肽組合物和用于治療肺損傷、哮喘、過敏反應(yīng)、血管性水腫、全身性血管通透綜合征和鼻塞 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了末端結(jié)合蛋白3(EB3)和3型1,4,5-三磷酸肌醇受體(IP3R3)之間相互作用的肽抑制劑。還提供了用于治療包括急性肺損傷(其可包括肺血管通透性過高)在內(nèi)的肺損傷、血管滲漏、水腫發(fā)展、哮喘、過敏反應(yīng)、血管性水腫、全身性血管通透綜合征以及鼻塞的方法和材料。
【專利說明】肽組合物和用于治療肺損傷、哮喘、過敏反應(yīng)、血管性水腫、
全身性血管通透綜合征和鼻塞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于治療肺損傷的肽，所述肺損傷包括炎癥介導(dǎo)的血管滲漏和水腫發(fā)展。本發(fā)明還涉及使用所述肽治療哮喘、過敏反應(yīng)、血管性水腫、全身性血管通透綜合
征和鼻塞。
【背景技術(shù)】
[0002]微管(MT)細胞骨架提供了內(nèi)皮屏障調(diào)節(jié)的一個重要控制點；但是，這種關(guān)鍵骨架元素的作用還沒有得到很好的研究。MT穩(wěn)定藥物紫杉醇顯示出在小鼠模型中緩解肺損傷，從而證明MT在介導(dǎo)增加肺血管滲透性中可能起到重要作用。然而，紫杉醇具有一般毒性，對醫(yī)生和患者而言它并不是方便的藥物。
[0003]微管末端結(jié)合蛋白是高度保守的與生長中的微管(MT)相結(jié)合并抑制MT災(zāi)難性事件的微管正端跟蹤輔助因子。兩個這樣的末端結(jié)合蛋白，EBl和EB3，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞骨架動力學(xué)和細胞形態(tài)的改變中發(fā)揮作用，是內(nèi)皮屏障滲透性的主要決定因素。
[0004]Ca2+是調(diào)節(jié)內(nèi)皮通透性和血管穩(wěn)態(tài)的一種高度通用的第二信使。磷酸酶C β (PLC β)的激活，處于PAR-1激活下游，其介導(dǎo)二磷酸磷脂酰肌醇(phosphotidylinositolbisphosphate, PIP2)水解成 I, 4，5-三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG)。IP3 刺激從IP3-敏感的細胞內(nèi)儲備庫(B卩，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER))中釋放Ca2+。鈣離子從ER儲備庫中Ca2+消耗由ER膜上IP3R的活化進行介導(dǎo)，并導(dǎo)致細胞內(nèi)Ca2+瞬間升高。Ca2+內(nèi)流或“流入”是由瞬時受體電位通道(TRPC)所介導(dǎo)的，所述瞬時受體電位通道對于各種陽離子，包括Ca2+和Mg2+是可透過的。TRPCl和 4是內(nèi)皮肺微血管細胞中的庫操縱性Ca2+通道(S0C)，其由ER耗竭所激活。
[0005]細胞內(nèi)Ca2+濃度增加上調(diào)蛋白激酶Ca (PKC a )的活性。PKCa是響應(yīng)于多重介導(dǎo)子2的內(nèi)皮通透性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。PKCa對pl20-連環(huán)蛋白進行磷酸化并介導(dǎo)其與VE-鈣粘蛋白解離，從而導(dǎo)致VE-鈣粘蛋白的內(nèi)化。PKCa還通過磷酸化P115RhoGEF和⑶1-1而作用于RhoA活化的上游。RhoA蛋白隨之通過激活Rho激酶(ROCK)而促進肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)的磷酸化誘導(dǎo)抑制。MLCP的抑制伴隨著MLCK的Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性活化，其導(dǎo)致MLC的磷酸化并誘發(fā)響應(yīng)于促炎介質(zhì)如凝血酶和組胺的肌動球蛋白(acto-myosin)收縮。
[0006]MT細胞骨架的完整性是IP3誘導(dǎo)的從ER存儲中釋放Ca2+所必須的。MT失穩(wěn)劑或MT穩(wěn)定劑，諸如噻氨酯噠唑、秋水仙素和紫杉醇，導(dǎo)致MT動力學(xué)變化抑制Ca2+的IP3-門控釋放，這表明MT動力學(xué)對于IP3R的完全活化是必須的。MT細胞骨架參與了 ER的重塑，從而保證組織和鈣波的傳播響應(yīng)于外部刺激。通過EBl和EB3與基質(zhì)交感分子I (SHMl)的直接作用，ER與MT生長端相連并隨之伸長。HeLa中剔除EBl (HeLa細胞不表達EB3)降低ER突出事件，但是并沒有抑制毒胡蘿卜素導(dǎo)致的SOC激活，暗示一些其他的機制參與了上皮細胞中SOC的激活和鈣信號的傳播。在內(nèi)皮細胞中，IP3R在細胞膜穴樣內(nèi)陷中的定位對于ER Ca2+庫耗竭和SOC激活而言都至關(guān)重要。這表明，IP3R的激活和/或其對IP3的反應(yīng)性是鈣信號傳導(dǎo)的重要元素。因此建議MT細胞骨架正調(diào)節(jié)IP3R激活以響應(yīng)于IP3，并從而穿過細胞發(fā)送胞外信號，引發(fā)生理反應(yīng)。
[0007]盡管在美國有先進的醫(yī)療支持，但每年仍有約100,000名患者死于急性肺損傷(ALI)，急性肺損傷是與發(fā)生敗血癥時中性粒細胞浸潤以及細胞因子和炎癥介質(zhì)釋放相關(guān)的復(fù)雜炎癥反應(yīng)。肺血管通透性過高是該疾病的一個特征，導(dǎo)致肺水腫的形成。因此需要新的治療方法來預(yù)防或治療內(nèi)皮屏障功能障礙。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本文提供了一種分離的肽。所述肽包括KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1)、FTEIPTI (SEQ ID NO:3)以及它們的片段或變體。該肽也可由KFARLWTEIPTAIT(SEQ IDNO:1) ,FTEIPTI (SEQ ID NO: 3)以及它們的片段或變體構(gòu)成。所述變體可包括保守取代。所述變體可包括任何含有Ser/Thr-x-1LE-Pro序列的肽序列,所述Ser/Thr-x_ILE-Pro序列是最小EB結(jié)合共有基序序列。該肽可經(jīng)肉豆蘧?；蜻B接至載體肽。所述載體肽可以是觸角足肽(AP)。該肽可以是藥物制劑的一部分，所述藥物制劑還可包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。
[0009]本文還提供了一種治療肺損傷的方法，該方法可包括向有此需要的患者施用包含所述肽的組合物。肺損傷可以是水腫、炎癥介導(dǎo)的血管滲漏或哮喘，可以是過敏性哮喘。所述過敏性哮喘可以是慢性或急性的。
[0010]本文還提供治療全身血管通透性綜合征的方法，該方法可包括向有此需要的患者施用包含所述肽的組合物。該綜合征可因內(nèi)毒素血癥、創(chuàng)傷或多次輸血引起。該綜合征也可由藥物治療的副作用引起，所述藥物治療可以是全身使用IL-2以治療癌癥。
[0011]本文還提供了一 種治療血管性水腫的方法，該方法可包括向有此需要的患者施用包含所述肽的組合物。該血管性水腫可以是過敏原誘發(fā)的血管性水腫或非過敏原誘發(fā)的血管性水腫。過敏原誘發(fā)的血管性水腫可以是喉部血管性水腫，其可以隨食物過敏或膜翅目昆蟲螫咬傷而發(fā)生。非過敏原誘發(fā)的血管性水腫可以是補體因子I抑制劑缺乏或成像造影劑誘發(fā)的血管性水腫。
[0012]本文還提供了一種治療過敏反應(yīng)的方法，該方法可包括向有此需要的患者施用包含所述肽的組合物。該過敏反應(yīng)可以是過敏原誘發(fā)的或非變應(yīng)性過敏樣反應(yīng)。所述非變應(yīng)性過敏樣反應(yīng)可以是由造影劑引起的。
[0013]本文還提供了一種治療全身性血管通透的方法，該方法可包括向有此需要的患者提供包含所述肽的組合物。所述全身性血管通透可與內(nèi)毒素血癥相關(guān)。
[0014]本文還提供了一種治療鼻塞的方法，該方法可包括向有此需要的患者提供包含所述肽的組合物。所述鼻塞可與過敏性或非過敏性鼻炎相關(guān)。鼻塞可以是刺激相關(guān)的或者呼吸道病毒相關(guān)的。
[0015]附圖簡要說明
[0016]圖1顯示EB3的剔除抑制了響應(yīng)于激活蛋白酶活化受體(PAR)-1的從儲備庫中釋放Ca2+。A.表達任一 shRNA至EB1、EB3和螢光素酶的HMVECs中加入Fura2_AM以及在不存在[Ca2Itl和存在細胞外Ca^l.SnMCaU的情況下，計算用凝血酶(50nM)刺激細胞后的340 (Ca2+結(jié)合)Fura/380 (不含有Fura)比率。箭頭,凝血酶加入時間。應(yīng)當(dāng)注意EB3的剔除顯著降低了細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加。B.圖中顯示了凝血酶誘導(dǎo)的Ca2+釋放和進入的平均值土SD，計算作為超過基準(zhǔn)值的最大增值。該增值歸一化至來自同一蓋玻片的對照非轉(zhuǎn)染細胞(η = 9) ο
[0017]圖2顯示了肺部炎癥時ΕΒ3與IP3R3和TRPCl的相互作用。WT和TLR4K0小鼠接受了 10mg/kg體重的內(nèi)毒素脂多糖(LPS)的單次腹膜內(nèi)注射(IP)，內(nèi)毒素脂多糖是革蘭氏陰性細菌的外膜成分，會引發(fā)哺乳動物中強烈的免疫反應(yīng)。在指定的時間分離肺。從全肺勻漿中將EB3進行IP化(IP’ ed)。所得沉淀用于探查TRPC1、IP3R3和EB3。需要注意的是TLR4(LPS受體)的剔除改變了 EB3與TRPCl的相互作用。它還阻止了與IP3R3結(jié)合的增加。還需要注意的是，在TLR4+肺中EB3與IP3R3結(jié)合不亞于WT。數(shù)據(jù)代表了 2個獨立的實驗。
[0018]圖3顯示了人類IP3R(IP3R3型的794-814位氨基酸)與EB結(jié)合基序(以紅色突出顯示)的比對。該IP3R3肽(SEQ ID NO:1)如下顯示為綠色。 [0019]圖4顯示了條帶表示的EB3結(jié)構(gòu)(品紅色)和對接在EB3的EB3疏水結(jié)合槽中的IP3R3衍生肽(SEQ ID NO:1)(綠色球和棒)；所示為經(jīng)180°旋轉(zhuǎn)。聯(lián)合使用Z-Dock程序和Discovery Studio3.0軟件進行對接IP3R3衍生肽。所述肽和EB3之間的結(jié)合能經(jīng)計算為-68.882kcal/molο
[0020]圖5顯示了 IP3R3肽(SEQ ID NO:1)抑制了響應(yīng)于PAR-1的激活從ER中釋放Ca2+。A.用AP-結(jié)合IP3R3肽或?qū)φ?AP)肽進行預(yù)處理的HMVECs中加入Fura2_AM，并在不存在和存在細胞外Ca2+的情況下，計算用凝血酶(50nM)刺激細胞后的340/380比率。箭頭，凝血酶加入時間。B.圖中顯示了凝血酶誘導(dǎo)的Ca2+釋放和進入的平均值土SD，計算作為超過基準(zhǔn)值的最大增值。該增值歸一化至來自同一試驗的對照非處理細胞(η = 4)。
[0021]圖6顯示了 IP3R3肽(SEQ ID NO:1)在離體肺標(biāo)本中抑制ΕΒ3和IP3R3之間的相互作用。經(jīng)分離的肺進行了 20分鐘的平衡灌注，隨后進行30分鐘的10μ MAP-1P3R3肽灌注。在5分鐘之后，用30 μ MPAR-1激動劑肽TFLLRN-NH2 (PAR-1 a.p.)灌注20分鐘(IP3R3 +PAR-1組)。另一組僅用30 μ MPAR-1激動劑肽(PAR-1組)灌注。隨后，肺用于制備肺組織勻漿，其用于確定IP3R3肽對EB3/IP3R3相互作用的影響。EB3用特異性抗體進行免疫沉淀，獲得的沉淀物用于探測EB3和IP3R3。需要注意的是，與基準(zhǔn)水平(對照組)相比，PAR-1受體激活顯著增加EB3/IP3R3相互作用(PAR-1組)，然而在激活的肺微血管中豐富的IP3R3肽抑制了這種相互作用。
[0022]圖7顯示了 IP3R3肽(SEQ ID NO:1)減少了響應(yīng)于PAR-1的肺血管滲透性(Kf，。，微血管過濾系數(shù))的增加。離體肺進行了 20分鐘的平衡灌注，隨后進行30分鐘的10 μ MAP-1P3R3肽灌注。在5分鐘之后，于Kf，。測量之前，用30 μ MPAR-1激動劑肽TFLLRN-NH2 (PAR-1 a.p.)灌注 20 分鐘(IP3R3 + PAR-1 組)。每組 η = 3-5。ANOVA 測得，Bar + SD*P〈0.05。需要注意的是，在含有豐富IP3R3的肺中響應(yīng)于PAR-1激活的血管通透性并沒有顯著變化。
[0023]圖8顯示了 IP3R3肽(SEQ ID NO:1)減輕在LPS誘發(fā)的炎癥時肺中嗜中性粒細胞的浸潤。小鼠接受單次腹膜內(nèi)注射LPS(30mg/kg體重；大腸桿菌LPS0111:B4，LD50劑量)，并分別在2和6小時用于分析。肺用PBS進行灌注、稱重、冷凍并用于測量肺髓過氧化物酶(MPO)活性，其為肺部肺中性粒細胞(PMN)的標(biāo)度。N = 6只小鼠/組。[0024]圖9顯示了 IP3R3肽(SEQ ID NO:1)防止LPS誘發(fā)的敗血癥的致死性。在LPS注射前用IP3R3肽處理的小鼠證實了 LD50-(30mg/kg的LPS, A)和LD90-挑戰(zhàn)(50mg/kg的LPS, B)對照小鼠中的死亡率降低。ANOVA測得，(η = 11-15只小鼠/組，p〈0.0OlAP-1P3R3組與對照組處理(AP對照)。在眼窩后靜脈注射IP3R3之前，用氯胺酮，10mg/ml ;甲苯噻嗪，0.25mg/ml和乙酰丙嗪,0.25mg/ml的混合物麻醉小鼠。
[0025]圖10顯示了 IP3R3肽(SEQ ID NO:1)防止多微生物敗血癥的致死性。用IP3R3肽處理的小鼠體現(xiàn)了 CLP后的120小時內(nèi)降低的死亡率。在CLP手術(shù)前30分鐘，以及手術(shù)后24小時和48小時用IP3R3肽(I μ M/kg體重)靜脈注射6_8周齡⑶-1小鼠。在中點位置結(jié)扎盲腸并將盲腸內(nèi)容物輕輕推向遠側(cè)部分。使用16號針頭沿腸系膜至反腸系膜方向在盲腸結(jié)扎點和尖端之間的中間位置進行穿刺。少量糞便從腸系膜和反腸系膜穿透孔中擠出。在假手術(shù)對照中只進行剖腹探查術(shù)。將小鼠麻醉。IP3R3肽組的存活率顯著高于對照組(n = 10只小鼠/組)。死亡率差異由log-rank檢驗(P〈0.05)進行評估。
[0026]圖11顯示了對小鼠存活的IP3R3肽的劑量響應(yīng)。用指定劑量IP3R3肽處理的⑶-1小鼠用LD80劑量(50mg/kg，LPS)的LPS進行靜脈注射，并監(jiān)測5天。成活率)相對于對數(shù)刻度的肽劑量作圖。S形劑量-響應(yīng)曲線由數(shù)據(jù)點進行擬合。n= 10只小鼠/組。在眼窩后注射肽之前，在麻醉誘導(dǎo)室中用空氣中2.5%異氟醚對小鼠進行麻醉。在靜脈注射時，在室內(nèi)空氣中的麻醉誘導(dǎo)室。靜脈注射時用特別設(shè)計的嚙齒動物口罩與同軸管(哈佛儀器，ΑΗ72-3026)維持麻醉。
[0027]圖12 顯示了與 EBIN(SEQ ID NO: 3)(綠色棒)和 IP3R3肽(黃色棒)(SEQ ID NO:1)絡(luò)合的ΕΒ3 (品紅色)條帶示意。對于IPR和ΕΒΙΝ，計算結(jié)合能分別為-68.882和-60.251。
[0028]圖13顯示了 EBIN(SEQ ID NO:3)抑制IP3R3和EB3之間的相互作用。用
Iμ MAP-EBIN或?qū)φ针?AP)預(yù)處理的HPAECs用50ηΜ凝血酶進行挑戰(zhàn)。ΕΒ3和IP3R3之間的相互作用在凝血酶刺激 后不同時間點進行分析。ΕΒ3用特別的抗體進行免疫沉淀，所形成的沉淀物用于探查ΕΒ3和IP3R3。EBIN明顯降低基準(zhǔn)和凝血酶處理后的EB3-1P3R3相互作用。
[0029]圖14顯示了 MYR-EBIN(SEQ ID NO: 3)緩解激動劑誘導(dǎo)的細胞內(nèi)鈣增加。HPAEC單層用50nM凝血酶(A)或90 μ M組胺⑶進行刺激后的[Ca2+] i瞬態(tài)。平均值；n = 20個細胞。箭頭，刺激時間。需要注意的是EBIN(藍色示蹤劑)顯著降低了在對照肽(損失結(jié)合的；FAEIPTI(SEQ ID NO:4))處理的細胞(紅色示蹤劑)中的[Ca2+] i瞬態(tài)。
[0030]圖15顯示了 EBIN(SEQ ID NO:3)減弱了激動劑誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞旁通透性過高。HPAEC單層跨內(nèi)皮電阻(TER)的變化響應(yīng)于50nM的凝血酶(A)和50 μ M組胺⑶。TER值歸一化至基準(zhǔn)電阻。MYR-EBIN(紅色曲線)防止了響應(yīng)于凝血酶和組胺的細胞形態(tài)變化和細胞旁通透性過高，而在對照肽處理的細胞(藍色曲線)中觀察到細胞形態(tài)變化和細胞旁通透性過高。
[0031]圖16顯示了 EBIN(SEQ ID NO: 3)抑制激動劑誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生。HPAECs用對照肽(活性缺失)或Myr-EBIN進行預(yù)處理，且在首次20分鐘刺激中測量基底(A，響應(yīng)于L-精氨酸的加入)和激動劑誘導(dǎo)(B，凝血酶和組胺)的NO產(chǎn)生。EBIN絲毫不影響基礎(chǔ)NO水平，但顯著減弱激動劑誘導(dǎo)的NO。*，p〈0.01和**，Ρ〈0.01。
[0032]圖17顯示了 EBIN(SEQ ID NO:3)防止組胺誘導(dǎo)的體內(nèi)血管擴張。小小鼠清醒血壓測量-小鼠經(jīng)麻醉并手術(shù)準(zhǔn)備放置動脈(頸動脈)和靜脈(頸外)導(dǎo)管。在手術(shù)后一小時，直接用壓力傳感器監(jiān)控血壓。隨后通過頸靜脈導(dǎo)管進行AP-EBIN肽的靜脈注射(1.v.)(I μ M/kg體重；綠色)或?qū)φ誂P肽(紅色)和組胺(10mg/kg體重)；箭頭指示注射時間。需要注意的是，EBIN對基線血壓沒有影響，但防止了響應(yīng)于組胺的血壓下降。η = 6只小鼠/組。[0033]圖18顯示了 EBIN(SEQ ID NO: 3)防止LPS誘發(fā)的敗血癥致死。用EBIN處理的小鼠體現(xiàn)了在注射LD90劑量的LPS(50mg/kg大腸桿菌LPS0111:B4)后120小時時間段里死亡減少。雄性⑶I小鼠通過腹腔(1.p.)注射LD90劑量的LPS進行挑戰(zhàn)。試驗組和對照組接受與細胞透膜觸角足肽(AP)的C端相連的EBIN或單獨的AP以I μ M/kg的濃度進行眼窩后靜脈(1.V.)注射。小鼠經(jīng)注射三次，LPS給藥前30分鐘和LSP給藥后I小時和24小時。在眼窩后注射之前，用氯胺酮(10mg/ml)、甲苯噻嗪(0.25mg/ml)和乙酰丙嗪(0.25mg/ml)對小鼠進行麻醉。[0034]圖19比較了 EBIN(SEQ ID NO: 3)進行預(yù)處理和后處理對LPS誘發(fā)的敗血癥致死的影響。用EBIN處理的小鼠體現(xiàn)了在注射LD90劑量的LPS(50mg/kg大腸桿菌LPS0111:B4)后120小時時間段里死亡減少。雄性⑶I小鼠通過腹腔(1.P.)注射LD90劑量的LPS進行挑戰(zhàn)。試驗組和對照組在以I μ M/kg的濃度的LPS和Myr-對照失去結(jié)合的肽處理前30分鐘(預(yù)處理)和30分鐘之后(后處理)接受尾靜脈(1.V.)注射Myr-EBIN。預(yù)治療組，小鼠注射三次，LPS給藥前30分鐘和給藥后I小時和24小時；治療組，小鼠注射兩次，LPS給藥后30分鐘和24小時。在眼窩后注射之前,用氯胺酮(10mg/ml)、甲苯噻嗪(0.25mg/ml)和乙酰丙嗪(0.25mg/ml)對小鼠進行麻醉。用EBIN后處理顯示出一些但并不顯著的存活提聞。[0035]圖20顯示了 EBIN(SEQ ID NO: 3)防止IgE介導(dǎo)的過敏性反應(yīng)后皮下血管滲漏。小鼠在耳部(A)和背部(B)接受皮內(nèi)注射IgE抗體-人血清白蛋白，24小時后，靜脈注射伊文思藍(Evans Blue)和HSA (1-3)或生理鹽水(4-5)。在HAS之前30分鐘，組I和組4接受鹽水，組2接受對照肽(失去結(jié)合)以及組3和組5接受Myr-EBIN靜脈注射(I μ M/kg)。需要注意的是，HAS注射導(dǎo)致局部血管滲漏，這被EBIN明顯緩解(第3組)。C.條形圖證實了伊文思藍的血管滲漏。伊文思藍從耳組織中提取并在λ = 620nm測量伊文思藍濃度，并歸一化至組織重量。*，p〈0.05, η = 6只小鼠/組。[0036]圖21顯示了 ΕΒ3在炎癥誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障通透性過高中的作用。ΕΒ3建立生長中的MT與IP3R3之間的瞬態(tài)相互作用，使IP3R3對ΙΡ3敏化，并正調(diào)節(jié)炎癥過程中由儲備庫釋放Ca2+和SOC依賴性Ca2+內(nèi)流。這將通過PKC α -介導(dǎo)的ρ120_連環(huán)蛋白的磷酸化和肌動球蛋白收縮而導(dǎo)致Ca2+信號傳導(dǎo)放大和通透性增加。
【具體實施方式】[0037]本發(fā)明人得到驚人的發(fā)現(xiàn)，即由3型1，4，5-三磷酸肌醇(ΙΡ3)受體(IP3R3)的ΕΒ3-相互作用域衍生得到的肽降低了末端結(jié)合蛋白3 (ΕΒ3)和IP3R3之間的相互作用，并減輕了與細胞形態(tài)變化相關(guān)的血管內(nèi)皮通透性響應(yīng)。[0038]基于下面給出的實施例，但不被理論所束縛，ΕΒ3在炎癥誘發(fā)的內(nèi)皮屏障通透性過高中的作用在于其建立生長中的MT末端與IP3R3的瞬態(tài)相互作用的能力。其結(jié)果是ΕΒ3使得IP3R3對IP3敏華，且正調(diào)節(jié)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)釋放Ca2+。這導(dǎo)致了 SOC依賴性Ca2+內(nèi)流和Ca2+信號傳導(dǎo)放大。胞質(zhì)Ca2+濃度的增加誘發(fā)P120-連環(huán)蛋白的PKC α -介導(dǎo)磷酸化，導(dǎo)致VE-鈣連蛋白的粘連的解體。這也有利于RhoA蛋白依賴性肌動球蛋白收縮從而導(dǎo)致細胞形態(tài)變化。參見圖21。
[0039]以下描述的方法和材料減輕了與細胞形態(tài)變化相關(guān)的血管內(nèi)皮通透性響應(yīng)，并因此可用于治療肺損傷，包括肺部炎癥介導(dǎo)的血管滲漏和肺水腫或者任何其他器官水腫的發(fā)展，這可能與敗血癥、過敏性反應(yīng)或急性免疫響應(yīng)有關(guān)。所述方法和材料也還可以用于緩解病理過程，諸如慢性炎癥、癌癥、哮喘和動脈粥樣化形成時的慢性血管滲漏。
[0040]1.定義
[0041]本文所用的術(shù)語僅用于描述特定實施例，并不旨在進行限制的目的。如在說明書和所附的權(quán)利要求書中，單數(shù)形式“一個”、“和”和“所述”包括復(fù)數(shù)引用，除非上下文另有明確規(guī)定。
[0042]對于本文數(shù)值范圍的描述，之間插入的每個數(shù)值可被明確地預(yù)期具有相同程度的精度。例如，對于范圍6~9，除了 6和9之外，還可設(shè)想數(shù)值7和8，對于范圍6.0~7.0，則可明確地預(yù)期數(shù)值 6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9 和 7.0。
[0043]a.片段
[0044]本文所使用的“片段”意指參考肽或多肽或核酸序列的一部分。
[0045]b.同一性
[0046]在本文中描述兩種或更多種多肽或核苷酸序列時，“相同”或“同一性”意指所述序列在特定區(qū)域中具有特定百分比的殘基或核苷酸是相同的。該百分比可以如下計算，最優(yōu)化地比對兩個序列，在指定的區(qū)域內(nèi)比較兩個序列，確定在兩個序列中均出現(xiàn)的相同殘基的位置的數(shù)目從而得到匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以指定區(qū)域的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100得到序列同一性的百分比。在兩條序列具有不同長度或者比對產(chǎn)生一個或多個交錯末端，所述比較的指定區(qū)域僅包括單一序列時，單一序列的殘基包括在計算的分母中，但不包括在分子中。
[0047]c.肽
[0048]本文中使用的“肽”或“多肽”可以指氨基酸的連接序列，并且可以是天然的、合成的，或者天然和合成的序列的修改或組合。
[0049]d.基本上相同
[0050]本文中使用的“基本上相同”意指第一和第二蛋白質(zhì)或核苷酸序列在6~100個或更多氨基酸或核苷酸的區(qū)域中至少有50%~99%的同一性。
[0051]e.治療
[0052]“進行治療”、“治療”或“以治療”每個都意指臨時地或者永久地緩解、壓制、抑制、消除、預(yù)防或減緩病況或疾病的癥狀出現(xiàn)、臨床體征或潛在病理。預(yù)防病況或疾病包括在疾病發(fā)病前將本發(fā)明的試劑施用于受試者。壓制病況或疾病包括誘發(fā)了所述病況或疾病后但還未臨床表現(xiàn)出來之前將本發(fā)明的試劑施用于受試者。抑制病況或疾病包括在疾病臨床表現(xiàn)以后將本發(fā)明的試劑施用于受試者。
[0053]f.變體
[0054]“變體”意指一種肽或多肽，其氨基酸序列因插入、缺失或氨基酸的保守置換而不同，但仍保留著至少一種生物活性?！吧锘钚浴钡拇硇詫嵗ㄅc末端結(jié)合蛋白、toll樣受體(TLR)結(jié)合的能力，以及與特定抗體結(jié)合的能力。變體也可以指一種蛋白質(zhì)具有的氨基酸序列與保留著至少一種生物活性的參考蛋白的氨基酸序列基本相同。氨基酸的保守取代，即氨基酸被具有相似性質(zhì)(例如親水性、電荷區(qū)域程度和分布)的不同氨基酸替代在本領(lǐng)域中廣為所知，并通常被視為僅涉及細微變化。在本領(lǐng)域中可以理解的是，通過考慮氨基酸親水指數(shù)能部分地鑒別這些細微的變化。見，Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132 (1982)。氨基酸親水指數(shù)基于對其疏水性和電荷的考慮。在本領(lǐng)域已知具有相似親水指數(shù)的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白質(zhì)功能。在一個方面，具有親水指數(shù)±2的氨基酸可以被取代。氨基酸的親水性也可用于揭示將會使得蛋白質(zhì)保留生物功能的取代。在肽范圍內(nèi)考慮氨基酸的親水性使之能允許計算所述肽的最大局部平均親水性，已報道其為與抗原性和免疫原性相關(guān)的有用指標(biāo)。見美國專利4，554，101，其通過引用的方式完全并入本文。具有相似親水性值的氨基酸的取代能導(dǎo)致肽保留生物活性，例如免疫原性，如本領(lǐng)域理解?？梢杂帽舜怂哂械挠H水性數(shù)值±2的氨基酸進行取代。氨基酸的疏水性指數(shù)和親水性數(shù)值均受氨基酸具體側(cè)鏈的影響。與觀察一致的是，與生物功能相容的氨基酸取代可以被理解為取決于氨基酸，尤其是這些氨基酸的側(cè)鏈的相對相似性，如疏水性、親水性、電荷、大小和其他屬性所揭示的。
[0055]2.肽
[0056]本文提供的是肽，其包括氨基酸序列KFARLWTEIPTAIT (SEQ ID NO:1)的氨基酸序^lJ, KFARLffAEIPTAIT(SEQ ID N0:2)(本文中也稱為 IP3R3 肽)、FTEIPTI (SEQ ID N0:3)(本文中也稱為末端結(jié)合抑制肽或“EBIN”)、本文表3中所公開的肽、它們的片段或者它們的變體。所述變體可包括保守取代。所述肽可包括EB結(jié)合共有基序(如IP3R3的EB結(jié)合共有序列)或其片段。IP3R3的EB結(jié)合保守序列可以是Ser/Thr-x-1LE-PRO。所述肽可由 KFARLWTEIPTAIT 的(SEQ ID NO:1), KFARLffAEIPTAIT (SEQ ID NO: 2)、FTEIPTI (SEQ IDNO: 3)、包含Ser/Thr-x-1Ie-Pro的共有序列、本文表3中公開的肽、上述序列的片段或上述序列的保守變體構(gòu)成。變體 可包括含有Ser/Thr-x-1Ie-PiO序列、最小EB結(jié)合共有基序序列的任何肽序列。
[0057]所述肽可被偶聯(lián)、肉豆蘧?；蜴溄拥狡渌?如載體肽)。所述肽可以是觸足肽。
[0058]3.治療方法
[0059]本文提供了一種治療肺損傷的方法。所述肺損傷可以是肺部炎癥，其可以是炎癥介導(dǎo)的血管泄漏和/或水腫發(fā)展。所述肺損傷可以是急性肺損傷。所述肺損傷也可以是慢性血管滲漏，諸如在哮喘患者中觀察到的那樣。所述治療可以減輕慢性血管滲漏。肺損傷可以是肺部血管通透性過高，包括全身性血管通透性，如內(nèi)毒血癥。肺損傷可以與敗血癥、炎癥、嚴(yán)重多發(fā)傷、吸入唾液/胃內(nèi)容物、吸入性肺炎、休克、溺水、多次輸血、吸入刺激性或有毒煙霧、動脈粥樣化形成、機械損傷(通氣誘導(dǎo)損傷)或輻射暴露相關(guān)。本文也提供了治療哮喘和/或改善肺功能以及哮喘患者整體健康的方法。哮喘可以是過敏性哮喘，它可以是慢性或急性的。
[0060]本文還提供了一種治療過敏性反應(yīng)的方法，所述過敏性反應(yīng)諸如過敏原誘發(fā)的過敏性反應(yīng)和非變應(yīng)性過敏樣反應(yīng)，例如對顯影染料的反應(yīng)。本文還提供的是治療血管性水腫的方法，包括過敏原誘導(dǎo)的血管性水腫，如喉部水腫，其可以隨食物過敏或膜翅目昆蟲螫咬而發(fā)生。血管性水腫也可以是非過敏原誘導(dǎo)的血管性水腫，如補體因子I抑制劑缺乏或成像造影劑誘發(fā)的過敏樣反應(yīng)。
[0061]本文提供了一種治療全身性血管通透性綜合征的方法。該綜合征可因內(nèi)毒素血癥、創(chuàng)傷或多次輸血導(dǎo)致。該綜合征也因藥物治療的副作用而導(dǎo)致。藥物治療可以是全身使用IL-2來治療癌癥。本文還提供一種治療鼻塞的方法。鼻塞可能與過敏性或非過敏性鼻炎相關(guān)。鼻塞可以是刺激相關(guān)的或與呼吸道病毒有關(guān)。
[0062]所述方法包括對所述哺乳動物施用包含治療有效量的所述肽的組合物。所述組合物可以是藥物制劑。所述包含肽的組合物可與一種或多種可用于治療肺損傷的其他肽、化合物和/或藥物組合物聯(lián)合施用。所述一種或多種其他肽、化合物和/或藥物組合物可以是治療的肺損傷的任何試劑，包括但不限于預(yù)負荷減速劑(reducer)如硝酸甘油，以及利尿劑如呋塞米(速尿)。這種藥物擴張肺部和全身靜脈，從而降低進入心臟和肺部的流體壓力。其他一種或多種化合物包括后填裝的還原劑。這些藥物擴張周圍血管并減掉對左心室的壓力負荷。后負荷減速劑的一些例子包括硝普鈉(Nitropress)、依那普利(Vasotec)和卡托普利(開博通)，
[0063]a.受試對象
[0064]受試對象可以是哺乳動物，其可以是人類。在診斷前，受試對象可以由于暴露于一種或多種危險因素、心臟問題等等而具有肺損傷風(fēng)險。所述一種或多種危險因素包括例如受試對象具有癌癥家族史、年齡、吸煙、飲用含酒精飲料和/或和/或飲食缺乏。受試對象可能暴露于有毒氣體或輻射、機械供氧。受試對象可以患有燒傷創(chuàng)面、炎癥、嚴(yán)重多發(fā)傷、吸入唾液/胃內(nèi)容物、吸入性肺炎、敗血癥、休克、溺水、多次輸血。
[0065]b.施用
[0066]利用本文所述的方法進行肽的施用可以是全身、口服、腸胃外、舌下、穿透皮、經(jīng)直腸、穿透粘膜、局部、經(jīng)吸入、經(jīng)口腔給藥、經(jīng)鼻進行施用，或者它們的組合。腸胃外施用包括但不限于靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)施用。施用還可以是皮下、靜脈內(nèi)、經(jīng)由內(nèi)空氣通道或腫瘤內(nèi)。至于獸醫(yī)用途，可以根據(jù)常規(guī)獸醫(yī)實踐當(dāng)作適當(dāng)可接受的制劑施用所述肽。獸醫(yī)可以容易地確定最適合于特定動物的劑量方案和施用途徑。所述肽可以施用于人類患者、貓、狗、大型動物或禽類。
[0067]所述肽可以作為單一療法施用或者同時地或有規(guī)律地與其他治療一起施用，其他治療可以是腫瘤外科手術(shù)或切除。本文所使用的術(shù)語“同時的”或“同時地”意指肽和其他治療相互在48小時內(nèi)施用，優(yōu)選24小時,更優(yōu)選12小時,還更優(yōu)選為6小時,最優(yōu)選3小時或更少時間內(nèi)。本文所用的術(shù)語“有規(guī)律地”意指所述肽的施用時間與其它治療不同，并且以一定頻率相對重復(fù)施用。
[0068]所述肽可以在另一治療前的任何時間點進行施用，包括約120小時、118小時、116小時、114小時、112小時、110小時、108小時、106小時、104小時、102小時、100小時、98小時、96小時、94小時、92小時、90小時、88小時、86小時、84小時、82小時、80小時、78小時、76小時、74小時、72小時、70小時、68小時、66小時、64小時、62小時、60小時、58小時、56小時、54小時、52小時、50小時、48小時、46小時、44小時、42小時、40小時、38小時、36小時、34小時、32小時、30小時、28小時、26小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、I小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、26分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘和I分鐘。所述肽可在第二肽治療之前的任何時間點進行施用，包括約120小時、118小時、116小時、114小時、112小時、110小時、108小時、106小時、104小時、102小時、100小時、98小時、96小時、94小時、92小時、90小時、88小時、86小時、84小時、82小時、80小時、78小時、76小時、74小時、72小時、70小時、68小時、66小時、64小時、62小時、60小時、58小時、56小時、54小時、52小時、50小時、48小時、46小時、44小時、42小時、40小時、38小時、36小時、34小時、32小時、30小時、28小時、26小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、I小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘和I分鐘。
[0069]所述肽可以在另一治療后的任一時間點進行施用，包括約I分鐘、2分鐘、3分鐘、4分鐘、5分鐘、6分鐘、7分鐘、8分鐘、9分鐘、10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、I小時、2小時、3小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、26小時、28小時、30小時、32小時、34小時、36小時、38小時、40小時、42小時、44小時、46小時、48小時、50小時、52小時、54小時、56小時、58小時、60小時、62小時、64小時、66小時、68小時、70小時、72小時、74小時、76小時、78小時、80小時、82小時、84小時、86小時、88小時、90小時、92小時、94小時、96小時、98小時、100小時、102小時、104小時、106小時、108小時、110小時、112小時、114小時、116小時、118小時和120小時。所述肽可可在第二肽治療之后的任何時間點進行施用，包括約120小時、118小時、116小時、114小時、112小時、110小時、108小時、106小時、104小時、102小時、100小時、98小時、96小時、94小時、92小時、90小時、88小時、86小時、84小時、82小時、80小時、78小時、76小時、74小時、72小時、70小時、68小時、66小時、64小時、62小時、60小時、58小時、56小時、54小時、52小時、50小時、48小時、46小時、44小時、42小時、40小時、38小時、36小時、34小時、32小時、30小時、28小時、26小時、24小時、22小時、20小時、18小時、16小時、14小時、12小時、10小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、I小時、55分鐘、50分鐘、45分鐘、40分鐘、35分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘和I分鐘。
[0070]c.制劑
[0071]所述方法可包括施用所述肽。本文所提供的肽可以是以常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。例如，用于口服施用的片劑和膠囊劑可含有常規(guī)的賦形劑，可以是粘合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑和潤濕劑。粘合劑包括但不限于糖漿、阿拉伯膠、明膠、山梨醇、黃蓍膠、淀粉粘液和聚乙烯吡咯烷酮。填充劑可以是乳糖、蔗糖、微晶纖維素、玉米淀粉、磷酸鈣和山梨醇。潤滑劑包括但不限于硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石粉、聚乙二醇和二氧化硅。崩解劑可以是馬鈴薯淀粉和淀粉乙醇酸鈉。潤濕劑可以是十二烷基硫酸鈉。片劑可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進行包衣。
[0072]本發(fā)明提供的肽也可以是液體制劑，諸如水溶液或油狀懸浮液、溶液、乳液、糖漿和酏劑。所述肽也可配制成干燥產(chǎn)品，在使用前用水貨其他適宜的載劑進行復(fù)建。這種液體制劑可以含有添加劑諸如助懸劑、乳化劑、非水載劑和防腐劑。助懸劑可以是山梨糖醇糖漿、甲基纖維素、葡萄糖/蔗糖糖漿、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠和氫化食用脂肪。乳化劑可以是卵磷脂、脫水山梨醇單油酸酯和阿拉伯膠。非水性載劑可以是食用油、杏仁油、分餾椰子油、油酯、丙二醇和乙醇。防腐劑可以是甲基或丙基對-羥基苯甲酸酯和山梨酸。
[0073]本文提供的多肽也可以配制成栓劑，其可包含栓劑基質(zhì)諸如可可脂或甘油酯。本文提供的多肽也可以配制用于吸入，其可以為諸如溶液、懸浮液或乳液的形式，可以使用推進劑如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷以干粉或氣溶膠形式進行施用。本文提供的肽也可配制成透皮制劑，包括水性或非水性的載劑，如乳膏、軟膏、洗劑、糊劑、含藥硬膏劑、貼劑或膜劑。
[0074]本文提供的多肽也可以配制用于腸胃外施用，例如通過注射、瘤內(nèi)注射或連續(xù)輸注。用于注射的制劑可以是懸浮液、溶液或在油性或水性載劑中的乳液形式，并可含有調(diào)制劑，包括但不限于懸浮劑、穩(wěn)定劑和分散劑。所述肽也可以以粉末形式提供的用于采用合適的載劑進行復(fù)建，合適的載劑包括但不限于無菌無熱原水。
[0075]本文提供的多肽也可以配制成長效制劑，可以通過植入或通過肌內(nèi)注射施用。所述肽可用適宜的聚合或疏水材料(例如，可接受的油中形成乳液)、離子交換樹脂，或作為微溶的衍生物(例如微溶的鹽)進行配制
[0076]d.劑量
[0077]所述方法可包括將治療有效量的肽施用于有需要的患者。治療中所需要的治療有效量隨需要治療的病況性質(zhì)、激活TLR活性所需時間以及患者年齡/狀況而變化。然而，在一般情況下，用于成人治療的劑量通常是在每天0.001mg/kg至約200mg/kg范圍內(nèi)。劑量可以是每天約0.05mg/kg至約10g/kg。所需劑量可便利地以單一劑量，或作為多劑量以適當(dāng)?shù)拈g隔施用，例如為每天兩個、三個、四個或更多個分劑量。多劑量可以是希望的或者要求的。`
[0078]所述劑量可以是任何劑量，例如約0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.lmg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、lmg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、225mg/kg、250mg/kg、275mg/kg、300mg/kg、325mg/kg、350mg/kg、375mg/kg、400mg/kg、425mg/kg、450mg/kg、475mg/kg、500mg/kg、525mg/kg、550mg/kg、575mg/kg、600mg/kg、625mg/kg、650mg/kg、675mg/kg、700mg/kg、725mg/kg、750mg/kg、775mg/kg、800mg/kg、825mg/kg、850mg/kg、875mg/kg、900mg/kg、925mg/kg、950mg/kg、975mg/kg、lg/kg,2g/kg、3g/kg、4g/kg,5g/kg、6g/kg、7g/kg、8g/kg、9g/kg 或 10g/kg。
[0079]4.試劑盒
[0080]本文提供的試劑盒，其可用于治療肺損傷。所述試劑盒可包含一種或多種所述肽。這些肽可以是藥物組合物的一部分。所述試劑盒還可包括施用該試劑盒以及進行施用所述肽或制劑的說明書。
[0081]所述試劑盒還可包括一個或多個容器，如小瓶或瓶子，每個容器裝不同的試劑。所述試劑盒還可包括書面指南，描述如何執(zhí)行或解讀本文所描述的方法。
[0082]本發(fā)明具有多個方面，通過以下非限制性實施例進行說明。
[0083]實施例[0084]實施例1
[0085]EB3的缺失抑制從儲備庫釋放Ca2+
[0086]以往的工作表明MT的細胞骨架在調(diào)節(jié)從ER儲備庫中IP3-門控釋放Ca2+的作用。測試了 EB3調(diào)節(jié)位于PAR-1信號傳導(dǎo)下游的從IP3-敏感儲備庫中釋放Ca2+的能力。測定了在響應(yīng)于PAR-1激活而向EB1、EB3和熒光酶表達shRNA的HMECs中的胞內(nèi)Ca2+濃度變化(圖1)。由于我們的基于載體的SiRNA構(gòu)建體被克隆到GFP-Cl載體中，所以我們能夠比較來自于同一蓋玻片的非轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)染細胞。與對照非轉(zhuǎn)染細胞或向熒光酶表達shRNA的細胞相比，EBl的缺失對于從儲備庫從釋放Ca2+沒有任何影響。相比而言，EB3的缺失導(dǎo)致顯著的Ca2+釋放的抑制，從而導(dǎo)致減小的Ca2+內(nèi)流。EBl和EB3的同時缺失與EB3的單獨缺失的效果相當(dāng)(圖1B)。這些數(shù)據(jù)表明，EB3對于ER的Ca2+耗竭是必須的。
[0087]實施例2
[0088]EB3互動中的Ca2+IP3門控釋放機制作用與IP3R
[0089]確定了 EB3是否與IP3R3型相互作用，其活性對于EC中凝血酶誘導(dǎo)的Ca2+釋放至關(guān)重要。小鼠用亞致死量的LPS挑戰(zhàn)并確定了 EB3與IP3R3和TRPCl (SOC)通道的關(guān)聯(lián)。如如圖2所示，EB3與IP3R3在靜息內(nèi)皮微血管中相互作用，在LPS-誘發(fā)的肺部炎癥中該相互作用的水平提高。有趣的是，在發(fā)生炎癥的肺中(LPS刺激3小時)，也在EB3沉淀中發(fā)現(xiàn)TRPC1。并沒有在TLR4(LPS受體)KO小鼠中發(fā)現(xiàn)這些變化，從而表明這些相互作用和炎癥的因果關(guān)系。
[0090]有趣的是，IP3R3含有EB結(jié)合共有基序，Ser/Thr-x-1Ie-Pro (SxIP)?；贗P3R3序列(KFARLWTEIPTAIT-SEQ ID NO:1)的短肽(圖3)顯示出結(jié)合EB3的高結(jié)合活性，結(jié)合自由能為-68.882kcal/mol e (圖4)。用IOnM的附著于細胞透膜觸角足肽(AP)的C-端的IP3R3序列預(yù)處理細胞能顯著地降低響應(yīng)于凝血酶而從儲備庫中釋放Ca2+(圖5A)，這表明IP3R3和EB3之間的相互作用在IP3R激活機制中是至關(guān)重要的。IP3I^i和紫杉醇調(diào)節(jié)Ca2+釋放的作用進行了比較。人們發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理細胞與在凝血酶刺激用5 μ g/ml的紫杉醇預(yù)處理20分鐘的細胞抑制了從ER釋放Ca2+的程度與IP3R3肽相同(圖5B)。
[0091]實施例3
[0092]IP3R3肽防止發(fā)炎誘發(fā)的肺血管滲漏和敗血癥致死
[0093]為了闡述EB3/IP3R相互作用在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性中的作用，我們使用了離體肺標(biāo)本。在輸注PAR-1激動劑肽之前，用該肽注入肺中30分鐘，且EB3和IP3R3之間的相互作用由IP檢測來測定(圖6)。與基礎(chǔ)水平相比，PAR-1受體活化顯著增加EB3/IP3R3相互作用，然而在活化肺微血管中，豐富的IP3R3肽抑制這種相互作用。因此，根據(jù)微血管過濾系數(shù)，Ktc的變化所測定，IP3R3肽可減少肺血管通透性的增加。圖7證實IP3R3肽顯著地減弱了響應(yīng)于PAR-活化而造成的微血管通透性增加。這些數(shù)據(jù)表明EB3和IP3R之間的相互作用對于肺部炎癥誘發(fā)的血管滲透和水腫的發(fā)展可能是關(guān)鍵重要的。
[0094]最近的研究證實，血管滲漏是造成敗血癥致死的關(guān)鍵因素。IP3R3肽的藥理作用在LPS誘發(fā)敗血癥小鼠模型中進行測試。用腹膜內(nèi)注射(1.p.)LPS(30mg/kg體重)挑戰(zhàn)雄性CDl小鼠，并測定肺部嗜中性粒細胞的浸潤，其為肺部炎癥的指標(biāo)。肺經(jīng)PBS灌注、稱重、冷凍，再用于測量肺髓過氧化物酶(MPO)活性，其為激活中性粒細胞的標(biāo)志。如圖8所示，與對照組相比，在LPS挑戰(zhàn)之前30分鐘用IP3R3肽處理的小鼠明顯地減少了 LPS挑戰(zhàn)之后2小時和6小時時的肺嗜中性粒細胞的浸潤。這一觀察表明，IP3R3肽減輕了 LPS誘導(dǎo)的肺部炎癥和損傷。因此，在LPS施用前30分鐘和I小時候，接受IP3R3肽治療的小鼠證實在LD50-和LD80挑戰(zhàn)的對照組中顯著提高的存活率(圖9)。此外，還確定了 IP3R3肽是否可以防止盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)誘發(fā)的多種細菌敗血癥。CLP會造成致命的腹膜炎，且伴有急性肺損傷(ALI)。在實驗性嚙齒動物中存在例外以及臨床相關(guān)方法。圖10顯示了 IP3R3肽改善了 CLP之后動物的存活。盡管90%的對照組小鼠在第一個48小時內(nèi)死亡，而術(shù)前24小時和術(shù)后48個小時注射IP3R3的動物證實顯著更高的存活率。
[0095]這些數(shù)據(jù)表明，IP3R3肽衍生物肽可潛在地用于預(yù)防肺動脈通透性過高以及緩解如炎癥和動脈粥樣化形成等病理過程中慢性血管滲漏。在LPS誘發(fā)敗血癥小鼠模型中進一步測試了 IP3R3肽的劑量響應(yīng)。通過腹膜內(nèi)注射LD80劑量的LPS挑戰(zhàn)雄性⑶I小鼠。以每公斤體重0.01、0.033,0.1,0.33、1.0、3.3和10 μ M的劑量對小鼠眼窩后靜脈注射IP3R3肽。小鼠接受3次IP3R3肽注射，LPS給藥前30分鐘，給藥后在I小時和24小時。每組中動物存活百分比作為IP3R3劑量的函數(shù)進行繪圖。圖11顯示IP3R3肽從0.033 μ M/kg起改善對照組的存活率，并在I μ M/kg時達到最大效力。增加IP3R3劑量并不會導(dǎo)致進一步的改善，但重要的是也不會引起動物死亡。這些數(shù)據(jù)表明，IP3R3肽在該劑量范圍內(nèi)具有低毒性。使用3-參數(shù)對數(shù)等式計算ED5tl (有效劑量，50% )為80nM/kg:
[0096]y =最小值+ (最大值+最小值)/1 + 10LogED5°-x
[0097]其中min和max是最小和最大響應(yīng)值。所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表明，IP3R3是具有高效力和低毒性的潛在藥物。與紫杉醇不同的是，該藥物預(yù)計不會表現(xiàn)出一般毒性。
[0098]EB3正調(diào)控從ER儲備庫中釋放Ca2+，從而增加響應(yīng)于促炎癥刺激的內(nèi)皮細胞屏障通透性。EB3和IP3R之間的 相互作用對于IP3門控釋放Ca2+的機制是關(guān)鍵重要的。IP3R3肽阻止肺部炎癥介導(dǎo)的血管滲漏和水腫的發(fā)展，并且和顯著提高兩種不同的敗血癥模型中小鼠的存活。
[0099]實施例4
[0100]確定在內(nèi)皮細胞通透性提高和肺水腫形成機制中Ca2+信號傳遞的EB3調(diào)節(jié)作用
[0101]我們假定位于MT末端的EB3與ER的動態(tài)相互作用對于在響應(yīng)于促炎介導(dǎo)子的Ca2+波傳遞和提高內(nèi)皮細胞屏障通透性是必須的。
[0102]假設(shè):從ER中IP3-門控釋放Ca2+的EB3調(diào)節(jié)對于內(nèi)皮細胞通透性的MT依賴性增加是必須的。我們將闡釋以下觀點，即在生長中的MT末端的EB3聚集有利于EB3與IP3R的瞬時相互作用，并正調(diào)節(jié)從儲備庫中釋放Ca2+，從而導(dǎo)致SOC依賴性Ca2+內(nèi)流，Ca2+-依賴性PKCa亞型的激活，PKCa介導(dǎo)的pl20_連環(huán)蛋白磷酸化和VE-鈣連蛋白的內(nèi)化(如圖21中的模型進行假設(shè))。
[0103]實施例5
[0104]EB3在調(diào)控持續(xù)MT生長和IP3R激活中的作用
[0105]MT-失穩(wěn)劑和穩(wěn)定劑抑制IP3誘導(dǎo)的Ca2+釋放11_13。我們的初步數(shù)據(jù)顯示出在血管內(nèi)皮細胞中缺失EB3但不缺失EBl也抑制PAR-1介導(dǎo)的從儲備庫中釋放Ca2+。我們將確定EB3是否間接地通過MT動力學(xué)的調(diào)節(jié)從ER中IP3誘導(dǎo)釋放Ca2+。我們將確定如us20所示的通過表達人工EB2 二聚體從而在EB3缺失細胞中恢復(fù)MT持續(xù)生長,是不是也能恢復(fù)從ER中PAR-1介導(dǎo)釋放Ca2+。由于人工二聚體EB3-NL-LZ是完全沒有任何負責(zé)結(jié)合已知EB伴侶的結(jié)構(gòu)域，如果EB3和IP3R之間的相互作用對于IP3R的激活是至關(guān)重要的，那么并不能預(yù)期可以恢復(fù)IP3誘導(dǎo)的Ca2+釋放。因此，如果我們觀察到表達人工EB3 二聚體的細胞中IP3R活性的恢復(fù)，我們將得出結(jié)論，通過MT動力學(xué)，EB3間接地調(diào)節(jié)激動劑誘導(dǎo)的從ER中釋放Ca2+。這個實驗將闡述由HMLVECs的Fura2_AM的340/380比例成像所評估的從ER中凝血酶介導(dǎo)釋放Ca2+，以及細胞外Ca2+內(nèi)流。根據(jù)我們的假設(shè)的有效性，我們預(yù)測EB3-NL-LZ的表達不會恢復(fù)從ER中激動劑誘發(fā)釋放Ca2+。
[0106]實施例6
[0107]EB3與IP3R相互作用在IP3R胞內(nèi)分布中的作用
[0108]在我們的數(shù)據(jù)的前提下，我們提出EB3和IP3R3型之間的相互作用可能在受體激活的機制是非常重要的。IP3R包含Ser/Thr-x-1le-Pro (SxIP)共有基序(圖17)，這是EB-相互作用伴侶的特定標(biāo)志。在該基序附近Ser或Thr的磷酸化顯著減低了 EBl與其已知伴侶的親和力。我們將測定與AP序列融合的短IP3R序列肽(798-811 ；KFARLffTEIPTAIT-SEQID NO:1)是否擾亂IP3R和EB3之間的相互作用，以及它是否能抑制凝血酶誘導(dǎo)的IP3-門控Ca2+釋放。因為存在一些可能，肽可在細胞中被磷酸化，我們將表達Avi標(biāo)記的IP3R肽，并用放射自顯影確定其磷酸化。如果我們發(fā)現(xiàn)肽被磷酸化，我們將使用磷酸化缺陷肽，其中第一個Thr將被替換為Ala(磷酸化缺陷肽；KFARLWAEIPTAIT_SEQ ID N0:2)，對于所有其他研究而言更有效。所述肽與EB3的結(jié)合將通過co-1P和下拉測驗(pull-down assay)在細胞內(nèi)和體外得到證實。我們將使用這種肽破壞細胞中EB3和IP3R之間的相互作用。我們期望IP3R肽會抑制響應(yīng)于凝血酶從儲備庫中釋放Ca2+。
[0109]我們將研究EB3缺失或者用阻斷肽抑制EB3和IP3R之間的相互作用是否改變IP3R的細胞內(nèi)分布。在肺內(nèi)皮微脈管系統(tǒng)中主要表達IP3R2型和3型。對于激動劑誘導(dǎo)的從儲備庫中釋放Ca2+需要將IP3R3型募集到細胞膜穴樣內(nèi)陷(caveolae)中?？紤]到相對較低的IP3對IP3R3型的固有親和力，該受體在IP3產(chǎn)生位點附近區(qū)域定位是IP3-門控釋放Ca2+的關(guān)鍵。因此，我們 將測試EB3是否調(diào)控ER膜通過IP3R3/TRPC1/TRPC4復(fù)合體系連于細胞膜穴樣內(nèi)陷。我們將通過免疫熒光染色和活細胞成像測定在凝血酶刺激過程中，IP3R3受體的細胞內(nèi)分布。如果我們發(fā)現(xiàn)EB3通過將IP3R3的束縛于細胞膜穴樣內(nèi)陷而調(diào)控Ca2+的IP3門控釋放，我們將確定EB3是否有利于IP3R3和TRPC1/TRPC4之間的相互作用。
[0110]實施例7
[0111]EB3在激動劑誘導(dǎo)IP3R磷酸化機制中的作用
[0112]IP3R包含16個CaM激酶II (CaMKII的)26-28的潛在位點，且CaMKII介導(dǎo)的磷酸化增加受體對IP3的敏感性。Thr804，一個經(jīng)預(yù)測的CaMKII磷酸化位點(圖17)位于651-1130區(qū)域，其對于IP3結(jié)合和通道開放之間的功能耦合是至關(guān)重要的。因此，Thr804的磷酸化在IP3-誘導(dǎo)通道開放機制中起到重要作用。EB3結(jié)合CaM并可能精心協(xié)調(diào)CaMKII的空間和時間激活以及受體磷酸化。為了驗證該觀點，我們將測定EB3的缺失或者用特定肽干擾EB3和IP3R之間的相互作用是否會抑制IP3RR磷酸化。IP3R磷酸化水平將通過放射自顯影進行評估。我們預(yù)計，EB3缺失和IP3R肽都將降低IP3R磷酸化水平。將通過磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定磷酸化位點。在用伴刀豆球蛋白A小珠進行凝血酶處理之前和之后從HLMVECs中純化內(nèi)源性IP3R。通過比較采用或者不采用CaMKII抑制劑得到的磷酸化譜圖來確定CaMIKK位點的特異性。我們將突變CaMKII位點并確定它們在IP3R3細胞內(nèi)分布和IP3-門控釋放Ca2+中的意義。
[0113]另一系列實驗中，將確定IP3R的CaMKII依賴性磷酸化是否與質(zhì)膜上所述受體與TRPC1/4的結(jié)合相耦合。磷酸化可能會從生長的MT尖端釋放IP3R并誘導(dǎo)其與TRPC1/4結(jié)合。在小腸上皮細胞、胰腺腺泡細胞和表面粘液細胞的頂端區(qū)域觀察到CaMKII和IP3R3的協(xié)同定位。因此，在內(nèi)皮細胞的腔表面也可能發(fā)生CaMKII和IP3R3的協(xié)同分布。我們將首先確認(rèn)在靜息和凝血酶刺激HLMVECs中IP3R3與CaMKII的協(xié)同定位。我們也將通過FRET分析確定受體和激酶之間的相互作用。CaMKII的活性將使用基于FRET的生物傳感器，Camui33(從Yasunori Hayashi,日本獲得)進行評估。EB3在CaMKII的空間活化中的作用也將用相同方法進行確定。 [0114]實施例8
[0115]與IP3R EB3相互作用的SOC誘發(fā)Ca2+內(nèi)流的機制作用。
[0116]ER儲備庫耗竭對于SOC激活的機制和Ca2+內(nèi)流34_36是重要的。一致的是，我們發(fā)現(xiàn)EB3缺失而EBl不缺失將降低Ca2+內(nèi)流。在我們的初步數(shù)據(jù)的前提下，我們假設(shè)EB3的缺失將抑制凝血酶誘導(dǎo)激活TRPCl和TRPC4，它們是內(nèi)皮細胞主要的SOC通道。為了直接驗證這種可能性，用EB3siRNA或IP3R3肽處理的HLMVECs將被用于在全細胞膜片鉗測定法中于-50mV測量凝血酶誘導(dǎo)和La3+敏感的內(nèi)向電流。我們也將評估電流-電壓(1-V)的關(guān)系(-100至+IOOmV)以證實激活通道的反轉(zhuǎn)電位。這一結(jié)果將與用其中IP3R3被siRNA耗盡或者被IP3R拮抗劑2-氨基乙氧基硼酸(2-APB)抑制的HLMVECs獲得的數(shù)據(jù)進行比較?；パa實驗將驗證，與EB3缺失相比，用特定的抗體或者用siRNA分別地或者同時地失活TRPCl和TRPC4是否會對全細胞電導(dǎo)產(chǎn)生相類似的效果。在我們假設(shè)正確的基礎(chǔ)上，我們預(yù)EB3的缺失將抑制Ca2+通過TRPC1/4通道內(nèi)流。這些實驗中將伴隨進行用Fura2_AM比例影像測量細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。
[0117]另一組實驗中，將確定EB3缺失是否能抑制毒胡蘿卜素(TG)-或IP3-誘導(dǎo)的(細胞內(nèi)輸送my微注射)SOC激活和Ca2+的內(nèi)流。TG抑制肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶并導(dǎo)致獨立于IP3R激活的從ER中耗竭Ca2+。這兩種方法都有望在對照siRNA處理的細胞中誘導(dǎo)SOC的激活引起的Ca2+內(nèi)流，然而EB3缺失將僅僅在IP3-誘導(dǎo)的IP3R激活的情況下抑制Ca2+內(nèi)流。這個實驗將區(qū)分EB3通過IP3R的激活間接還是直接地(如果EB3 (或者MR動力學(xué)變化)對SOC通道本身的激活有任何作用)參與調(diào)控SOC-引起的Ca2+內(nèi)流。我們還將評估的全細胞電導(dǎo)和電流-電壓(IV)的關(guān)系，以證明這些實驗中TRPC1/4通道的活性。
[0118]實施例9
[0119]EB3與IP3R相互作用在增加內(nèi)皮細胞通透性和形成水腫的機制中的作用。
[0120]我們將確定EB3和IP3R之間的相互作用導(dǎo)致的Ca2+信號傳遞的傳播是否增強了響應(yīng)于PAR-1活化的通透性增加。在這方面，我們將討論用IP3R阻斷肽處理的細胞和肺中滲透性屏障增加。我們將通過測量TER和跨內(nèi)皮變化白蛋白通量作為內(nèi)皮屏障改變的功能性量度指標(biāo)來評估內(nèi)皮通透性增加。將通過免疫染色，通過VE-鈣連蛋白內(nèi)化的定量分析(使用生物素測定法)，通過VE-鈣連蛋白和pl20-連環(huán)蛋白的相互作用來測定AJ的完整性以及細胞內(nèi)間隙的形成。在我們假設(shè)有效的基礎(chǔ)上，我們預(yù)計，在細胞內(nèi)Ca2+濃度增加受到抑制將導(dǎo)致減少通透性響應(yīng)，這反映在更少的細胞內(nèi)間隙形成和更穩(wěn)定的VE-鈣連蛋白結(jié)合。由于增加的細胞內(nèi)Ca2+激活PKCa，其通過磷酸化pl20_連環(huán)蛋白介導(dǎo)AJ的解體，我們將確定PKC a激活的水平和PKC a特異性位點Ser879上pl20_連環(huán)蛋白磷酸化的水平。為確定在EP3缺失細胞中或者用IP3R3肽預(yù)處理的細胞中，PAR-1介導(dǎo)的細胞收縮是否也受到抑制，我們將分析RhoA蛋白和MLCK-L活化的水平。將使用IP3R3缺失細胞或者從IP3R3-/-小鼠37中分離的或肺微血管內(nèi)皮細胞作為比較。[0121]為確定EB3和IP3R之間的相互作用是否加強了微血管通透性和肺水腫的激動劑誘導(dǎo)增加。我們將使用離體肺模型。小鼠灌注肺標(biāo)本將用于確定細胞滲透IP3R肽是否抑制PAR-1-介導(dǎo)的肺血管通透性增加。通過在PARl激動劑肽輸注后測量毛細血管濾過系數(shù)(Kf；c)和肺部經(jīng)血管1251-白蛋白流來評估內(nèi)皮微血管通透性。我們也將使用IP3R3-/-小鼠(由Katsuhiko Mikoshiba,日本獲得)或其中IP3R3由siRNA耗盡的小鼠以驗證用肽所獲得的結(jié)果。如果我們設(shè)想IP3R和EB3之間的相互作用對于調(diào)控激動劑誘導(dǎo)的肺微血管通透性增加是至關(guān)重要的，那么我們預(yù)料IP3R肽和IP3R3-/-將產(chǎn)生類似的結(jié)果，揭示了響應(yīng)于PAR-1激活的微血管通透性增加的部分抑制。
[0122]這些研究的目的是確定EB3在調(diào)節(jié)從ER儲備庫中IP3-門控釋放Ca2+中的作用。我們將確定EB3和IP3R之間的相互作用在IP3R磷酸化和ER易位到質(zhì)膜心尖的機制中的意義?；谖覀兊募僭O(shè)，我們預(yù)計EB3和IP3R之間的相互作用提供了 IP3R激活的一個控制點。在我們假設(shè)有效的基礎(chǔ)上，我們預(yù)測，破壞EB3與IP3R相互作用會抑制從ER儲備庫中釋放Ca2+，并將在細胞培養(yǎng)和肺中消除增加的通透性響應(yīng)。我們將研究以下機理模型驗證EB3/IP3R相互作用調(diào)控Ca2+的IP3-門控釋放，I)通過將IP3R3束縛于細胞膜穴樣內(nèi)陷，IP3產(chǎn)生區(qū)域附近，和2)通過由CaMKII促進IP3R3磷酸化。因此，細胞培養(yǎng)試驗以及肺微血管研究將鑒定出通過何種機制EB3調(diào)控IP3R3活性。對于在檢驗假設(shè)的基礎(chǔ)上從這些研究中得到嶄新結(jié)論我們并沒有預(yù)料會出現(xiàn)問題。所有提出的技術(shù)均已在我們的或者合作者的實驗室中建立，因此也都是可行的。
[0123]在靜息細胞中，MT骨架在維護內(nèi)皮屏障中起著重要作用，并提供了通過促炎刺激介導(dǎo)從而加強內(nèi)皮細胞通透性提高的機制。EB3，一種MT末端結(jié)合蛋白，其通過促進持續(xù)的MT生長以調(diào)控MT動力學(xué)，并因此EB3抗突變活性可能是控制MT細胞骨架重組以及諸如急性肺損傷(ALI)和成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)等炎性疾病時內(nèi)皮屏障功能喪失的主要機制。所提議的研究將驗證在提高的內(nèi)皮細胞通透性和水腫形成機制中，EB3在調(diào)控響應(yīng)于PAR-1激活的從ER儲備庫中IP3-門控釋放Ca2+中的作用。我們將確定在Ca2+波的組織和傳播機制中潛在重要的EB3和IP3R3相互作用，其介導(dǎo)了通過PKCa-介導(dǎo)的AJ解體和RhoA/MLCK-L-驅(qū)動肌動球蛋白收縮而提高的內(nèi)皮通透性。
[0124]實施例10
[0125]IP3R3肽截斷對與EB3結(jié)合的影響
[0126]計算機模擬計算建模用于估算KFARLWTEIPTAIT肽(SEQ ID NO:1)中每個殘基對于結(jié)合自由能的能量貢獻。氨基酸序列KFARLWTEIPTAIT (SEQ ID NO:1)的截斷變體被安放在EB3界面中并計算相互作用的自由能(表1)。該數(shù)據(jù)表明，Thr-X-1le-PiO具有最低的結(jié)合能，而側(cè)翼氨基酸在穩(wěn)定EB3和肽之間的相互作用中起到關(guān)鍵作用。
[0127]表1環(huán)繞IP3R3肽的Thr-X-1le-PiO基序的氨基酸殘基揭短后自由能計算變化值
[0128]
【權(quán)利要求】
1.一種分離的肽，其由選自 KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1)、FTEIPTI (SEQ ID NO:3)以及它們的片段或變體的氨基酸序列組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肽，其中所述肽與載體肽相連。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的肽，其中所述載體肽是觸角足肽(AP)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的肽，其中所述肽經(jīng)肉豆蘧?；?。
5.一種藥物制劑，其包含藥學(xué)上可接受的賦形劑和權(quán)利要求1的肽。
6.一種治療肺損傷的方法，其包括向有此需要的患者施用包含權(quán)利要求1的肽的組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述肺損傷是水腫。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述肺損傷是炎癥介導(dǎo)的血管滲漏。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述肺損傷是哮喘。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述哮喘是過敏性哮喘。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述哮喘是慢性或急性的。
12.—種治療全身性血管通透綜合征的方法，其包括向有此需要的患者施用包含權(quán)利要求I的肽的組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述全身性血管通透綜合征是由內(nèi)毒素血癥引起。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述全身性血管通透綜合征是由創(chuàng)傷引起。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述全身性血管通透綜合征是由多次輸血引起。
16.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中全身性血管通透綜合征是藥物治療副作用所引起。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述藥物治療是全身使用IL-2以治療癌癥。
18.一種治療血管性水腫的方法，其包括向有此需要的患者施用包含權(quán)利要求1的肽的組合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述血管性水腫選自由過敏原誘發(fā)的血管性水腫和非過敏原誘發(fā)的血管性水腫。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述過敏原誘發(fā)的血管性水腫是喉部血管性水腫。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述喉部血管性水腫隨食物過敏或膜翅目昆蟲螫咬傷而發(fā)生。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所述非過敏原誘發(fā)的血管性水腫是補體因子I抑制劑缺乏或成像造影劑誘發(fā)的血管性水腫。
23.一種治療過敏性反應(yīng)的方法，其包括向有此需要的患者施用包含權(quán)利要求1的肽的組合物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述過敏性反應(yīng)選自過敏原誘發(fā)和非變應(yīng)性過敏樣反應(yīng)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述非變應(yīng)性過敏樣反應(yīng)由顯影劑引起。
26.一種治療與過敏性或非過敏性鼻炎相關(guān)的鼻塞的方法，其包括向有此需要的患者施用包含權(quán)利要求1的肽的組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述鼻塞與刺激相關(guān)或與呼吸系統(tǒng)病毒相關(guān)。
28.一種分離的肽，其包含選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3以及它們的片段和變體的序列。
【文檔編號】A61P11/06GK103608026SQ201280029277
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2012年6月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月13日
【發(fā)明者】Y.A.科馬羅娃, U.薩基布, S.M.沃格爾, A.B.馬利克 申請人:伊利諾伊大學(xué)受托管理委員會