3。實施例五在酵母鹽敏感突變體中的功能分析 (一)酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
將含有仇說775完整ORF的EST序列(Contig 187)利用其限制性內(nèi)切酶位點I和Xho I構(gòu)建到酵母表達(dá)載體PAJ401中。(二)轉(zhuǎn)化酵母
使用LiAc熱激轉(zhuǎn)化法將含有Contig 187的重組克隆轉(zhuǎn)化到酵母鹽敏感突變體G19(Mat , ura3 his3 trpl ade2 enal Δ::ena4 Δ)中。
(三)酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽表型鑒定
所用基本培養(yǎng)基為AP培養(yǎng)基，并加入所需氨基酸，篩選標(biāo)記為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷。轉(zhuǎn)入載體為PAJ401的轉(zhuǎn)化子表型展示培養(yǎng)基，添加2%的半乳糖作為碳源。所用表型展示培養(yǎng)基:以不含NaCl的AP培養(yǎng)基為對照，加入不同濃度NaCl的AP培養(yǎng)基，用以分析酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽表型。首先將酵母轉(zhuǎn)化子在AP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl=0.6，以5 μ I為一個滴度，并以5倍稀釋度為系列稀釋滴度，在表型展示培養(yǎng)基上展示酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽表型。在PAJ401組成型強(qiáng)表達(dá)啟動子啟動下，Contig 187成功互補(bǔ)了酵母鹽敏感突變體G19的表型(圖4);結(jié)果表明轉(zhuǎn)化了含辦#//5完整ORF的EST序列的酵母鹽敏感突變體在280 mM NaCl脅迫下仍然有表型，說明了基因能夠部分恢復(fù)酵母鹽敏感突變體的功能，證明了DvMIPS像夠有效地提高生物體的耐鹽能力。盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的，即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
權(quán)利要求
1.一種鹽藻肌醇磷酸合酶基因，其特征在于該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO I所示的堿基序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因編碼的蛋白，其特征在于該蛋白具的氨基酸序列為SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因在催化六磷酸葡萄糖向肌醇磷酸轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
4.一種根據(jù)權(quán)利 要求1所述的基因在提高真核生物酵母耐鹽能力中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鹽藻(Dunaliellaviridis)肌醇磷酸合酶(myo-Inositol-1-phosphatesynthase,MIPS)基因DvMIPS、其編碼蛋白及其應(yīng)用。該基因為SEQIDNO1所示的DNA序列。本發(fā)明首次從鹽藻(Dunaliellaviridis)中分離到肌醇磷酸合酶(myo-Inositol-1-phosphatesynthase，MIPS)基因DvMIPS，并通過轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞證明該基因不但具有肌醇磷酸合酶功能，還具有提高生物耐鹽性狀的應(yīng)用價值。
文檔編號C12P9/00GK103146731SQ201310057038
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月22日
發(fā)明者李平, 孫文杰, 李松, 俞頔, 王超, 宋任濤, 許政暟 申請人:上海大學(xué)