專利名稱：快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)育種領(lǐng)域，特別涉及利用分子標記聚合多個番茄黃化曲葉病毒病抗性基因，選育抗病自交系的番爺育種方法。
背景技術(shù)：
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番茄是茄科(Solanceae)番茄屬(Solanum)的一年生或多年生植物，原產(chǎn)于南美洲的秘魯、厄瓜多爾等地。番茄是世界上重要且具有高經(jīng)濟價值的農(nóng)作物之一，也是中國栽培最廣、產(chǎn)量最高的蔬菜作物之一。但栽培番茄中記載的病害有將近200種，盡管生產(chǎn)者可以使用包括栽培技術(shù)和殺蟲劑等綜合策略，但是利用傳統(tǒng)的育種方法將抗病基因?qū)氲浆F(xiàn)代品種中依然是番茄抵抗疾病的重要方法。在上百種番茄病原體中，由番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)引起的疾病一直是生產(chǎn)者重中之重的難題。近10年來，煙粉虱傳播的雙生病毒已經(jīng)發(fā)展成為中國乃至世界番茄生產(chǎn)的限制因子。通過煙粉虱，TYLCV可以迅速進入番茄中，一旦進入植物體內(nèi)就會大量復(fù)制并傳遍整個植物體。該病具有爆發(fā)突然、擴展迅速、危害性強、無法治療的特點，是一種毀滅性的番茄病害，植株一旦發(fā)病，尤其是在開花前發(fā)病，果實產(chǎn)量及商品價值均大幅度下降，嚴重時造成的損失可達100%。TYLCV屬于雙生病毒屬，其分布范圍受媒介昆蟲——煙粉虱的限制?；瘜W(xué)方法控制煙粉虱是一種有效地方法，但是商業(yè)上殺蟲劑的濫用使得煙粉虱產(chǎn)生抗性，并且誘變出20種不同的番茄侵染性病毒。就像化學(xué)殺線蟲一樣，由于TYLCV對殺蟲劑產(chǎn)生抗性以及對過量使用殺蟲劑對公眾健康的考慮，化學(xué)方法控制TYLCV也逐漸減少。利用遺傳工程創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因抗性植株同樣的成為一種有效地措施。這種技術(shù)解決了化學(xué)方法的弊端，并且也使番茄對線蟲、TYLCV及其他病原菌產(chǎn)生了抗性。直到今天，抗性基因的自然滲入依然是控制番茄病原體的重要方法。關(guān)于抗番茄黃化曲葉病(TYLCV)的報道已有近40年，Cohen于1964年首次報導(dǎo)了一些抗性基因型，隨后在野生材料智利番爺(51多毛番爺(51 habrochaites)>秘魯番爺(51.醋栗番爺(5: pimpinellifoliuni)都分離出了抗性基因，但這些基因?qū)Ψ腰S化曲葉病毒病并不是完全免疫的。在1990’s，Pilowsky和Cohen (2000)報導(dǎo)了 5: 的抗性，其具有5個相關(guān)的隱性基因。以色列農(nóng)業(yè)研究中心利用5:peruvianum (PI 126926, PI 126930, PI 390681 和 LA441)培育了一系列高抗 TYLCV 的育種系。Michelson發(fā)現(xiàn)了 5: 對TYLCV的抗性。抗性受控于I個主效基因(命名為Ty-1，為部分顯性遺傳)和至少2個以上的修飾基因。這個抗性位點指Ty位點,5: chiIense中的抗性位點命名為Ty-1。Zamir將該Ty位點定位在第6號染色體的著絲粒部位。Ty-1等位基因為顯性基因，因此，Ty-1/ Ty-1和Ty-1/+都具有TYLCV抗性。由于整合單個顯性基因相對容易，因此該主效抗性 基因Ty-1得以廣泛應(yīng)用，帶有該抗性基因的雜交種也在市場上大面積推廣種植。野生番茄5: habrochai tes中LA386、LA1777等對TYLCV也表現(xiàn)較高水平的抗性，研究發(fā)現(xiàn)該抗性是由I個主效基因和幾個修飾基因所控制。另外該野生種5: habrochai tes ‘B6013’中，有2個上位基因控制其對TYLCV的抗性，育種家由此育成了H24，之后相關(guān)研究證明H24攜帶Ty-2基因。Hanson等(2000)將其定位在11號染色體長臂上；Garcia等(2007)進一步將其定位在長臂終端，與SCAR (Sequence characterizedamplified region)標記T0302緊密連鎖，遺傳距離在5.0 cM以內(nèi)。引物T0302F/T0302R和T0302F/TY2R1能夠有效地檢測基因型ty2/ty2和TY2/TY2。亞疏中心(AVRDC)在番茄育種進程中將Ty-2基因作為基本抗源，利用H24培育了一系列抗病自交系。Ty-3是最新報導(dǎo)的TYLCV抗性基因。Ji等(2007)利用感病材料5: Iycopersicum (7781)和抗TYCV的高代自交系(021108)，5: Chilense中LA2779的漸滲系雜交得到的F2群體，將Ty-3基因定位于第6染色體長臂上cLEG-31-P 16 (20 cM)和C2_At5g41480 (27 cM)之間。其為一個主效位點，可以解釋60%的植株TYLCV抗性強度。LA4440是S.Chilense中LA2779的漸滲系，令人感興趣的是，該品系兼抗TYLCV和ToMoV，抗性區(qū)域不僅包括Ty-3還包含Ty-1(Agrama and Scott, 2006),兩者間的遺傳距離僅15 cM。在一個基因型中同時存在Ty-1和Ty-3基因可能提供更高的抗性。Ty-4也來自于來源于野生智利番茄，位于3號染色體，為輔助增效基因，可以解釋16%抗性程度變化。Ty-4單獨存在時，抗性水平表現(xiàn)一般，與其他抗性標記同時存在時，能顯著提高品系的抗性水平(Ji et al.2009)。Ty_5來自于4個秘魯番爺，位于4號染色體,為專性抗病基因(Anbinder et al., 2009)。目前市場上推廣應(yīng)用的品種只是具有上述一個抗性基因，耐病品種只有Ty-1抗性基因，普遍抗性弱，僅有一定的耐病性。而具有Ty-2的抗性品種只有專性抗性，具有地區(qū)選擇性。Ty-3抗性基因也是屬于不完全顯性抗性，在純合的Ty-3基因型抗性強。目前尚沒有一個抗性基因?qū)YLCV所有生理小種均有抗性。所以市場上推廣的品種，普遍存在抗性效應(yīng)差，抗性有選擇性，抗 性退化等問題，如果能將上述2個或2個以上的抗性基因聚合到同一個品系中，就會產(chǎn)生更加穩(wěn)定持久的抗性。但是由于番茄黃化曲葉病毒病的抗性遺傳比較復(fù)雜，抗源材料不同，其抗性遺傳規(guī)律也不同，有的抗源材料的抗性是屬于不完全顯性的單基因控制，有的是數(shù)量性狀，還有的是顯性單基因。所以通過雜交進行不同效應(yīng)基因的聚合育種，并進行抗性評價，才能培育抗性更穩(wěn)定的育種品系。綜上所述，鑒于黃化曲葉病毒病發(fā)生的普遍性以及危害的嚴重性，必須兼具多個TYLCV抗性基因綜合抗性，才有較高的并且穩(wěn)定持久的抗病性，市場推廣應(yīng)用才有可能。但是采用常規(guī)技術(shù)很難把它們聚合在同一個基因型中。

發(fā)明內(nèi)容
針對市場上缺乏具有TYLCV持久穩(wěn)定抗性的優(yōu)質(zhì)番爺品種,而利用傳 統(tǒng)技術(shù)難以對抗病基因Ty-2，Ty-3和Ty_4進行聚合，同時去除不利農(nóng)藝 性狀的連鎖累贅的問題。本發(fā)明旨在提供一種快速聚合番茄黃化曲葉病毒 病多個抗性基因的引物及方法。快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的引物，包括三對引物，S卩引物對Ty2-caps, Ty3- caps 和 Ty4_scar,其中:
Ty2_caps 正向引物 Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5’- AGC TGA TGA aca cct cgt gacatC -3，;
Ty2_caps反向引物Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5’ CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG-
3，；Ty3-caps正向引物Seq ID N0.3 Ty3-caps_F: 5，- AGT CTG GTG GTG MT AGG CAT CA
_3，；
Ty3_caps 反向引物Seq ID N0.4 Ty3_caps-R: 5’ TTA GTA CCC CAA GGG MC MG AGT-
3，；
Ty4-scar 正向引物 Seq ID N0.5 Ty4-scar_F:5，- GCG GAC TTG GAT GAT GAC ACG GCCTG -3，;
Ty4-scar 反向引物Seq ID N0.6 Ty4-scar-R: 5，GCT CAC TTT GCA MT CAC ATC CCCATC - 3，。一種利用所述的引物快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的方法，其步驟包括:
(1)將分別攜有黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3或Ty_4抗性基因的番茄植株進行雜交，獲得Fl代雜交種，并進行多代自交，獲得不同世代的自交系；
(2)利用所述的三對 引物對各自雜交系進行篩選，獲得純合Ty2/Ty2、Ty-3/Ty_3與Ty-4/ Ty-4基因，并具有穩(wěn)定抗黃化曲葉病毒病的番茄自交系。所獲得的番茄自交系至少包括Ty-2、Ty-3與Ty_4黃化曲葉病抗性等位基因。利用引物對 Seq ID N0.1 Ty2-caps_F 與 Seq ID N0.2 Ty2_caps-R 對自交系是否含有純合Ty2/Ty2基因進行鑒定，鑒定方法為:
(1)提取各單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.1 Ty2-caps_F與Seq ID N0.2Ty2-capS-R 進行 PCR 擴增；
(2)對PCR產(chǎn)物進行TfeaI限制性內(nèi)切酶進行酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳，若只有一條425 bp DNA片段，則該單株幼苗中含有純合Ty2/Ty2基因。利用引物對 Seq ID N0.3 Ty3-caps_F 與 Seq ID N0.4 Ty3_caps-R 對自交系是否含有純合Ty3/Ty3基因進行鑒定，鑒定方法為:
(1)提取番茄單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.3 Ty3-caps_F與Seq ID N0.4Ty3-capS-R 進行 PCR 擴增；
(2)對PCR產(chǎn)物進行Taql酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳，若有兩條條帶，則該單株中含有純合的黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3/Ty_3。利用引物對 Seq ID N0.5 Ty4-scar-F 與 Seq ID N0.6 Ty4_scar-R 對自交系是否含有純合Ty4/Ty4基因進行鑒定，鑒定方法為:
(1)提取番茄單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.5 Ty4-scar_F與Seq ID N0.6Ty4-scar-R 進行 PCR 擴增；
(2)利用瓊脂糖凝膠電泳，若有一條600bp的條帶，則該單株中含有純合的黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-4/Ty_4。本發(fā)明所涉及的可供商業(yè)化品種滿足市場多方面的需求，包括較好的農(nóng)藝性狀，較高的作物產(chǎn)量，較強的TYLCV抗性以及良好的商品性等更多。特別是，本發(fā)明涉及產(chǎn)生高抗TYLCV的番茄品種。商業(yè)雜種的選育需要首先形成純合的穩(wěn)定親本。在育種項目中，從2個或更多個種質(zhì)或基因池中存在的多個目標性狀聚合到優(yōu)勢育種品種中。需要的自交系或親本系通過連續(xù)的自交與選擇最好的育種系，并利用分子標記加快選育過程。根據(jù)目前發(fā)明所指，一個是穩(wěn)定的親本材料，另一個包括配制的Fl代雜交種。穩(wěn)定親本材料是指能夠開放授粉的自交系，目標性狀通過多輪自交與種植以后還是穩(wěn)定的。本發(fā)明的有益效果:
1.等位基因特異性PCR技術(shù)具有特異性高、重復(fù)性好以及費用低廉等優(yōu)點。將其應(yīng)用到植物的分子育種中可以加速育種世代，節(jié)約時間和人力。由于這樣的分子標記實際上就是功能基因本身局部片斷的擴增結(jié)果，所以能非?？煽康刂苯予b別該功能基因，具有極好的實際應(yīng)用效果。2.以分子標記為依據(jù)，可以準確地確定雜交后代單株中是否含有Ty-2，Ty-3和Ty-4基因的結(jié)合狀態(tài)，從而篩選出同時含有Ty-2，Ty-3和Ty-4的單株，在短時間內(nèi)實現(xiàn)這3個基因的聚合和純化，進而選育出具有穩(wěn)定抗性的番茄新品種。


圖1 番茄單株利用 Seq ID N0.1 Ty2-caps_F /Seq ID N0.2 Ty2_caps-R 引物PCR擴增產(chǎn)物T&al酶切后電泳結(jié)果。M，100 bp DNA ladder; I為感病單株，有一條540 bp條帶；2為抗病單株，有一條425 bp的條帶。3為ddH20對照。圖2 番茄單株利用 Seq ID N0.3 Ty3-caps_F/Seq ID N0.4 Ty3_caps-R 引物 PCR擴增產(chǎn)物T1ai7I酶切后電泳結(jié)果。M，100 bp DNA ladder; 1，2為感病單株，只有一條1235bp的條帶；3，4為抗病單株，有2條分別為860 bp與375bp的條帶；3為ddH20對照。圖3番茄單株利用Seq ID N0.5 Ty4-scar_F/ Ty3_scar-R引物PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果。M, 100 bp DNA ladder; I為ddH20對照,2, 3為抗病單株,有一條600 bp的條帶；4，5為抗病單株，無條帶。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明做進一步的說明。利用分子標記技術(shù)可以有效地鑒別目標基因，實現(xiàn)目標基因的累加和聚合。為此我們快速聚合多個TYLCV不同效應(yīng)的抗性基因，培育具有多個抗性位點的番茄新種質(zhì)提供了可能性。本發(fā)明是以篩選TYLCV抗性基因特異性分子標記為核心，以分子標記輔助選擇為基礎(chǔ)，把Ty-2，Ty-3以及Ty_4多個抗性基因聚合到番茄同一自交系中，培育出對黃化曲葉病毒病具有穩(wěn)定持久抗性的番茄新品種，具有非常廣闊的市場前景和推廣應(yīng)用價值。本發(fā)明包括以下步驟:
(I)利用TYLCV抗性試驗篩選抗病資源。TYLCV抗性試驗篩選指的是:在自然狀態(tài)下種植番茄植株，在這種環(huán)境下黃化曲葉病毒自然進行侵染，使用0-4的侵染指數(shù)來對植株的感病情況進行一次或多次評定。O級:無癥狀；1級:葉片輕微發(fā)黃；2級:葉片明顯發(fā)黃，并且出現(xiàn)卷葉，植株部分組織有癥狀；3級:植株發(fā)育遲緩，葉片嚴重發(fā)黃且卷曲，整個植株出現(xiàn)嚴重癥狀；4級:植株發(fā)育嚴重遲緩，具有發(fā)黃的、卷縮的小葉。當(dāng)一個番茄品種或株系平均病情指數(shù)在0-1級的，即可鑒定為其對TYLCV具有抗性；中度抗性平均發(fā)病指數(shù)大約為2 ; 而敏感型的病情指數(shù)均在3以上。(2)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-2連鎖分子標記的篩選
本發(fā)明利用分子標記分析方法篩選了一個同Ty-2緊密連鎖的Caps分子標記，可用于早期鑒定具有Ty-2抗性的番茄種質(zhì)以及分離單株。這對Ty2caps擴增引物包括正向引物:Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5，- AGC TGA TGA aca cct cgt gac atC _3，;與反向引物Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5’ CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG- 3’。PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物直接利用fcal限制性內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)，再根據(jù)電泳條帶大小就可以區(qū)分抗病類型與感病類型，并從中鑒定出Ty-2/Ty-2類型的番茄單株。(3)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-3連鎖分子標記的篩選
本發(fā)明利用序列分析方法篩選了一個同Ty-3緊密連鎖的Ty3-caps分子標記，可用于早期鑒定具有Ty3抗性的番茄種質(zhì)以及單株。用于篩選的CAPs引物對為:正向引物Seq IDN0.3 Ty3-caps-F: 5’- AGT CTG GTG GTG AAT AGG CAT CA -3’ 與反向引物 Seq ID N0.4Ty3-caps-R: 5’ TTA GTA CCC CAA GGG AAC AAG AGT- 3’。PCR 反應(yīng)體系總體積 25 μ I,包括 2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 5 μ I 5X buffer, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.1 μ I (0.5units) Taq DNA polymerase, 2.5 μ I 10 μ M 正向引物，2.5 μ I 10 μ M 反向引物，5μ I ddH20以及5 μ I DNA抽提物。PCR反應(yīng)程序:94 °C變性3 min, 33次循環(huán)包括94° C變性30 S，55 °C退火I min, 72 °C延伸I min.最后72 °C保持7 min。PCR擴增產(chǎn)物通過Taql酶切后能較好地區(qū)分感病類型(ty-3)與抗病類型(Ty_3)，并從中篩選出純合的Ty3/Ty3抗病植株類型。(4)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-4連鎖分子標記的篩選
本發(fā)明設(shè)計并驗證了一對SCAR擴增引物，其中正向引物:Seq ID N0.5 Ty4-scar_F:5，- GCG GAC TTG GAT GAT GAC ACG GCC TG -3，;與反向引物 Seq ID N0.6 Ty4-scar-R:5’ GCT CAC TTT GCA AAT CAC ATC CCC ATC - 3’ 。PCR反應(yīng)體系為:2.5μ1 2.5 mM dNTPs, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.2 μ I (1.0units) Taq polymerase, 2.5 μ I 10 μ M正向引物，2.5 μ I 10 μ M反向引物以及5 μ IDNA抽提物，5 μ I 5Χ buffer,加入約5 μ I dd H2O,使總反應(yīng)體積為25 μ I。PCR反應(yīng)程序:94 °C變性3 min,然后94 ° C變性30 s, 53 °C退火I min, 72 °C延伸I min,共循環(huán)35次。在72 0C溫浴10 min后，在4 °C保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增片段，根據(jù)PCR條帶可以成功地區(qū)分番茄植株是否攜帶有Ty-4基因。(6)穩(wěn)定抗病自交系的培育
利用含有純合Ty-2基因的番茄自交系為母本，含有Ty-3以及Ty-4抗性基因的野生番茄自交系為父本雜交，獲得同時含有Ty-2，Ty-3與Ty_4等三個抗性基因雜合體F1代，通過上述雜交獲得的F1群體通過自交獲得不同的F2群體。收獲的F2代種子播于田間，利用實驗室接種鑒定結(jié)合田間接種鑒定技術(shù)，對分離群體的每個單株進行抗黃化曲葉病毒病評價。同時取F2代單株苗期嫩葉，提取基因組DNA后利用上述篩選的3對分子標記引物組合進行檢測，分析其抗病基因類型，選擇同時出現(xiàn)這三個基因分子標記的個體，即含有純合抗TYLCV病毒基因Ty2Ty2/Ty3Ty3/Ty4Ty4。上述含有Ty2\T y3\Ty4純合基因型的番茄單株種植在溫室，進一步在田間觀察其抗病性。選擇抗病性強的單株進行自交，并留下F3代種子。入選的F3株系在苗期利用室內(nèi)接種法評價各株系的病情指數(shù)，并利用上述3對PCR引物組合鑒定抗TYLCV基因類型，選擇包含有3個抗病基因的單株，種植于田間，待田間評價其抗病特性后，選擇抗性株系中的優(yōu)良單株自交留種，獲得F4代種子。
F4代種子播于人工氣候室內(nèi)，評價其抗病性，并利用上述3對PCR引物組合鑒定抗TYLCV基因類型，選擇包含有3個抗病基因的單株自交留種。F4代自交后篩選即可獲得的性狀穩(wěn)定的目標自交系。
實施例(I)黃化曲葉病毒病(TYLCV)抗性鑒定方法
在天然的高發(fā)地塊大田種植接種本地病毒鑒定植株抗性是一個優(yōu)先選擇的方法。番茄幼苗生長在田間通過接種人工飼養(yǎng)帶毒(TYLCV)煙粉風(fēng)(汝 isia tabaci )進行天然接種。在田間觀察接種后植株的發(fā)病癥狀，每個單株發(fā)病嚴重程度都需統(tǒng)計3次，第3次統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)才用于評價最準確的抗性水平，減少逃逸可能性。TYLCV病毒病的病癥通常分為0-4級。O級:無癥狀；1級:葉片輕微發(fā)黃；2級:葉片明顯發(fā)黃，并且出現(xiàn)卷葉，植株部分組織有癥狀；3級:植株發(fā)育遲緩，葉片嚴重發(fā)黃且卷曲，整個植株出現(xiàn)嚴重癥狀；4級:植株發(fā)育嚴重遲緩，具有發(fā)黃的、卷縮的小葉。當(dāng)一個番茄品種或株系平均病情指數(shù)在0-1級的，即可鑒定為其對TYLCV具有抗性；中度抗性植株平均發(fā)病指數(shù)大約為2 ;而敏感型植株的病情指數(shù)均在3以上。(3)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-2連鎖分子標記的篩選。Ty-2來源于多毛番爺(5:是目前番爺抗TYLCV品種選育中主要抗性來源。Hanson等(2000)將其定位在第11染色體長臂上RFLP分子標記TG36與TG393相距19 cM片段區(qū)間，而Ji等(2009)進一步將其定位在C2_Atlg07960 (82.5 cM)與C2_At4g32930 (88 cM)之間共5.5 cM的片段上，其中SGN上公布的BAC_119J05位于這一區(qū)間內(nèi)。根據(jù)業(yè)已公布的番爺全基因組序列(http://www.sgn.Cornell, edu),通過比較抗性品種與感病品種在這一端的DNA序列差異，利用Primerf.0設(shè)計了一對CAPs擴增引物，其中正向引物:Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5’- AGC TGA TGA aca cct cgt gac atC-3，;與反向引物 Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5’ CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG- 3’。反應(yīng)體系:2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 2.0 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.1 μ I (0.5 units) Taqpolymerase, 2.5 μ I 10 μΜ正向引物，2.5 μ I 10 μΜ反向引物以及5 μ I DNA抽提物20 ng DNA)，5 μ I 5X buffer,加入約 5 μ I dd H2O,至 25 μ I 反應(yīng)總體積。在PCR擴增儀上按以下反應(yīng)程序進行:先94 °C變性3 min,然后34次循環(huán)包括94 °(:變性30 S，56 °C退火45 S，72 °C延伸I min，最后在72 °C保持7min。PCR擴增產(chǎn)物利用
1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，EB染色后，在紫外燈下拍照。結(jié)果顯示利用該對引物在不同基因型中均可擴增540-bp左右的一條清晰條帶。將上述PCR產(chǎn)物直接進行酶切反應(yīng)。取上述10 μ I PCR混合產(chǎn)物，加入 0.25 μ I BSA, 0.5 μ I Rsal 限制性內(nèi)切酶(NEB Inc.)，2.5μ I IOXbuffer (NEB Inc.)，加上約 12 μ I ddH20,至 25 μ I 的反應(yīng)總體積。在 37 °C水浴鍋溫浴2 h.再利用1.8%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示酶切后感病植株有一條540 bp條帶，而Ty-2類型植株酶切后變小，只有425 bp,酶切片段約70 bp左右不能顯示(圖1)。這樣可以成功地區(qū)分番茄單株是否攜帶了 Ty-2基因。(4)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-3連鎖分子標記的篩選
Ty-3是最新報導(dǎo)的TYLCV 抗性基因。LA4440是L.Chilense中LA2779的漸滲系，該品系兼抗TYLCV和ToMoV，抗性區(qū)域不僅包括Ty-3還包含Ty-1，兩者間的遺傳距離小于15CM。在一個基因型中同時存在7>-7和基因可能提供更高的抗性。其中位于第六染色體上的Ty3區(qū)間可以解釋65%的TYLCV抗性變異。通過該25 cM區(qū)間序列分析可以發(fā)現(xiàn)，Ty3同抗雙生病毒的抗性株系連鎖，而ty-3同感病植株連鎖。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在Ty3與ty-3植株類型中在BAC clone AY678298從171300-173050的位置存在著多個SNP差異標記。野生型(ty-3)在該區(qū)域無/^<7 I酶切位點，而抗性突變體Ty3類型有I個TaqI酶切位點。根據(jù)以上序列特性，成功設(shè)計了一對Caps引物，可以清楚地擴增單一條帶，通過酶切后能較好地區(qū)分抗病與感病不同類型，篩選出純合的Ty3/Ty3植株類型。利用Primer3.0設(shè)計擴增引物Ty3_caps,其中正向引物:Seq ID N0.3Ty3-caps-F: 5’- AGT CTG GTG GTG AAT AGG CAT CA -3’；反向引物 Seq ID N0.4Ty3-caps-R: 5’- TTA GTA CCC CAA GGG AAC AAG AGT- 3’。PCR 反應(yīng)體系:總體積 25μ I,包括2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 5 μ I 5X buffer, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.1 μ I(0.5 units) Taq DNA polymerase, 2.5 μ I 10 μ M 正向引物，2.5 μ I 10 μ M 反向引物，5 μ I ddH20以及5 μ I DNA抽提物。PCR反應(yīng)程序:94 °C變性3 min, 33次循環(huán)包括 94 0C 變性 30 S，55 °C 退火 I min, 72 °C 延伸 1.5 min.最后 72 °C 保持 10 min。PCR擴增產(chǎn)物利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳顯示利用該對引物在不同基因型中均可擴增1235-bp左右的一條清晰條帶。酶切反應(yīng)體系:10 μ I PCR反應(yīng)混合物，0.25 μ I BSA, I μ I T^I限制性內(nèi)切酶，3 μ 10 X buffer,再加上11 μ I ddH20,至25 μ I的反應(yīng)總體積。在65 °C水浴鍋溫浴3 h.再利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示酶切后野生型植株還是僅有一條1235bp條帶，而Ty3植株類型有兩條條帶，分別為860 bp與375 bp (圖1)
(4)抗黃化曲葉病毒病基因Ty-4連鎖SCAR分子標記的篩選
Ty-4同Ty-3 —樣來源于智利番爺(5:其位于第3染色體的長臂端分子標
記 C2_Atlg02140 (71 cM)與 TG599 (85 cM)之間(Ji et al.2009)。根據(jù)其公布的序列結(jié)合測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在抗性品種基因組的DNA序列中存在少數(shù)Indel片段(Maxwell，2009)，根據(jù)這些片段設(shè)計引物，最終利用Primerf.0設(shè)計了并驗證了一對SCAR擴增引物(Ji etal.2009)，其中正向引物:Seq ID N0.5 Ty4-scar-F: 5’- P3-81-F:5’ -GCG GAC TTGGAT GAT GAC ACG GCC TG -3’ ;與反向引物 Seq ID N0.6 Ty4-scar-R: 5’ -GCT CAC TTTGCA AAT CAC ATC CCC ATC - 3’ 。PCR 反應(yīng)體系為:2.5 μ I 2.5 mM dNTPs, 2.5 μ I 2.5 mM MgCl2, 0.2 μ I (1.0units) Taq polymerase, 2.5 μ I 10 μ M 正向引物，2.5 μ I 10 μ M 反向引物以及 5μ I DNA 抽提物( 20 ng DNA), 5 μ I 5X buffer,加入約 5 μ I dd H2O,使總反應(yīng)體積為25 μ I。PCR反應(yīng)程序:94 °C變性3 min,然后94 °C變性30 s, 53 °C退火Imin, 72 °C延伸I min,共循環(huán)35次。在72 ° C溫浴10 min后，在4 °C保存。利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增片段，EB染色后，在紫外燈下拍照。結(jié)果顯示利用該對引物在抗性品種中可以擴增一條600-bp左右的一條清晰條帶，而對照與感病基因型中并沒有相應(yīng)條帶。由此可以成功地區(qū)分番茄植株是否攜帶有Ty-4基因。(5)聚合Ty-2，Ty_3和Ty_4基 因到同一個基因型中
利用含有純合Ty-2基因的栽培番茄自交系H24 (美國番茄種質(zhì)資源庫)為母本，以含有Ty-3以及Ty-4抗性基因的野生番茄5: Chilense LA2779/LA1932的漸滲系024525為父本雜交，獲得同時含有Ty-2，Ty-3與Ty_4等3個抗性基因雜合體F1代，通過上述雜交獲得的F1群體通過自交獲得不同的F2群體。收獲的F2代種子播于田間，利用實驗室接種鑒定結(jié)合田間接種鑒定技術(shù)，對分離群體的每個單株進行抗黃化曲葉病毒病評價，在不同生育期評價3次。同時取F2代單株苗期嫩葉，提取基因組DNA后利用上述篩選的3對分子標記引物組合進行檢測，分析其抗病基因類型。在匕分離群體中，會出現(xiàn)不同的基因型，其中有少量植株同時含有Ty-2，Ty-3與Ty-4純合基因型，從自交后代中剔除雜合基因型，選擇同時出現(xiàn)這3個基因分子標記的個體，即含有純合抗TYLCV病毒基因Ty2Ty2/Ty3Ty3/Ty4Ty4。(6)高抗黃化曲葉病毒病番茄優(yōu)良自交系的選擇
上述含有Ty2\Ty3\Ty4純合基因型的番茄單株種植在溫室，進一步在田間觀察其抗病性。選擇抗病性強的單株進行自交，并留下F3代種子。入選的F3按株系播種后，在苗期利用室內(nèi)接種法評價各株系的病情指數(shù)以及抗病植株所占比例。利用上述3對PCR弓丨物組合鑒定抗TYLCV基因類型，選擇包含有3個抗病基因的單株，種植于田間，待田間評價其抗病特性后，選擇抗性株系中的優(yōu)良單株自交留種，獲得F4代種子。F4代種子播于人工氣候室內(nèi)，在苗期利用室內(nèi)接種法評價各株系的病情指數(shù)以及抗病植株所占比例。利用上述3對PCR引物組合鑒定抗TYLCV基因類型，選擇包含有3個抗病基因的單株，種植于田間，待田間評價其抗病特性后，選擇抗性株系中的優(yōu)良單株自交留種。F4代自交后篩選即可獲 得的性狀穩(wěn)定的目標自交系。
權(quán)利要求
1.一種快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的引物，其特征在于，包括三對引物，即引物對 Ty2_caps, Ty3- caps 和 Ty4_scar,其中:Ty2_caps 正向引物 Seq ID N0.1 Ty2_caps_F: 5’- AGC TGA TGA aca cct cgt gacatC -3，;Ty2_caps反向引物Seq ID N0.2 Ty2_caps-R: 5’ CTC GCG CCA AGT CAA TTG CTT GG-3，；Ty3_caps 正向引物Seq ID N0.3 Ty3-caps_F: 5’- AGT CTG GTG GTG MT AGG CAT CA_3，；Ty3_caps 反向引物Seq ID N0.4 Seq ID N0.4 Ty3_caps-R: 5’ TTA GTA CCC CAA GGGAAC AAG AGT- 3，；Ty4-scar 正向引物Seq ID N0.5 Ty4-scar_F:5，- GCG GAC TTG GAT GAT GAC ACG GCCTG -3，;Ty4-scar 反向引物 Seq ID N0.6 Ty4-scar-R: 5’ GCT CAC TTT GCA AAT CAC ATC CCCATC - 3，。
2.一種利用如權(quán)利要求1所述的引物快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的方法，其特征在于，其步驟包括: (1)將分別攜有黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3或Ty_4抗性基因的番茄植株進行雜交，獲得Fl代雜交種，并進`行多代自交，獲得不同世代的自交系； (2)利用所述的三對引物對各自雜交系進行篩選，獲得純合Ty2/Ty2、Ty-3/Ty_3與Ty-4/ Ty-4基因，并具有穩(wěn)定抗黃化曲葉病毒病的番茄自交系。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所獲得的番茄自交系至少包括Ty-2、Ty-3與Ty-4黃化曲葉病抗性等位基因。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，利用引物對SeqID N0.1 Ty2-caps_F與SeqID N0.2 Ty2-caps-R對自交系是否含有純合基因進行鑒定，鑒定方法為: (1)提取各單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.1 Ty2-caps_F與Seq ID N0.2Ty2-capS-R 進行 PCR 擴增； (2)對PCR產(chǎn)物進行TfeaI限制性內(nèi)切酶進行酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳，若只有一條425 bp DNA片段，則該單株幼苗中含有純合Ty2/Ty2基因。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，利用引物對SeqID N0.3 Ty3-caps_F與Seq ID N0.4 Ty3-caps-R對自交系是否含有純合Ty3/Ty3基因進行鑒定，鑒定方法為: (1)提取番茄單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.3 Ty3-caps_F與Seq ID N0.4Ty3-capS-R 進行 PCR 擴增； (2)對PCR產(chǎn)物進行Taql酶切，利用瓊脂糖凝膠電泳，若有兩條條帶，則該單株中含有純合的黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-3/Ty_3。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，利用引物對SeqID N0.5 Ty4-scar_F與Seq ID N0.6 Ty4-scar-R對自交系是否含有純合Ty4/Ty4基因進行鑒定，鑒定方法為: (1)提取番茄單株幼苗總DNA，利用引物對SeqID N0.5 Ty4-scar_F與Seq ID N0.6Ty4-scar-R 進行 PCR 擴增；(2)利用瓊脂糖凝膠電泳，若有一條600bp的條帶，則該單株中含有純合的黃化曲葉病毒病抗性基因Ty-4/Ty-4。`
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速聚合番茄黃化曲葉病毒病多個抗性基因的引物及方法。根據(jù)番茄基因組DNA序列特征篩選兩對分別與抗黃化病毒病Ty-2與Ty-3緊密連鎖的CAPs分子標記，篩選了一對與抗黃化曲葉病毒病基因Ty-4緊密連鎖的SCAR分子標記；將分別含有黃化病毒病抗性基因Ty-2，Ty-3，Ty-4的番茄親本雜交，并通過多代自交，利用篩選的分子標記為依據(jù)鑒定單株，獲得含有Ty-2，Ty-3與Ty-4純合基因，并具有穩(wěn)定黃化曲葉病毒病抗性的優(yōu)良自交系。本發(fā)明具有特異性高、重復(fù)性好以及費用低廉等優(yōu)點，可以加速育種世代，節(jié)約時間和人力。短時間內(nèi)實現(xiàn)這3個基因的聚合和純化，進而選育出具有穩(wěn)定抗性的番茄新品種。
文檔編號C12Q1/68GK103103185SQ20131003344
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者盧鋼, 鄭積榮, 陳景麗, 王潔, 朱翔飛, 陳麗妃 申請人:浙江大學(xué)