組織浸潤淋巴細胞的檢測和測量的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于測量浸潤至實體組織諸如腫瘤或受自身免疫性疾病影響的組織內(nèi)的細胞如淋巴細胞的數(shù)目、水平和/或比率的方法，以及基于此類測量結(jié)果作出患者預后的方法。在一個方面，本發(fā)明的方法包括將來自易獲取組織如外周血的淋巴細胞分選成功能亞組，如細胞毒性T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞，并產(chǎn)生每個亞組的克隆型譜。對受疾病影響的難獲取組織進行采樣并產(chǎn)生一個或多個克隆型譜。根據(jù)后面的克隆型譜，通過它們的克隆型來確定受疾病影響的組織內(nèi)每個功能亞組的淋巴細胞的水平，它們的克隆型根據(jù)來自易獲取組織的、分選成亞組的淋巴細胞來鑒別。
【專利說明】組織浸潤淋巴細胞的檢測和測量 奪叉引用
[0001] 本申請要求2011年12月13日提交的共同未決的美國臨時申請第61/570, 192號 的優(yōu)先權(quán)，該申請通過引用以其整體并入本文。 發(fā)明背景
[0002] 浸潤至受疾病影響的組織如實體瘤內(nèi)的不同淋巴細胞亞組的 數(shù)目和比率通常與疾病的預后有關(guān)，例如Deschoolmeester等人，BMC Immunology, 11:19(2010) ；0htani, Cancer Immunity, 7:4 (2007) ；Yu 等人，Laboratory Investigation, 86:231-245 (2006) ；Diederichsen 等人,Cancer Immunol. Immunother.，52:423-428 (2003);等等。遺憾的是，使用諸如免疫組織化學或流式細胞術(shù)等 可用技術(shù)測量這些量是困難的、勞動密集的，并且不適于日常開展。
[0003] 另外，隨著DNA測序的每個堿基成本的下降，大規(guī)模DNA測序在診斷和預后應(yīng) 用中的使用受到越來越多的關(guān)注。例如，編碼諸如T細胞或B細胞受體等免疫分子或其 組分的核酸譜包含大量關(guān)于生物體的健康或疾病狀態(tài)的信息，因此已經(jīng)提出使用此類譜 作為眾多狀況的診斷或預后指標，例如，F(xiàn)aham和Willis,美國專利公開2010/0151471 ; Freeman 等人，Genome Research, 19:1817-1824(2009) ;Boyd 等人，Sci.Transl. Med.，1 (12) : 12ra23 (2009) ;He 等人，Oncotarget (2011 年 3 月 8 日）。
[0004] 如果能夠?qū)⒏咄亢怂釡y序的改進用于提供一種用于測量組織浸潤淋巴細胞 (TIL)的更方便且更有效的分析，則對于醫(yī)學和科學領(lǐng)域?qū)⑹欠浅Ｓ杏玫摹?br>

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及用于測量浸潤至實體組織如腫瘤內(nèi)的細胞如淋巴細胞的數(shù)目、水平和 /或比率的方法，以及基于此類測量結(jié)果作出患者預后。本發(fā)明在許多實施和應(yīng)用中得到例 證，其中一些總結(jié)如下并貫穿于整個說明書中。
[0006] 在一個方面，本發(fā)明涉及用于鑒別已浸潤實體組織的淋巴細胞的方法，該方法包 括以下步驟：(a)將來自個體的易獲取組織（accessible tissue)的淋巴細胞的樣品分選 成一個或多個亞組；(b)針對來自所述易獲取組織的淋巴細胞的一個或多個亞組中的每一 個產(chǎn)生克隆型譜；（c)從實體組織的至少一個樣品產(chǎn)生至少一個克隆型譜；以及（d)從它們 各自的克隆型檢測該實體組織中每個亞組的淋巴細胞。
[0007] 在另一方面，本發(fā)明涉及用于從患者的淋巴細胞浸潤至實體瘤的狀態(tài)來確定預后 的方法，其中該方法包括以下步驟：（a)將來自該患者的外周血的淋巴細胞的樣品分選成 一個或多個亞組；(b)針對來自外周血的淋巴細胞的一個或多個亞組中的每一個產(chǎn)生克隆 型譜；（c)從實體瘤的至少一個樣品產(chǎn)生至少一個克隆型譜；以及（d)確定所述一個或多個 亞組中的每一個的淋巴細胞的數(shù)目、水平和/或比率。在一個實施方案中，淋巴細胞浸潤至 實體瘤的狀態(tài)是指在實體瘤內(nèi)選定的功能亞組的淋巴細胞的數(shù)目、水平和/或比率。在一 些實施方案中，淋巴細胞浸潤至實體瘤的狀態(tài)還可包括這些值在實體瘤內(nèi)或其附近的空間 分布。
[0008] 本發(fā)明的這些以上表征的方面以及其他方面在許多說明性實施和應(yīng)用中得到例 證，其中一些在附圖中示出且在隨后的權(quán)利要求書部分中進行表征。然而，以上概括性內(nèi)容 并非旨在描述本發(fā)明的每個說明性實施方案或每個實施。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 本發(fā)明的新穎特征在隨附的權(quán)利要求書中具體闡述。通過參考以下闡述說明性實 施方案（其中利用了本發(fā)明的原理）的詳細描述和附圖，將會獲得對本發(fā)明的特征及優(yōu)點 的更好的理解，附圖中：
[0010] 圖1圖解示出了本發(fā)明的一個實施方案的步驟。
[0011] 圖2A至圖2C示出了用于擴增TCRP基因的兩階段PCR方案。
[0012] 圖3A顯示了確定圖2C的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列的細節(jié)。圖3B顯示了確定圖2C 的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列的另一實施方案的細節(jié)。
[0013] 圖4A顯示了在一個反應(yīng)中從一條IgH鏈產(chǎn)生三個測序模板的PCR方案。圖4B至 圖4C顯示了在三個獨立反應(yīng)中從一條IgH鏈產(chǎn)生三個測序模板、之后將產(chǎn)生的擴增子組合 在一起進行二次PCR以添加 P5和P7引物結(jié)合位點的PCR方案。圖4D顯示了針對IgH鏈 產(chǎn)生的序列閱讀（sequence read)的位置。圖4E顯示了使用V區(qū)和J區(qū)的密碼子結(jié)構(gòu)來 改善NDN區(qū)中的堿基判定。 發(fā)明詳沭
[0014] 除非另有說明，本發(fā)明的實踐可利用在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的分子生物學（包括重 組技術(shù)）、生物信息學、細胞生物學和生物化學的常規(guī)技術(shù)和說明。這樣的常規(guī)技術(shù)包括但 不限于血細胞的采樣和分析、核酸測序和分析等?？赏ㄟ^參考本文以下的實例來獲得合適 技術(shù)的具體說明。然而，當然還可使用其他等同的常規(guī)程序。這樣的常規(guī)技術(shù)和說明可見于 標準實驗室手冊，諸如 Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV) ;PCR Primer:A Laboratory Manual ;和Molecular Cloning:A Laboratory Manual (所有均來自 Cold Spring Harbor Laboratory Press);等等。
[0015] 在一個方面，本發(fā)明涉及用于確定浸潤至諸如腫瘤、受自身免疫性疾病影響的組 織、受移植物抗宿主疾?。℅VHD)影響的組織、正常組織等實體組織內(nèi)的淋巴細胞的類型和 數(shù)目的方法。雖然受關(guān)注的實體組織通常是受疾病影響的實體組織，但在一些實施方案中， 還可使用正常組織中淋巴細胞的不同亞組的水平和/或數(shù)目和/或比率來確定個體的健康 狀態(tài)和/或患有疾病或狀況的傾向。
[0016] 圖1示出了本發(fā)明的一個實施方案的概略圖。由易獲取組織（100)如外周血確定 個體的淋巴細胞的克隆型。任選地，可實施最小樣品制備步驟（102)，諸如分離外周血單核 細胞（PBMC)。從該樣品中，將淋巴細胞分選（104)成亞組山、1^"1^(106)，該亞組通常對應(yīng) 于具有獨特生物學功能的淋巴細胞；這樣的亞組在本文中有時被稱為淋巴細胞的"功能亞 組"。通常，分選是基于這些功能上獨特的亞組所特有的一種或多種分子標記物的存在或不 存在進行的。此類標記物可以是細胞表面標記物或細胞內(nèi)標記物。在一個實施方案中，此 類標記物是細胞表面標記物。示例性的細胞表面標記物包括但不限于⑶3、⑶4、⑶8、⑶19、 CD20、CD25、CD45R0、CD117、CD127 等。
[0017] 感興趣的淋巴細胞亞組包括但不限于B細胞、T細胞、細胞毒性T細胞、輔助性T細 胞、調(diào)節(jié)性T細胞、ThlT輔助性T細胞、Th2輔助性T細胞、Th9輔助性T細胞、Thl7輔助性 T細胞、Tfh輔助性T細胞、抗原特異性T細胞及抗原特異性B細胞。每當實體組織是實體 瘤時，特別感興趣的是細胞毒性T細胞和調(diào)節(jié)性T細胞的亞組。
[0018] 或是由于重疊，例如因低效的分選技術(shù)導致的重疊，或是由于第二亞組的成員可 完全包含在（或嵌套在）較大的第一亞組中，一些亞組可包括其他亞組的成員；例如，T細 胞的亞組包括細胞毒性T細胞和輔助性T細胞作為兩個被完全包含的亞組。同樣，正如所 提到的，輔助性T細胞的亞組包括其他幾個被完全包含的亞組。通常，所嵌套的亞組（即亞 組的亞組）的細胞通過使用此類亞組所特有的另外的標記物獲得。淋巴細胞的亞組一般使 用常規(guī)試驗，通常采用市售標記物和試劑盒（例如BD Biosciences，San Jose，CA)，在功能 上和/或通過分子標記物進行鑒別。幾種受關(guān)注的淋巴細胞所特有的標記物如下：針對輔 助性T細胞的CD4 ;針對細胞毒性T細胞的CD8 ;針對調(diào)節(jié)性T細胞的CD4、CD25和低表達 ⑶127 (或可替代地，針對調(diào)節(jié)性T細胞的⑶4、⑶25和細胞內(nèi)表達FoxP3);以及針對記憶效 應(yīng)T細胞的CD45R0+、CCR7-、CD28-、CD27-、CD8+ ;等等（其中" + "和符號按照免疫學 文獻中的常規(guī)符號來使用；即，分別用于指示高表達和低（或不存在）表達）。抗體探針可 市售獲得，用于通過下文描述的分選技術(shù)，例如FACS，來分離此類亞組。如上所述，在一些實 施方案中，此類亞組的淋巴細胞的存在、不存在和/或水平提供了預后信息，諸如正在經(jīng)受 癌癥治療的患者的生存時間。下表總結(jié)了根據(jù)本發(fā)明用于鑒別淋巴細胞亞組的表面和細胞 內(nèi)標記物。本發(fā)明的不同實施方案包括鑒別該表中淋巴細胞亞組的不同組合的克隆型。 表I 可用于FACS分離的淋巴細胞亞組的示例性分子標記物* 亞1且 細I包表面標記物 細胞內(nèi)標記物

【權(quán)利要求】
1. 一種用于鑒別已浸潤實體組織的淋巴細胞的方法，所述方法包括以下步驟： 將來自個體的易獲取組織的淋巴細胞的樣品分選成一個或多個亞組； 針對來自所述易獲取組織的淋巴細胞的一個或多個亞組中的每一個產(chǎn)生克隆型譜； 從實體組織的至少一個樣品產(chǎn)生至少一個克隆型譜；以及 從它們各自的克隆型檢測所述實體組織中每個亞組的淋巴細胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述淋巴細胞的一個或多個亞組中的至少一個包 含B細胞、T細胞、細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、ThlT細胞、Th2T細胞、 Th9T細胞、Thl7T細胞、Tfh T細胞、至少一個抗原特異性B細胞亞組和/或至少一個抗原 特異性T細胞亞組。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述檢測步驟進一步包括確定所述一個或多個亞 組中的每一個的淋巴細胞的數(shù)目、水平和/或比率。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述實體組織是實體瘤。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述淋巴細胞的一個或多個亞組包含調(diào)節(jié)性T細 胞和細胞毒性T細胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述檢測步驟包括確定所述實體瘤中調(diào)節(jié)性T細 胞與細胞毒性T細胞的水平的比率。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述淋巴細胞的一個或多個亞組包括至少一個抗 原特異性T細胞亞組。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述易獲取組織是所述個體的外周血、骨髓、淋巴 液、滑液或脊髓液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述易獲取組織是所述個體的外周血。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟進一步包括通過對它們各自的克 隆型進行計數(shù)來列舉每個所述亞組中的所述淋巴細胞。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述實體組織的所述樣品包括取自所述實體組 織的不同位置的多個組織樣品。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述淋巴細胞的一個或多個亞組包含輔助性T細 胞和細胞毒性T細胞。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述輔助性T細胞是FoxP3+調(diào)節(jié)性T細胞。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述細胞毒性T細胞通過⑶8+標記物來鑒別， 并且其中所述調(diào)節(jié)性T細胞通過標記物⑶4+、⑶25 +(s)和⑶127(ffi)來鑒別。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述實體組織是實體瘤。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中基于一個或多個細胞表面標記物或細胞內(nèi)標記 物，將所述淋巴細胞的一個或多個亞組分選至不同的容器中。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述分選所述淋巴細胞的一個或多個亞組的步 驟采用熒光激活細胞分選儀（FACS)來實施。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述克隆型譜的每個所述克隆型包括T細胞受體 基因的重組部分或免疫球蛋白基因的重組部分。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述克隆型譜的每個所述克隆型包括編碼T細 胞受體β鏈的核酸的V(D)J區(qū)的至少一部分或編碼IgH鏈的核酸的V(D)J區(qū)的至少一部 分。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中每個所述克隆型譜包含至少1000個至少30個 核苷酸的克隆型。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中每個所述克隆型譜包含至少104個克隆型。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述實體組織是受自身免疫性疾病影響的實體 組織。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述淋巴細胞的一個或多個亞組中的至少一個 選自B細胞、T細胞、細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、ThlT細胞、Th2T細胞、 Th9T細胞、Thl7T細胞、Tfh T細胞、抗原特異性B細胞和抗原特異性T細胞，且其中所述檢 測步驟進一步包括確定所述一個或多個亞組中的每一個的淋巴細胞的數(shù)目、水平和/或比 率。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述淋巴細胞的一個或多個亞組包括調(diào)節(jié)性T 細胞、ThlT細胞、Th2T細胞、Th9T細胞、Thl7T細胞、Tfh T細胞和/或至少一個抗原特異 性T細胞亞組。
25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述實體組織選自結(jié)腸組織、小腸組織、皮膚、 結(jié)締組織、皮下組織、肺組織、腎臟組織。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述實體組織是正常組織，且其中所述淋巴細胞 的一個或多個亞組中的至少一個選自B細胞、T細胞、細胞毒性T細胞、輔助性T細胞、調(diào)節(jié) 性T細胞、ThlT細胞、Th2T細胞、Th9T細胞、Thl7T細胞、Tfh T細胞、抗原特異性B細胞和 抗原特異性T細胞，且其中所述檢測步驟進一步包括確定所述一個或多個亞組中的每一個 的淋巴細胞的數(shù)目、水平和/或比率。
27. -種用于從患者的淋巴細胞浸潤至實體瘤的狀態(tài)來確定預后的方法，所述方法包 括以下步驟： 將來自所述患者的外周血的淋巴細胞的樣品分選成一個或多個亞組； 針對來自所述外周血的淋巴細胞的一個或多個亞組中的每一個產(chǎn)生克隆型譜； 從所述實體瘤的至少一個樣品產(chǎn)生至少一個克隆型譜；以及 確定所述一個或多個亞組中的每一個的淋巴細胞的數(shù)目、水平和/或比率。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述一個或多個亞組包括調(diào)節(jié)性T細胞和細胞 毒性T細胞。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述確定步驟包括每當所述細胞毒性T細胞與 調(diào)節(jié)性T細胞的水平的比率高于所述患者的非腫瘤組織中的該比率時，指示高于平均值的 患者生存率。
【文檔編號】C12Q1/68GK104114715SQ201280069638
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月13日
【發(fā)明者】馬利克·法哈姆, 馬克·克林格 申請人:賽昆塔公司