專利名稱：一種從神秘果中提取神秘素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神秘果神秘素的高效提取和神秘果果汁飲料的制備，具體涉及一種從神秘果中提取神秘素的方法。
背景技術(shù)：
神秘果(Richadella dulcifica)屬山欖科神秘果屬，為常綠灌木植物,原產(chǎn)西非熱帶地區(qū)，自然分布在西非剛果一帶。我國于60年代引入種植，在海南、云南、廣西等熱帶亞熱帶地區(qū)生長良好。神秘果的神秘之處在于可將酸性食物在數(shù)小時內(nèi)變成甜味，經(jīng)研究證明該變味成分為糖蛋白，稱為神秘素(Miraculin)。因此,可將其神秘素制成酸性食品的助食劑，也可制成滿足糖尿病人對甜味需要的變味劑。然而，神秘果皮薄多汁，果實成熟期氣溫較高，空氣濕度大，采摘后的鮮果在自然條件下極易變軟腐爛。而神秘素對環(huán)境的要求更是苛刻，在o°c以上和中堿性條件下容易失活。而且神秘素本身難溶于水，與神秘果體內(nèi)多種成分緊密相連，增加了其提升難度。由于神秘素的特殊性質(zhì)，許多科研工作者早在20世紀(jì)60年代就開始神秘素活性成分的提取和分離純化的工作。目前常用的提取分離純化的方法有透析法、離心分離法、溶劑沉淀法和色譜法等。如Kurihara等人在1968年采用pH 10.5的碳酸鹽緩沖液從冷凍干燥的神秘果肉中提取出活性成分；經(jīng)過多年的研究后，在1982年又提出采用不同飽和度的硫酸銨分級沉淀，透析脫鹽后再采用柱分離，獲取較純神秘素的方法，但該操作工藝復(fù)雜，活性成分回收率低。Inglett依次采用乙醚、氯仿、乙酸乙酯、無水乙醇和水對凍干果肉進行提取，然后離心分離得到較高活性的淡黃色粉末；該學(xué)者又將凍干果肉用水?dāng)嚢韬箅x心分離，然后依次用含水乙醇、無水乙醇、丙酮、氯仿、η-己烷對沉淀物進行提取，得到較多的活性物質(zhì)，該方法實驗條件要求低，但過程繁瑣，且有試劑殘留，易引入食品安全問題。Kurihara和Beidler首次利用離子交換色譜分離得到神秘素，并表明它是一種堿性糖蛋白。Narendra根據(jù)神秘素中含有多聚組氨酸殘基(易與鎳發(fā)生強結(jié)合)的結(jié)構(gòu)特性，建立了用Immobilized Metal-Affinity Chromatography鎳柱一步提取的方法,該色譜分離方法獲得的神秘素純度大于95%，但該法得率較低，僅限于實驗分析分離純化。高壓脈沖電場(highintensity pulsed electric fields,HIPEF)是近年來興起的非熱處理技術(shù)，在處理熱敏性物質(zhì)方面具有巨大的優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于商業(yè)殺菌。同時，高壓脈沖電場可在瞬間使被處理物種的成分電位混亂，改變其通透性，促進成分間的分離，使其在熱敏天然物提取中具有不可言喻的后發(fā)優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從神秘果中提取神秘素的方法。本發(fā)明所述的一種從神秘果中提取神秘素的方法，包括如下步驟:
(O原料預(yù)處理:將采摘的新鮮神秘果除去葉梗，用無菌水清洗干凈浙干水分，放入冰箱-18 -36 °C凍藏； (2)神秘果果肉及果汁的制備:將凍藏的神秘果果實放入攪拌機內(nèi)，然后加入果實質(zhì)量3 6倍的I 4で無菌水，攪拌至果肉與核脫離。離心分離，上清液為果汁清液，用5 10倍I 4で無菌水沖洗沉淀物，抽濾得到濾渣為果肉漿；
(3)神秘果果汁飲料制備:將蔗糖、葡萄糖和維生素溶于果汁清液中，采用10%檸檬酸溶液將果汁清夜PH值調(diào)至3.3 3.4，攪拌均勻，罐裝，滅菌，得到神秘果果汁飲料；所述神秘果果汁飲料的總維生素含量為25 50 mg/100ml，所述蔗糖的用量為神秘果果汁飲料質(zhì)量的百分比為4.0 7.0%，所述葡萄糖的用量為神秘果果汁飲料質(zhì)量的百分比為1.0 3.0%，所述維生素的用量為秘果果汁飲料質(zhì)量的百分比為0.015 0.04% ；
(4)神秘素的提取:取10 15倍含鹽的酸性緩沖液加入果肉漿中，然后經(jīng)均漿機均質(zhì)，再經(jīng)高壓脈沖電場處理器輔助提取神秘素。(5)超濾分離:將高壓脈沖電場處理后的漿液抽濾，濾液通過10000 Da的超濾膜，取截留液，冷凍干燥，得到神秘素。進ー步地,所述步驟(I)中選用神秘果采摘至預(yù)處理之間的時間不超4小時。進ー步地，所述步驟(2)中從-18 -36で凍藏中拿出的神秘果果實需在取出后10分鐘內(nèi)加入攪拌機內(nèi)攪拌；攪拌后的混合物在溫度為4 V，離心カ為8000Xg 12000 Xg的條件下，離心分離20 30 min。進ー步地，所述步驟(3)中滅菌的溫度為90 100で，滅菌時間為15 30 min ； 所述的維生素為維生素C、維生素B6和B12混合物,其質(zhì)量比例為2 5:1 2:0.5
1.5。進ー步地，所述步驟(4)中所述含鹽的酸性緩沖液為氯化鈉濃度為0.2 0.5 M、pH值為3.1 5.5的酸性緩沖液；所述高壓脈沖電場處理器的脈沖極性為雙極或單極脈沖，矩形或鋸齒或指數(shù)衰減脈沖，電場強度為5 30 kV/cm,處理時間為10 40此。進ー步地,所述步驟(5)中，超濾流量不超過50 mL/min,進ロ壓力不超過12 psi,出口壓カ不超過7 psi，收集分子量大于10000 Da的截留液進行冷凍干燥。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點:
1、本發(fā)明采用無菌水對神秘果果肉進行水提，得到鮮紅色的果汁，經(jīng)過加入蔗糖、葡萄糖和維生素，可得到ロ感清甜，營養(yǎng)豐富，顏色誘人的神秘果果汁飲料；
2、本發(fā)明用含鹽的酸性緩沖液作為水不溶性神秘果果漿的提取液，然后采用高壓脈沖電場進行輔助提取，可極大提高神秘素的提取效率，且抑制提取物顏色的加深；
3、本發(fā)明公開的高效提取神秘素方法，エ藝簡單，產(chǎn)品安全，可規(guī)?；a(chǎn)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進ー步的說明。實施例1
將采摘的新鮮神秘果除去葉梗，在4小時內(nèi)用無菌水清洗干凈浙干水分，放入冰箱-18で凍藏；將從冰箱拿出神秘果果實放入攪拌機內(nèi)，然后加入果實質(zhì)量3倍的I 4で無菌水，攪拌至果肉與核脫離，整個過程在10分鐘內(nèi)完成。攪拌后的混合物在溫度為在4で下，離心カ為8000Xg的條件下離心20 min。上清液為果汁清液。用5倍I 4で無菌水沖洗沉淀物，抽濾得到濾渣為果肉漿。
將蔗糖、葡萄糖和維生素溶于果汁清液中，采用10%檸檬酸溶液將果汁清夜pH值調(diào)至3.3，混合攪拌均勻，得到神秘果果汁飲料；其中總維生素在神秘果果汁飲料中的含量為25 mg/100ml，蔗糖的用量為神秘果果汁飲料的質(zhì)量百分比4.0%，葡萄糖的用量為神秘果果汁飲料的質(zhì)量百分比1% ;所述維生素的用量為秘果果汁飲料質(zhì)量的百分比為0.015%，其中，所述的維生素為維生素C、維生素B6和B12混合物，其質(zhì)量比例為2:1:0.5。然后進行罐裝，90°C下加熱15 min進行滅菌，常溫保存。取10倍含鹽的酸性緩沖液(pH 3.1)加入果肉漿中，然后10000 r/min經(jīng)均漿機均質(zhì)2 min。然后在電場強度5k V/cm條件下處理10 Ps。將高壓脈沖電場處理后的衆(zhòng)液抽濾，濾液通過10000 Da的超濾膜，膜流量為40 mL/min，進/出口壓力分別為10 psi/5psi,取截留液，冷凍干燥，得到神秘素產(chǎn)品。神秘素產(chǎn)品的神秘素純度為89%,引起甜味的閾值為100 ppm ο含鹽的酸性緩沖液(pH 3.1)配制:配制0.1 M鄰苯二鉀酸鈉溶液，采用I N鹽酸溶液將體系PH調(diào)節(jié)至3.1，然后加入氯化鈉使得最終氯化鈉濃度為0.2M。實施例2
將采摘的新鮮神秘果除去葉梗，在4小時內(nèi)用無菌水清洗干凈浙干水分，放入冰箱-25°C凍藏；將從冰箱拿出神秘果果實放入攪拌機內(nèi)，然后加入果實質(zhì)量5倍的I 4 °C無菌水，攪拌至果肉與核脫10000離，整個過程在10分鐘內(nèi)完成。攪拌后的混合物在溫度為在
4°〇下，離心力為IOOOOXg的條件下離心26 min。上清液為果汁清液。用8倍I 4 V無菌水沖洗沉淀物，抽濾得到濾渣為果肉漿。將蔗糖、葡萄糖和維生素溶于果汁清液中，采用10%檸檬酸溶液將果汁清夜pH值調(diào)至3.3，混合攪拌均勻，得到神秘果果汁飲料；其中總維生素在神秘果果汁飲料中的含量為40 mg/100ml，蔗糖的用量為神秘果果汁飲料的質(zhì)量百分比6.0%，葡萄糖的用量為神秘果果汁飲料的質(zhì)量百分比2% ;所述維生素的用量為秘果果汁飲料質(zhì)量的百分比0.03%，所述的維生素為維生素C、維生素B6和B12混合物，其質(zhì)量比例為3:2:1。然后進行罐裝，95 °C下加熱20min進行滅菌，常溫保存。取12倍含鹽的酸性緩沖液(pH 4.5)加入果肉漿中，然后10000 r/min經(jīng)均漿機均質(zhì)2 min。然后在電場強度20 kV/cm條件下處理20 Ps。將高壓脈沖電場處理后的衆(zhòng)液抽濾，濾液通過10000 Da的超濾膜，膜流量為40 mL/min,進/出口壓力分別為10 psi/5psi,取截留液，冷凍干燥，得到神秘素產(chǎn)品。該神秘素產(chǎn)品的神秘素純度為86%,引起甜味活性為140 ppm。含鹽的酸性緩沖液(pH 4.5)配制:將0.1 M醋酸溶液和0.1 M檸檬酸鈉溶液混合，調(diào)節(jié)體系最終PH值至4.5，然后加入氯化鈉使得最終氯化鈉濃度為0.4M。實施例3
將采摘的新鮮神秘果除去葉梗，在4小時內(nèi)用無菌水清洗干凈浙干水分，放入冰箱-36°C凍藏；將從冰箱拿出神秘果果實放入攪拌機內(nèi)，然后加入果實質(zhì)量6倍的I 4 °C無菌水，攪拌至果肉與核脫離，整個過程在10分鐘內(nèi)完成。攪拌后的混合物在溫度為在4 °C下，離心力為12000Xg的條件下離心30 min。上清液為果汁清液。用10倍I 4 °C無菌水沖洗沉淀物，抽濾得到濾渣為果肉漿。將蔗糖、葡萄糖和維生素溶于果汁清液中，采用10%檸檬酸溶液將果汁清夜pH值調(diào)至3.4，混合攪拌均勻，得到神秘果果汁飲料；其中總維生素在神秘果果汁飲料中的含量為50 mg/100ml，蔗糖的用量為神秘果果汁飲料的質(zhì)量百分比7.0%，葡萄糖的用量為神秘果果汁飲料的質(zhì)量百分比3.0%，所述維生素的用量為秘果果汁飲料質(zhì)量的百分比0.04%，所述的維生素為維生素C、維生素B6和B12混合物,其質(zhì)量比例為5:2:1.5。然后進行罐裝，100で下加熱30min進行滅菌，常溫保存。取15倍含鹽的酸性緩沖液(pH 5.5)加入果肉漿中，然后10000 r/min經(jīng)均漿機均質(zhì)2 min。然后在電場強度30 kV/cm條件下處理40 l^s。將高壓脈沖電場處理后的衆(zhòng)液抽濾，濾液通過10000 Da的超濾膜，膜流量為50 mL/min,迸/出口壓カ分別為12 psi/7psi,取截留液，冷凍干燥，得到神秘素產(chǎn)品。該神秘素產(chǎn)品的神秘素純度為86%,引起甜味活性為140 ppmo含鹽的酸性緩沖液(pH5.5)配制:將0.1 M醋酸溶液和0.1 M檸檬酸鈉溶液混合，調(diào)節(jié)體系最終PH值至5.5，然后加入氯化鈉使得最終氯化鈉濃度為0.5M。神秘素含量的測定
在96孔板中每孔加入100 ML抗神秘果免疫球蛋白G，4で過夜，以使免疫球蛋白G(ant1-miraculin IgG)附著在孔內(nèi)壁上,然后用0.18% pH 7.5的磷酸鉀水溶液洗漆吸附的ant1-miraculin lgG。去除殘留在各孔的溶液后姆孔內(nèi)加入150 ML溶于pH 7.5的磷酸鉀緩沖液的1%牛血清白蛋白，室溫放置2 h。再去除1%的牛血清白蛋白溶液，依次加入分別稀釋10000倍100 ML已知濃度的神秘素溶液和采用該專利方法提取得到的神秘素，室溫靜置2 h。然后再用0.18% pH 7.5的磷酸鉀水溶液洗滌。去除殘留溶液，接著加入100 ML標(biāo)記的ant1-miraculin lgG，室溫靜置2 h。再用0.18% pH 7.5的磷酸鉀水溶液洗滌，去除殘留溶液后，在孔中加入過氧化物酶顯色劑，誘導(dǎo)發(fā)生顯色反應(yīng)，3 min后加入反應(yīng)抑制劑停止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定在405 nm下的吸光值。神秘素由依次為已知濃度的神秘素溶液(0.5，1.0,2.0,5.0，10，20，50，100，200，500 ng/ml)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出。

制備抗神秘果免疫球蛋白G (ant1-miraculin IgG)
250 99.9%純度的神秘素與等量的弗氏完全佐劑混合，乳化成油包水狀乳液，對2只兔子(體重3-3.5 kg)進行背部皮下多點注射免疫。在10天和20天后分別繼續(xù)注入250呢弗氏不完全佐劑與神秘素的混合物。最后一次免疫一周后，從耳靜脈取血，得到ant1-miraculin 皿清。利用GE公司HiTrap Protein A HP 5 mL的預(yù)裝柱進行親和層析純化。2.5 ml血清用10 mL PBS (20 mo I/L pH 7.0)稀釋，0.25 um膜過濾，以I mL/min的流速上樣。然后用10倍柱體積的緩沖液(20 mol/L PBS pH 7.0)洗去未結(jié)合的蛋白，再用6倍柱體積的
0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉(pH 3.5)緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白，結(jié)合蛋白以2 mL/管為單位分步收集到含500 ii L pH 9.0 Tris-Cl中和液的收集管中。收集液經(jīng)SDS-PAGE檢測后合并，經(jīng)PBS (20 mmol/L, pH 7.0)緩沖液透析后，用PEG 20000濃縮蛋白。標(biāo)記IgG的制備
稱取4 mg過氧化酶溶解于ImL蒸懼水中，加入0.2 mL新配的0.1 mol/L NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20 min ,將上述溶液裝入透析袋中,用I mmol/L (pH 4.4)的醋酸鈉緩沖液透析，4で過夜。加20 UL 0.2 mol/L (pH 9.5)碳酸鹽緩沖液，使以上過氧化酶的pH值升高到9.0，立即加入I mL含有8 mg IgG的0.01 M碳酸鈉緩沖液(pH 9.5)，室溫避光輕輕攪拌2 h，再加0.1 mL新配的4 mg/mL NaBH4溶液，混勻，在4°C下放置2 h。上凝膠色譜柱(Sephacryl s_2200柱)進行分離，洗脫液為10 mM的磷酸緩液(pH 6.8)，吸收波長分別為280 nm (蛋白吸收波長)，403 nm (POD)和405 nm (具有過氧化酶活性的吸收波長)。對以上三個波長的色譜峰分別收集，得到酶結(jié)合物，用牛血清蛋白將標(biāo)記抗體的濃度調(diào)整至Img/mL，保存。感官評價
采用滋味稀釋分析法對分離純化神秘素凍干樣的引起甜味閾值進行感官評價。將神秘素冷凍干燥物準(zhǔn)確溶于純凈水中，配成1%的濃度，然后進行1:1 (體積比)的逐步稀釋，樣品的逐步稀釋的溶液按照濃度增加的順序呈給經(jīng)過訓(xùn)練的評員，每個稀釋水平溶液采用3點測定進行評定。當(dāng)某個稀釋水平的溶液與2個空白(純凈水)之間的滋味差異剛好能被識別出來，那么稱這時的樣品濃度為可識別的閾值。每個評定組的閾值采用各個評員評定結(jié)果的平均值。神秘素引起甜味感覺的感官評價步驟如下:
(1)2 3ml 0.1 M檸檬酸含在口腔內(nèi)，確定其酸味；
(2)吐掉檸檬酸，純水漱口；
(3)將2.5 ml神秘素提取物含于口中I分鐘；
(4)吐掉神秘素提取物，純水漱口；
(5)2 3ml 0.1 M檸檬酸含在口腔內(nèi)，確認(rèn)產(chǎn)生的甜味。上述實施例僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明內(nèi)容所作的均等變化與修飾，都為本發(fā)明權(quán)利要求所要求保護的范圍。
權(quán)利要求
1.一種從神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)原料預(yù)處理:將采摘的新鮮神秘果除去葉梗，用無菌水清洗干凈浙干水分，放入冰箱-18 -36で凍藏； (2)神秘果果肉及果汁的制備:將凍藏的神秘果果實放入攪拌機內(nèi)，然后加入果實質(zhì)量3 6倍的I 4で無菌水，攪拌至果肉與核脫離；離心分離，上清液為果汁清液，用5 10倍I 4で無菌水沖洗沉淀物，抽濾得到濾渣為果肉漿； (3)神秘果果汁飲料制備:將蔗糖、葡萄糖和維生素溶于果汁清液中，采用10%檸檬酸溶液將果汁清夜PH值調(diào)至3.3 3.4，攪拌均勻，罐裝，滅菌，得到神秘果果汁飲料；所述神秘果果汁飲料的總維生素含量為25 50 mg/100ml，所述蔗糖的用量為神秘果果汁飲料質(zhì)量的百分比為4.0 7.0%，所述葡萄糖的用量為神秘果果汁飲料質(zhì)量的百分比為1.0 3.0%，所述維生素的用量為秘果果汁飲料質(zhì)量的百分比為0.015 0.04% ； (4)神秘素的提取:取10 15倍含鹽的酸性緩沖液加入果肉漿中，然后經(jīng)均漿機均質(zhì)，再經(jīng)高壓脈沖電場處理器輔助提取神秘素； (5)超濾分離:將高壓脈沖電場處理后的漿液抽濾，濾液通過10000Da的超濾膜，取截留液，冷凍干燥，得到神秘素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步驟(I)中神秘果采摘至預(yù)處理之間的時間間隔不超4小吋。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步驟(2)中從-18 -36で凍藏中拿出的神秘果果實取出后在10分鐘內(nèi)加入攪拌機內(nèi)攪拌；攪拌后的混合物在溫度為4で，離心カ為8000Xg 12000Xg的條件下，離心分離20 30 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步驟(3)中滅菌的溫度為90 100で，滅菌時間為15 30 min ； 所述的維生素為維生素C、維生素B6和B12混合物,其質(zhì)量比例為2 5:1 2:0.5 1.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步驟(4)中含鹽的酸性緩沖液為氯化鈉濃度為0.2 0.5 M、pH值為3.1 5.5的酸性緩沖液；所述高壓脈沖電場處理器的脈沖極性為雙極或單極脈沖，矩形或鋸齒或指數(shù)衰減脈沖，電場強度為5 30 kV/cm,處通時間為10 40 M<s。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從神秘果中提取神秘素的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，超濾流量不超過50 mL/min,進ロ壓力不超過12 psi,出口壓カ不超過7 psi,收集分子量大于10000 Da的截留液進行冷凍干燥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從神秘果中提取神秘素的方法，該方法包括以下步驟(1)神秘果的預(yù)處理；(2)神秘果果肉及果汁的制備；(3)通過添加甜味劑及維生素制備神秘果果汁飲料；(4)選用含鹽的酸性緩沖液作為提取液，均質(zhì)混勻，高壓脈沖電場輔助高效提取神秘素；(5)采用膜通量為10000Da的超濾膜對神秘素粗提液進行脫鹽、濃縮，冷凍干燥處理，得到神秘素產(chǎn)品。本發(fā)明生產(chǎn)設(shè)備要求簡單，安全性高，制得的神秘素純度高，活性強，適宜大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)；且制備過程中產(chǎn)生的神秘果果汁可制成營養(yǎng)可口的果汁飲料，拓展了神秘果的應(yīng)用范圍。
文檔編號A23L2/52GK103082260SQ20131005548
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月21日
發(fā)明者趙謀明, 萬福群 申請人:萬福群