專利名稱：一種綿羊肺炎支原體的快速定性檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動(dòng)物傳染病診斷，具體涉及檢測綿羊肺炎支原體的PCR方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
綿羊肺炎支原體可引起綿羊及山羊發(fā)生非典型肺炎。臨床上以咳嗽、流鼻涕、漸進(jìn)性消瘦和增生性間質(zhì)性肺炎為主要特征([I] Besser T E, Cassirer E F，Potter K A, etal.Association of Mycoplasma ovipneumoniae infection with population-limitingrespiratory disease in free-ranging Rocky Mountain bighorn sheep ( OvisCanadensis canadensis).J Clin Microbiol，2008，4 6:423 430.[2] ParhamKj Churchward C P，McAuliffe L，et al.A high level of strain variation withinMycoplasma ovipneumoniae population of the UK has implications for diseasediagnosis and management.Vet Microbiol，2006，118:83 90.)。目前綿羊肺炎支原體在全球范圍內(nèi)分布，在我國流行十分廣泛，給養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失([3]Patel H，Mackintosh Dj Ayling RDj et al.A novel medium devoid of ruminantpeptone for high yield growth of Mycoplasma ovipneumoniae.Vet Microbiol,2008，127 (3 4):309 314.[4]王華，楊發(fā)龍，王永，湯承.四川省山羊支原體性肺炎流行病學(xué)調(diào)查，中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(1): 210-213.)。迄今為止，有關(guān)綿羊肺炎支原體的病原學(xué)診斷集中在病原的分離鑒定和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等方面。由于支原體生長的營養(yǎng)需求較高，且生長較為緩慢，給病原的分離鑒定帶來困難。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，PCR方法因其具有快速、特異、靈敏的優(yōu)勢，已成為檢測病原的常規(guī)技術(shù)手段，但長期以來由于綿羊肺炎支原體基因序列的缺乏，目前綿羊肺炎支原體的分子檢測方法只有 McAuliffe L 根據(jù) 16S rRNA 建立的 PCR 方法的報(bào)道([5] McAuliffe Lj HatchellFM，Ayling RDj et al.Detection of Mycoplasma ovipneumoni ae in Pasteurella-vaccinated sheep flocks with respiratory disease in England.Vet Recj2003，153(22):687 688.)，該方法具有較好的特異性，但在實(shí)際應(yīng)用于臨床樣本檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)靈敏性不高。另外，大量研究表明綿羊肺炎支原體在核酸水平和蛋白水平均存在高度的異質(zhì)性，并且其基因組中G+C含量低，因此給分子檢測靶點(diǎn)的選擇造成很大困難([6] 1nas G，Norman NGj Clarke JKj Marshall RB.A study of the heterogeneity of isolatesof Mycoplasma ovipneumoniae from sheep in New Zealand.Vet Microbiol.1991Nov;29(3-4):339-47; [7] Parham K，Churchward CPj McAuliffe Lj Nicholas RA，Ayling RD.A high level of strain variation within the Mycoplasma ovipneumoniaepopulation of the UK has implications for disease diagnosis and management.VetMicrobiol.2006 Nov 26;118(1-2):83-90.)。

熱休克蛋白70 (HSP70)是一個(gè)高度保守的蛋白質(zhì)，它存在于從細(xì)菌到人體的所有有機(jī)體中。本發(fā)明克隆測序了 15株綿羊肺炎支原體HSP70基因，并對其結(jié)構(gòu)和序列進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在I 300bp和1400 1818 (1815) bp這兩個(gè)區(qū)域內(nèi)，綿羊肺炎支原體HSP70與其他感染羊的支原體的種間差異較大，但種內(nèi)保守，GC含量較高，可作為候選的分子診斷靶點(diǎn)。本發(fā)明根據(jù)這兩個(gè)區(qū)域的序列，自行設(shè)計(jì)5對HSP70基因序列的種屬特異性引物進(jìn)行試驗(yàn)，最終篩選出一對特異性引物，應(yīng)用此引物進(jìn)行種屬特異性PCR反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析，建立綿羊肺炎支原體的簡便、快速、準(zhǔn)確的定性測定方法。

發(fā)明內(nèi)容
[要解決的技術(shù)問題]
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的以上不足，本發(fā)明的目的是提供一種綿羊肺炎支原體的快速定性檢測方法，使之能克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。[技術(shù)方案]
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種綿羊肺炎支原體的快速定性檢測方法。該方法的步驟如下:
A.模板DNA的制備
(1)取IOOg組織進(jìn)行勻衆(zhòng)，再把勻衆(zhòng)后的組織4000r/m離心5min,取上清，上清11000r/m離心30min，棄上清；若是細(xì)菌培養(yǎng)物，則取Iml細(xì)菌培養(yǎng)物于1.5ml離心管中，11000r/m離心30min,棄上清；
(2)取500μ STE懸浮沉淀，加入20μ 10% SDSUOPL 10mg/mL蛋白酶K，混勻后于56°C水浴消化1.5h ；
所述的STE提供一個(gè)緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。所述的SDS是十二燒基硫酸鈉,它能與蛋白質(zhì)結(jié)合,使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。所述的蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的降解。這種酶經(jīng)純化去除了 RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應(yīng)用很廣泛。(3)加入與在步驟(2)得到的溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇混合物，他們的體積比是 25:24:1,混勻，10000r/m 離心 5min ；
所述的異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。(4)離心后步驟(3)獲得的溶液分成上層水相、中間固相與下層有機(jī)相，吸取上層水相，加入與所述水相等體積的異戊醇-氯仿混合物，混勻后10000r/m離心3min，取上清液；
(5)往上述上清液中加入0.1倍體積的5mol/L NaCl和2倍體積的無水乙醇，混合均勻，10000r/m離心3min,得到DNA沉淀；
(6)所述沉淀用70%(體積比)乙醇水溶液洗滌，10000r/m離心lmin，棄乙醇，在室溫下自然干燥，得到模板DNA，然后加入30μ 滅菌去離子水溶解沉淀,于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> B.PCR擴(kuò)增
反應(yīng)體系 25μ : 10XPCR buffer 2.5PL，25mM Mg2+ 1.5μ , 2.5mM dNTPs 2μ ，10μΜ上下游引物各lKL，5υ/μ Taq酶0.125μ ，50ng/^L DNA模板2μ ，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25μ ;PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72°C終延伸lOmin，16°C結(jié)束反應(yīng)；
取5PL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析采用美國Bio-Red公司的凝膠成像系統(tǒng)。C.結(jié)果及判斷
檢測時(shí)以滅菌去離子水為模板，作為陰性對照；根據(jù)在135bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該樣本中含有綿羊肺炎支原體，相反地則不含有綿羊肺炎支原體。在本發(fā)明中，所述的上下游引物分別是:
上游引物 HSP70F 為 5’ -ACAACTCCTTCTGTTGTTGCCTT-3’
下游引物 HSP70R 為 5’ -AGCACGAACAGTTTTATCGCTAC-3’
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式，所述的檢測是在5V/cm的電壓下進(jìn)行電泳25-30min,然后用凝膠成像系統(tǒng)照相。[有益效果]
本發(fā)明的有益效果是:
可以在不進(jìn)行綿羊肺炎支原體純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，簡便、快速、準(zhǔn)確地定性檢測樣品中的綿羊肺炎支原體，整個(gè)過程對樣品中綿羊肺炎支原體的檢測程序簡單、特異性好、檢測效率高。本發(fā)明建立的方法比目前唯一報(bào)道的基于16S rRNA建立的檢測綿羊肺炎支原體的PCR方法靈敏度高10倍。


圖1.綿羊肺炎支原體的引物特異性驗(yàn)證
M: DNA Marker I ;泳道1:無模板對照；泳道2:綿羊肺炎支原體PCR擴(kuò)增片段；
圖2.特異性檢測
M: DNA Marker I ;泳道I為陽性對照，泳道2為無模板對照，泳道3 12依次為絲狀支原體絲狀亞種、絲狀支原體山羊亞種、牛支原體、無乳支原體、精氨酸支原體、溶血性曼氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、巴氏桿菌及沙門氏菌。圖3.綿羊肺炎支原體臨床分離株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物
M: DNA Marker I ;泳道I 20為20株綿羊肺炎支原體臨床分離株的PCR擴(kuò)增片段；21泳道為陽性對照；22泳道為無模板對照；
圖4.綿羊肺炎支原體臨床分離株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
M: DNA Marker I ;泳道I 15為15株綿羊肺炎支原體臨床分離株的PCR擴(kuò)增片段；16泳道為陽性對照；17泳道為無模板對照。

圖5.綿羊肺炎支原體快速檢測方法的靈敏性檢測
M: DNA Marker I ;泳道I為無模板對照，泳道2 11為10倍系列稀釋的Y98 DNA(2.2 X IO1 2.2Χ1(Γ8 ng/μ )的 PCR 擴(kuò)增片段。圖6.綿羊肺炎支原體16S rRNA基因PCR方法的靈敏性檢測
M: DNA Marker I ;泳道I為無模板對照，泳道2 11為10倍系列稀釋的Y98 DNA(2.2 X IO1 2.2Χ1(Γ8 ng/μ )的 PCR 擴(kuò)增片段。圖7.綿羊肺炎支原體快速檢測方法對臨床樣本的檢測M: DNA Marker I ;泳道I為陽性對照，泳道2為無模板對照，泳道3 21為臨床樣本。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。主要試劑:TaqDNA 聚合酶、10 X PCR Buffer、dNTP 和 MgCl2 均購于 TaKaRa 公司；DNA Marker I購于天根生化科技有限公司；瓊脂糖購于香港基因有限公司；
主要儀器:PCR儀(my cyclerTM)、凝膠成像系統(tǒng)(Doc 2000)、核酸電泳儀(PowerpacuniversalTM)均購于美國Bio-Rad公司；移液器購于德國Eppendorf公司。實(shí)施例1特異性檢測
該實(shí)施例用建立的綿羊肺炎支原體快速檢測方法檢測絲狀支原體絲狀亞種LC型 Y-goat 株(M.mycoides subsp.mycoides.LC)、絲狀支原體山羊亞種 PG3 株(M.mycoides subsp.Capri )、牛支原體(M.bovis)、無乳支原體(M.agalactiae)、精氨酸支原體(M.arginini)、溶血性曼氏桿菌(Mannheimia haemolytica)、大腸桿菌013株(Escherichia coil)、金黃色葡萄球菌 SW07 株(Staphylococcus aureus)、巴氏桿菌(Pasteurella)和沙門氏菌(Salmonella),以參考菌株Y98作為陽性對照，以無模板對照為陰性對照，評價(jià)該方法的特異性。a.PCR 檢測:
DNA提取方法參照[技術(shù)方案]中模板DNA的制備。以提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)體系 25μ :1OXPCR buffer 2.5PL，25mM Mg2+ 1.5μ , 2.5mM dNTPs 2μ ，10μΜ 上下游引物各lKL，5υ/μ Taq酶0.125μ ，50ng/^L DNA模板2μ ，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25μ ;反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72°C終延伸lOmin，16°C結(jié)束反應(yīng)；b.結(jié)果及判斷:
經(jīng)綿羊肺炎支原體的種屬特異性引物PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)結(jié)果見圖2，泳道I為陽性對照，泳道2為無模板對照，泳道3 12依次為絲狀支原體絲狀亞種，絲狀支原體山羊亞種，牛支原體，無乳支原體，精氨酸支原體，溶血性曼氏桿菌，大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，巴氏桿菌，沙門氏菌。一般認(rèn)為陽性特征在135bp處出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增條帶，說明此樣本中含有綿羊肺炎支原體；無模板對照無特征條帶。圖2中陽性對照出現(xiàn)陽性特征，無模板對照無特征條帶；絲狀支原體絲狀亞種LC型Y-goat株、絲狀支原體山羊亞種PG3株、牛支原體、無乳支原體、精氨酸支原體、溶血性曼氏桿菌、大腸桿菌013株、金黃色葡萄球菌SW07株、巴氏桿菌和沙門氏菌均無特征條帶，經(jīng)過3次重復(fù)試驗(yàn)，此結(jié)果穩(wěn)定一致，說明該方法特異性好。實(shí)施例2對已知陽性樣本的檢測
該實(shí)施例用建立的綿羊肺炎支原體快速檢測方法對35株已知綿羊肺炎支原體臨床分離株(基于16S rRNA的PCR鑒定)進(jìn)行檢測，以參考菌株Y98作為陽性對照，以無模板對照為陰性對照，評價(jià)該方法對已知陽性樣本的檢出情況。a.PCR 檢測:
DNA提取方法參照[技術(shù)方案]中模板D NA的制備。以提取的DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測，反應(yīng)體系 25μ : 10XPCR buffer 2.5PL，25mM Mg2+ 1.5μ , 2.5mM dNTPs 2μ ，10μΜ 上下游引物各lKL，5υ/μ Taq酶0.125μ ，50ng/^L DNA模板2μ ，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25μ ;反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72°C終延伸lOmin，16°C結(jié)束反應(yīng)；b.結(jié)果及判斷:
經(jīng)綿羊肺炎支原體的種屬特異性引物PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)結(jié)果見圖3、圖4。圖3中泳道I 20為20株綿羊肺炎支原體臨床分離株的PCR擴(kuò)增片段，泳道21為陽性對照，泳道22為無模板對照；圖4中泳道I 15為15株綿羊肺炎支原體臨床分離株的PCR擴(kuò)增片段，16泳道為陽性對照，17泳道為無模板對照。一般認(rèn)為陽性特征在135bp處出現(xiàn)預(yù)期擴(kuò)增條帶，說明此樣本中含有綿羊肺炎支原體；無模板對照無特征條帶。圖3、圖4中臨床樣本檢測結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致，具有陽性特征，無模板對照無特征條帶，說明該方法對已知陽性樣本的檢出率為100%，通用性好。實(shí)施例3綿羊肺炎支原體快速檢測方法的敏感性評價(jià)
該實(shí)施例將參考菌株Y98進(jìn)行10倍系列稀釋后，分別用本發(fā)明建立的綿羊肺炎支原體快速檢測方法與目前唯——種由McAuliffe L根據(jù)16S rRNA建立的PCR方法進(jìn)行比較，評價(jià)本發(fā)明建立的方法的敏感性。a.PCR 檢測:
DNA提取方法參照[技術(shù)方案]中模板DNA的制備。用核酸蛋白檢測儀測得參考菌株Y98 DNA的濃度為220 ng/^L，將其進(jìn)行10倍系列稀釋(2.2 X IO1 2.2X 1(Γ8 ng/μυ，分別按照本發(fā)明建立的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件及McAuliffe L建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增。b.結(jié)果及判斷: 經(jīng)本發(fā)明建立的綿羊肺炎支原體快速定性檢測方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖5, M為DNA Marker I ,泳道I為無模板對照，泳道2 11為十倍系列稀釋的Y98 DNA (2.2X IO1 2.2X 1(T8 ng/^L)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖5可知，該方法的最低檢測限為4.4X 1(Γ3 ng/反應(yīng)。經(jīng)McAuliffe L根據(jù)16S rRNA建立的PCR方法擴(kuò)增的結(jié)果見圖6，M為DNAMarker I，泳道I為無模板對照，泳道2 11為10倍系列稀釋的Y98 DNA (2.2X IO1
2.2X10_8 ng/μυ的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖6可知，該方法的最低檢測限為4.4 X 10_2 ng/反應(yīng)。由此可見，本發(fā)明建立的綿羊肺炎支原體的快速定性檢測方法比McAuliffe L建立的PCR方法的靈敏度高10倍。實(shí)施例4對臨床樣本的檢測
該實(shí)施例用建立的綿羊肺炎支原體快速檢測方法對來自四川地區(qū)的19份疑似感染綿羊肺炎支原體的羊肺臟組織樣本進(jìn)行檢測。a.PCR 檢測:
羊肺臟組織DNA提取方法參照[技術(shù)方案]中模板DNA的制備。以提取到的DNA為模板，按照本發(fā)明建立的綿羊肺炎支原體快速檢測方法的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)
士豳
>曰οb.結(jié)果及分析:
經(jīng)本發(fā)明建立的綿羊肺炎支原體快速定性檢測方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖7。由圖7可知，19份疑似感染綿羊肺炎支原體的臨床樣本中有9份為綿羊肺炎支原體陽性，說明該方法可通過對臨床病料的快速檢測用于疑似病例的快速診斷。實(shí)施例5本發(fā)明的方法與現(xiàn)有方法對臨床樣本檢出率的比較
該實(shí)施例分別用本發(fā)明建立的綿羊肺炎支原體快速檢測方法與目前唯一一種由McAuliffe L根據(jù)16S rRNA建立的PCR方法對來自四川地區(qū)的疑似感染綿羊肺炎支原體的56份羊鼻腔棉拭子樣本進(jìn)行檢測，比較這兩種方法對臨床樣本的檢出率。a.PCR 檢測:
DNA提取方法參照[技術(shù)方案]中模板DNA的制備。以提取到的DNA為模板，分別按照本發(fā)明建立的方法及McAuliffe L建立的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。b.結(jié)果及分析 本發(fā)明建立的綿羊肺炎支原體快速檢測方法對56份鼻腔棉拭子樣本中綿羊肺炎支原體的檢出率為11/56，而McAuliffe L建立的方法對這56份鼻腔棉拭子樣本中綿羊肺炎支原體的檢出率為9/56，可見本發(fā)明建立的方法比目前唯一報(bào)道的基于16S rRNA建立的檢測綿羊肺炎支原體的PCR方法檢出率高，因此更適用于臨床檢測。
權(quán)利要求
1.一種綿羊肺炎支原體的快速定性檢測方法，其特征在于該方法的步驟如下: A.模板DNA的制備 (1)取IOOg組織進(jìn)行勻衆(zhòng)，再把勻衆(zhòng)后的組織4000r/m離心5min,取上清，上清11000r/m離心30min，棄上清；若是細(xì)菌培養(yǎng)物，則取Iml細(xì)菌培養(yǎng)物于1.5ml離心管中，11000r/m離心30min,棄上清； (2)取500μ STE懸浮沉淀，加入20μ 10% SDSUOPL 10mg/mL蛋白酶K，混勻后于56°C水浴消化1.5h ； (3)加入與在步驟(2)得到的 溶液等體積的苯酚、氯仿和異戊醇混合物，他們的體積比是 25:24:1,混勻，10000r/m 離心 5min ； (4)離心后步驟(3)獲得的溶液分成上層水相、中間固相與下層有機(jī)相，吸取上層水相，加入與所述水相等體積的異戊醇-氯仿混合物，混勻后10000r/m離心3min，取上清液； (5)往上述上清液中加入0.1倍體積的5mol/L NaCl和2倍體積的無水乙醇，混合均勻，10000r/m離心3min,得到DNA沉淀； (6)所述沉淀用70%(體積比)乙醇水溶液洗滌，10000r/m離心lmin，棄乙醇，在室溫下自然干燥，得到模板DNA，然后加入30μ 滅菌去離子水溶解沉淀,于_20°C保存?zhèn)溆茫? B.PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 25μ : 10XPCR buffer 2.5PL，25mM Mg2+ 1.5μ , 2.5mM dNTPs 2μ , 10μΜ上下游引物各lKL，5υ/μ Taq酶0.125μ ，50ng/^L DNA模板2μ ，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25μ ;PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72°C終延伸10min，16°C結(jié)束反應(yīng)；取5μ PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，并使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行電泳圖譜分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種綿 羊肺炎支原體的快速定性檢測方法，其特征在于結(jié)果及判斷為:檢測時(shí)以滅菌去離子水為模板，作為陰性對照；根據(jù)在135bp處出現(xiàn)預(yù)期特征條帶，確定該樣本中含有綿羊肺炎支原體，相反地則不含有綿羊肺炎支原體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種綿羊肺炎支原體的快速定性檢測方法，其特征在于:所述上游引物HSP70F序列為5’ -ACAACTCCTTCTGTTGTTGCCTT-3’，所述下游引物HSP70R序列為5’ -AGCACGAACAGTTTTATCGCTAC-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種綿羊肺炎支原體的快速定性檢測方法。該方法采用自行設(shè)計(jì)的綿羊肺炎支原體熱休克蛋白70(HSP70)基因序列的種屬特異性引物，進(jìn)行種屬特異性PCR反應(yīng)，通過瓊脂糖凝膠電泳圖譜分析，建立綿羊肺炎支原體的簡便、快速、準(zhǔn)確的定性檢測方法。本發(fā)明可用于綿羊肺炎支原體的快速診斷，具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高和易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/04GK103103273SQ20131002895
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者岳華, 湯承, 楊發(fā)龍 申請人:西南民族大學(xué)