工程改造的微生物及用于微生物油生產(chǎn)的方法
【專利摘要】本發(fā)明的一些方面提供了用于油生產(chǎn)的工程改造的微生物。本文還提供了用于對微生物進行工程改造的方法及工程改造的微生物的用途。在一些實施方式中，提供了微生物，其經(jīng)過工程改造而調(diào)制了脂質合成的速率控制步驟的組合，例如生成代謝物乙酰-CoA、ATP或NADPH用于脂質合成的步驟(推步驟)和隔離脂質合成途徑中介導脂質合成的反饋抑制的產(chǎn)物或中間產(chǎn)物的步驟(拉步驟)的組合。這種推-和-拉工程改造的微生物顯示了極大增強的轉化產(chǎn)率、TAG合成以及儲存特性。
【專利說明】工程改造的微生物及用于微生物油生產(chǎn)的方法
[0001] 相關申請
[0002] 本申請依35U.S.C. § 119要求對美國臨時專利申請。5.5.1 61/548,901(提交于 2011年10月19日）；及美國臨時專利申請U.S.S.N. 61/663,263(提交于2012年6月22 日）的優(yōu)先權，兩個申請的題目均為"工程改造的微生物及用于微生物油生產(chǎn)的方法"，其 全部內(nèi)容都通過引用并入本文。
[0003] 政府支持
[0004] 本發(fā)明是在政府支持下完成的，所屬基金為美國能源部所授予的DE-AR0000059 號基金。政府在本發(fā)明中擁有特定的權利。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 能持續(xù)生產(chǎn)的生物燃料是化石燃料的一個替代選擇，可以幫助減少對容易開采的 化石燃料儲備的消耗，同時能夠避免化石燃料相關的污染以及溫室氣體排放，由此能滿足 不斷增長的對可持續(xù)獲得的能源的需要。發(fā)展適合于將碳源有效轉化為脂質的方法及產(chǎn)油 生物體是微生物生物燃料生產(chǎn)得到廣泛應用的前提條件。
[0007] 本發(fā)明特定方面的概述
[0008] 如果能達到高的轉化產(chǎn)率，那么異養(yǎng)生物的微生物油生產(chǎn)是從可再生資源經(jīng)濟有 效生產(chǎn)生物燃料的一個最有前途的路徑。由可再生原料的經(jīng)濟有效的微生物油生產(chǎn)的關鍵 是高的碳水化合物向油轉化的產(chǎn)率。隨著使能技術應用于此，代謝工程已經(jīng)出現(xiàn)，并且有大 量的實例證明成功的途徑工程改造能顯著地提高微生物生物催化劑在化學、藥學和燃料產(chǎn) 品的合成中的效能。
[0009] 先前在對微生物進行工程改造用于油生產(chǎn)上的努力聚焦于擴增脂肪酸合成途徑 中推測的限速步驟。這樣的規(guī)模擴增有一個顯著的缺陷，就是不斷增加的碳流進入脂肪酸 合成途徑會增加了細胞中飽和脂肪酸的水平，由此激活了脂肪酸生物合成中強烈的負反饋 循環(huán)。
[0010] 本發(fā)明的一些方面提供了微生物工程改造的策略，其組合了上游的代謝物形成途 徑（本文也稱為"推"代謝途徑）的擴增以及類似的下游產(chǎn)物隔離（sequestering)途徑（本 文也稱為："拉"代謝途徑）中代謝流的增加。本發(fā)明的一些方面提供了微生物中推-和-拉 修飾的平衡組合，使得大量碳流的擴增進入脂質合成途徑，而中間代謝物的濃度不會顯著 偏離其穩(wěn)態(tài)生理水平，因此避免了對脂質合成的反饋抑制。
[0011] 本公開的一些方面涉及這樣的認識，即單一分支修飾如僅推的修飾或僅拉的修飾 的對轉化效率的效應通常是有限的，因為細胞中有合成產(chǎn)率的補償性的調(diào)控，并且微生物 細胞中脂質生物合成的推和拉步驟的和諧調(diào)控對脂質生產(chǎn)產(chǎn)生驚人的協(xié)同效應。
[0012] 例如，本公開的一些方面提供了遺傳修飾的產(chǎn)油微生物，其包含了脂質生物合成 途徑的不同修飾的組合，本文也稱為推拉修飾。在一些實施方式中，本文提供的微生物包含 了產(chǎn)生脂質合成中需要的代謝物或中間產(chǎn)物的產(chǎn)率增加的修飾，以及使得細胞中脂質合成 的產(chǎn)物的隔離的修飾，如甘油三酯向儲存形式的脂質，由此減少了其一些產(chǎn)物如脂肪酸或 甘油二酯對脂質合成的反饋抑制。在一些實施方式中，代謝性推和代謝性拉的途徑中修飾 的組合使得脂質生產(chǎn)有協(xié)同性的增加。在一些實施方式中，推修飾使得脂質合成的元件塊 或脂質合成的代謝物在細胞中的水平增加。在一些實施方式中，拉修飾減少了對脂質合成 的反饋抑制。
[0013] 本發(fā)明的一些方面提供了包含遺傳修飾的微生物，所述修飾同時影響脂質生物合 成的推和拉途徑。例如，推和拉修飾被引入到產(chǎn)油的模式微生物中一產(chǎn)油酵母解脂耶氏 酵母（Yarrowia lipolytica)中。研究甘油三酯（TAG)合成途徑中最后一步的甘油二脂乙 酰轉移酶（DGA1)的過表達，作為示例性的拉修飾。DGA1過表達使得脂質生產(chǎn)比對照微生物 中增加4倍，脂質含量達到細胞干重（DCW)的33. 8%。研究脂肪酸合成的第一個關鍵步驟 中乙?；?CoA羧基水解酶（ACC1)作為示例性的推修飾。ACC1過表達使得脂質含量是對照 的2倍，達到17. 9%的脂質含量。對串聯(lián)基因表達構建體中同時共表達ACC1和DGA1進行 研究作為示例性的推-拉修飾。ACC1和DGA1同時過表達進一步使脂質含量增加到41. 4%， 表明ACC1+DGA1共表達具有協(xié)同效應。
[0014] 在2L生物反應器發(fā)酵中，探索了 ACC1+DGA1轉化子的脂質生產(chǎn)特征，120hr后，月旨 質含量達到61. 7%。發(fā)酵過程的脂質積累期中的總體的產(chǎn)率和生產(chǎn)效率分別為0. 195g/g 和0. 143g/L/hr，最大產(chǎn)率和生產(chǎn)效率為0. 270g/g和0. 253g/L/hr。該研究表明了產(chǎn)油酵 母解脂耶氏酵母具有極佳的脂質生產(chǎn)能力，也證明了對脂質合成途徑中兩個重要步驟進行 代謝工程改造的效應，所述改造將流轉移至脂質合成并產(chǎn)生TAG合成的驅動力。
[0015] 本發(fā)明的一些方面提供了用于產(chǎn)油微生物，例如產(chǎn)油酵母的新型過表達平臺。本 發(fā)明的一些方面提供了表達構建體，其包含啟動子（驅動包括編碼序列和內(nèi)含子的轉錄物 的轉錄），例如翻譯延長因子-la (TEF)啟動子，其位于包含內(nèi)含子和編碼序列的核酸上 游。本公開的一些方面提供了能夠比無內(nèi)含子TEF啟動子增加表達至少17倍的含內(nèi)含子 的表達構建體。
[0016] 本公開的一些方面提供了分離的產(chǎn)油細胞，其包含了增加 DGA1基因產(chǎn)物的表達 的遺傳修飾。在一個實施方式中，所述分離的產(chǎn)油細胞進一步包含增加 ACC1基因產(chǎn)物的表 達的遺傳修飾。在一些實施方式中，所述分離的產(chǎn)油細胞進一步包含了增加 S⑶基因產(chǎn)物 的表達的遺傳修飾。在一些實施方式中，所述分離的產(chǎn)油細胞進一步包含了增加 ACL基因 產(chǎn)物的表達的遺傳修飾。在一些實施方式中，所述遺傳修飾包含了增加基因表達的核酸構 建體，所述核酸構建體包含（a)包含在合適的同源或異源啟動子控制下的、編碼基因產(chǎn)物 的核酸序列的表達盒，和/或（b)當插入細胞基因組時，調(diào)控基因產(chǎn)物的表達水平的核酸序 列。在一些實施方式中，啟動子是誘導型或組成型的啟動子。在一些實施方式中，啟動子為 TEF啟動子。在一些實施方式中，所述表達構建體進一步包含內(nèi)含子。在一些實施方式中， 所述內(nèi)含子在轉錄起始位點的下游。在一些實施方式中，內(nèi)含子在編碼基因產(chǎn)物的核酸序 列之內(nèi)。在一些實施方式中，所述核酸構建體抑制或破壞對編碼所述基因產(chǎn)物的原生基因 的天然調(diào)控，導致原生基因的過表達。在一些實施方式中，對原生基因的天然調(diào)控的抑制或 破壞是通過對調(diào)控基因表達的調(diào)控區(qū)域或調(diào)控區(qū)域的部分進行刪除、破壞、突變和/或置 換而介導的。在一些實施方式中，所述基因產(chǎn)物是轉錄物。在一些實施方式中，所述基因產(chǎn) 物是蛋白質。在一些實施方式中，所述核酸構建體插入細胞的基因組內(nèi)。在一些實施方式 中，基因產(chǎn)物的表達增加賦予細胞將碳源轉化為脂質，例如脂肪酸，脂肪酸衍生物和/或甘 油三酯（TAG)的有益表型。在一些實施方式中，所述有益表型包括修飾的脂肪酸譜、修飾的 TAG譜、增加的脂肪酸和/或甘油三酯合成速率、增加的轉化產(chǎn)率、增加的細胞中甘油三酯 積累，和/或細胞的脂質小體中增加的甘油三酯積累。在一些實施方式中，所述細胞的脂肪 酸或TAG的合成速率比相同細胞類型的未修飾細胞增加至少2倍。在一些實施方式中，所 述細胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同細胞類型的未修飾細胞增加至少5倍。在一些實 施方式中，所述細胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同細胞類型的未修飾細胞增加至少10 倍。在一些實施方式中，細胞將碳源轉化為脂肪酸或TAG的轉化率在大約0. 025g/g-大約 0. 32g/g (例如，所產(chǎn)生的脂質g/所消耗的碳源g)的范圍內(nèi)。在一些實施方式中，細胞將碳 源轉化為脂肪酸或TAG的轉化率為至少大約0. llg/g。在一些實施方式中，細胞將碳源轉化 為脂肪酸或TAG的轉化率為至少大約0. 195g/g。在一些實施方式中，細胞將碳源轉化為脂 肪酸或TAG的轉化率為至少大約0. 24g/g。在一些實施方式中，細胞將碳源轉化為脂肪酸或 TAG的轉化率為至少大約0.27g/g。在一些實施方式中，所述細胞包含脂質小體或液泡。在 一些實施方式中，細胞為細菌細胞、藻類細胞、真菌細胞或酵母細胞。在一些實施方式中，所 述細胞為產(chǎn)油酵母細胞。在一些實施方式中，細胞為解脂耶氏酵母細胞。
[0017] 本公開的一些方面提供了包含產(chǎn)油細胞，例如本文所描述的產(chǎn)油細胞的培養(yǎng)物。 在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物進一步包含碳源。在一些實施方式中，所述碳源包含可發(fā)酵 糖。在一些實施方式中，所述可發(fā)酵糖為C6糖。在一些實施方式中，所述碳源包含葡萄糖。 在一些實施方式中，所述碳源包含有機酸。在一些實施方式中，所述有機酸是醋酸。在一 些實施方式中，醋酸濃度為至少5% vol/vol、至少10% vol/vol、至少15% vol/vol、至少 20% vol/vol、至少25% vol/vol或至少30% vol/vol。在一些實施方式中，所述碳源包含 醋酸鹽。在一些實施方式中，醋酸鹽的濃度為至少1%ν〇1/ν〇1。在一些實施方式中，醋酸 鹽的濃度為至少2% vol/vol。在一些實施方式中，醋酸鹽的濃度為至少3% vol/vol。在 一些實施方式中，醋酸鹽的濃度為至少4% vol/vol。在一些實施方式中，醋酸鹽的濃度為 至少5% vol/vol。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物包含甘油。在一些實施方式中，甘油濃 度為大約2% vol/vol。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物包含溶解氧水平為至少5%、至少 10%、至少15%或至少20%。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物顯示的pH在pH7. 0-pH7. 5范 圍內(nèi)。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物包含硫酸銨。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物包含以 1:2比率的硫酸銨和醋酸。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物顯示5g/l-60g/l之間的脂質滴 度。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物顯示0.04g/l/h-0.60g/l/h之間的脂質生產(chǎn)。在一些 實施方式中，所述培養(yǎng)物顯示〇. lg/1/h-lg/l/h之間的最大脂質生產(chǎn)效率。
[0018] 本公開的一些方面提供了方法，包含將碳源和分離的產(chǎn)油細胞接觸，所述細胞包 含增加 DGA1基因產(chǎn)物的表達的遺傳修飾；以及將碳源與細胞接觸在適合細胞將至少部分 碳源轉化為脂肪酸或甘油三酯的條件下進行孵育。在一些實施方式中，所述產(chǎn)油細胞進一 步包含增加 ACC1基因產(chǎn)物的表達的遺傳修飾。在一些實施方式中，所述產(chǎn)油細胞進一步包 含增加 S⑶基因產(chǎn)物的表達的遺傳修飾。在一些實施方式中，所述產(chǎn)油細胞進一步包含增 加 ACL基因產(chǎn)物的表達的遺傳修飾。在一些實施方式中，所述分離的產(chǎn)油細胞是如本文所 描述的工程改造的分離的產(chǎn)油細胞。在一些實施方式中，所述碳源包含可發(fā)酵糖。在一些 實施方式中，所述碳源包含葡萄糖。在一些實施方式中，所述碳源包含醋酸鹽。在一些實施 方式中，醋酸鹽的濃度為至少1 % vol/vol、至少2% vol/vol、至少3% vol/vol、至少4% vol/vol或至少5%vol/vol。在一些實施方式中，所述碳源包含醋酸。在一些實施方式 中，醋酸的濃度為至少5% vol/vol、至少10% vol/vol、至少15% vol/vol、至少20% vol/ vol、至少25% vol/vol或至少30% vol/vol。在一些實施方式中，所述方法包括將細胞與 溶解氧接觸，所述溶解氧水平為至少5%、至少10%、至少15%或至少20%。在一些實施方 式中，所述的接觸和/或孵育是在pH7. 0-pH7. 5的pH范圍內(nèi)進行的。權利要求53-69中任 一項的方法，其中所述方法包括將細胞與硫酸銨接觸。在一些實施方式中，所述方法包括將 細胞與比率為1:2的硫酸銨和醋酸接觸。在一些實施方式中，所述方法進一步包含將細胞 與甘油接觸。在一些實施方式中，所述方法包括將細胞與濃度為大約2% vol/vol的甘油接 觸。在一些實施方式中，與分離的產(chǎn)油細胞接觸的碳源是在反應器中進行孵育。在一些實 施方式中，將碳源與分離的產(chǎn)油細胞接觸，并在分批補料過程中進行孵育，使碳源轉化為脂 肪酸或甘油三酯。在一些實施方式中，將碳源與分離的產(chǎn)油細胞接觸，并在連續(xù)過程中進行 孵育，使碳源轉化為脂肪酸或甘油三酯。在一些實施方式中，所述方法進一步包括在孵育步 驟中一次或多次地將額外量的碳源或一定量的額外碳源與接觸分離產(chǎn)油細胞的碳源接觸。 在一些實施方式中，通過溶劑萃取法從接觸分離的產(chǎn)油細胞的碳源中萃取脂肪酸或甘油三 酯。在一些實施方式中，溶劑萃取包括氯仿甲醇萃取。在一些實施方式中，溶劑萃取包括己 烷萃取。在一些實施方式中，將脂肪酸或甘油三酯與接觸分離的產(chǎn)油細胞的碳源分離，并隨 后通過酯交換反應進行精煉。
[0019] 本公開的一些方面提供了方法，其包括通過增加細胞中DGA1基因產(chǎn)物的表達以 在產(chǎn)油細胞中修飾脂肪酸譜、甘油三酯譜、脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍 生物積累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化率、 和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物轉化的有效產(chǎn)率。在一些實施方式中，所述方 法進一步包括增加細胞中ACC1基因產(chǎn)物、SCD基因產(chǎn)物和/或ACL基因產(chǎn)物的表達。在一 些實施方式中，脂肪酸衍生物積累的程度是脂肪酸衍生物在脂質小體中積累的程度。在一 些實施方式中，所述脂肪酸衍生物是甘油三酯。在一些實施方式中，對產(chǎn)油細胞中脂肪酸 譜、甘油三酯譜、脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍生物積累的程度、脂肪酸衍 生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化率、和/或碳水化合物向脂肪 酸或脂肪酸衍生物轉化的有效產(chǎn)率的修飾包含增加產(chǎn)油細胞中的脂肪酸合成速率、甘油三 酯合成速率、脂肪酸衍生物積累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂 肪酸衍生物的轉化率、和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物轉化的有效產(chǎn)率。在一 些實施方式中，對細胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化效率的修飾包含使轉 化效率增加至少2倍。在一些實施方式中，對細胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物 的轉化效率的修飾包含使轉化效率增加至少3倍。在一些實施方式中，對細胞中碳水化合 物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化效率的修飾包含使轉化效率增加至少4倍。在一些實施 方式中，對細胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化效率的修飾包含使轉化效率 增加至少5倍。在一些實施方式中，所述細胞為酵母細胞。在一些實施方式中，所述酵母細 胞為耶氏酵母屬細胞。在一些實施方式中，所述產(chǎn)油酵母是解脂耶氏酵母。
[0020] 本公開的一些方面提供了分離的核酸分子，其包括：a)編碼SEQ ID N0:2(解脂耶 氏酵母DGA1)的核苷酸序列，或b)與a)的核苷酸序列至少85%相同的核苷酸序列。在一 些實施方式中，編碼SEQ ID N0:2的核苷酸序列包含SEQ ID N0:1。本公開的一些方面提供 了表達盒，其包含如本文描述的分離的核酸分子以及異源啟動子。在一些實施方式中，啟動 子是組成型啟動子或誘導型啟動子。在一些實施方式中，所述異源啟動子為翻譯延長因子 (TEF)啟動子。在一些實施方式中，所述異源啟動子包含內(nèi)含子。在一些實施方式中，所述 異源啟動子進一步包含起始密碼子。在一些實施方式中，內(nèi)含子位于編碼SEQ ID N0:2的 核苷酸序列的翻譯起始位點的下游。本公開的一些方面提供了載體，其包含如本文所描述 的表達盒。本公開的一些方面提供了細胞，其包含如本文所描述的表達盒或本文描述的載 體的至少一部分。
[0021] 本申請的主體要素在一些情況下涉及相關產(chǎn)品、對特定問題的備選解決方案，和/ 或單一系統(tǒng)或物品的大量不同用途。
[0022] 本發(fā)明的其他優(yōu)勢、特征以及用途在特定非限制性實施方式的具體描述、附圖以 及權利要求條款中更顯而易見。
[0023] 附圖簡述
[0024] 圖1.解脂耶氏酵母中脂質合成的主要代謝途徑總覽。
[0025] 圖2.培養(yǎng)50小時后不同啟動子控制下β -半乳糖苷酶的酶活性。
[0026] 圖3. ACC1+DGA1轉化子的生物反應器發(fā)酵（MTYL065)。
[0027] 圖4. 2-L生物反應器發(fā)酵過程中ACC1+DGA1轉化子的脂肪酸譜（FAP)。
[0028] 圖5.在2-L生物反應器中生長并以醋酸鹽為碳源的ACC+DGA轉化子的脂肪酸譜。
[0029] 圖6.在醋酸鹽上的ACC+DGA1解脂耶氏酵母的脂肪酸生產(chǎn)情況。
[0030] 圖7.組合表達構建程序。為構建含有同脂質積累基因靶標的組合的質粒采用的 克隆途徑和策略。這些質粒隨后轉化入解脂耶氏酵母以研究脂質積累情況。
[0031] 圖8.通過ρΜΤ053整合與ρΜΤ092比較TEFin-DGA盒的轉錄表達。
[0032] 圖9.表達組合構建體的解脂耶氏酵母菌株之間的相對脂質生產(chǎn)效率和產(chǎn)率，通 過將總脂肪酸含量以對照菌株標準化測出。在圖下方指示了是（+)或否（_)存在相應基因 靶標的轉化的過表達盒。以最初培養(yǎng)100小時內(nèi)相對脂質積累來計算生產(chǎn)效率（淺灰色條 形）。產(chǎn)率是通過將脂質積累除以所消耗的糖計算的。培養(yǎng)基的C/N比率為20。結果為多 個實驗的平均值。
[0033] 圖10.靶標基因在菌株MTYL089中的轉錄表達。表達根據(jù)肌動蛋白表達進行內(nèi)部 標準化，并且是與對照（MTYL038)菌株相比較，表達測定在生長66小時后進行。
[0034] 圖11.過表達ACC、D9、ACL12和DGA的MTYL089菌株在批式生物反應器的發(fā)酵情 況。C/N摩爾比率為100。所有取樣都進行三次重復。
[0035] 圖12. 2-L發(fā)酵結束時MTYL089的顯微鏡成像。普通光學顯微鏡成像（左圖）顯 示了大部分細胞是酵母形式，包含大的液泡。熒光顯微成像（右圖）表明這些液泡是由中 性脂質組成的。
[0036] 圖13. MTYL065和MTYL089兩種菌株之間的脂肪酸譜對比。取自各個發(fā)酵終點的 脂肪酸譜，相對總的脂肪酸含量進行標準化。
[0037] 圖14.氮（mM)、非脂質和脂質滴度（g/L)的變化趨勢。
[0038] 圖15.脂質滴度（g/L)、脂質含量（％)和C/N比率的趨勢。主坐標軸顯示了脂質 滴度和脂質含量，以細胞干重％表示。次坐標軸顯示了 C/N比率。C/N比率在終點時由于醋 酸鹽快速消耗有所下降。
[0039] 圖16.上圖--在沒有熒光的油浸顯微鏡（100X)下觀察到的"浮游細胞"。下 圖一熒光下相同視野顯示了明亮的紅色脂質小體。
[0040] 本發(fā)明特定實施方式詳述
[0041] 液體生物燃料作為化石燃料的替代品非常有前途，可以幫助減輕對于氣候變化的 顧慮，并且緩解了供應的不確定性（1)。生物柴油、航空油料和其他油衍生燃料對于航空和 重型貨車運輸是尤其必需的。目前這些產(chǎn)品都是只在蔬菜油中生產(chǎn)，這是一條成本高又不 可持續(xù)的途徑（2)。一個有吸引力的可能性是將可再生的碳水化合物原料非光合作用地轉 化為油（3)。對于生物柴油，對于油原料從蔬菜油向微生物油生產(chǎn)的轉變具有大量的其他優(yōu) 勢：能適應多樣的物料，在對土地的需求上非常靈活，有效的加工循環(huán)轉換，并且很容易進 行規(guī)模擴大（4)。用于微生物生產(chǎn)的生物平臺也更容易在遺傳上進行操縱，利于進一步的優(yōu) 化。
[0042] 由碳水化合物轉化為油的經(jīng)濟有效微生物技術的關鍵是高碳水化合物向油的轉 化產(chǎn)率。隨著使能技術應用于此，代謝工程已經(jīng)出現(xiàn)，并且有大量的實例證明成功的途徑工 程改造能顯著地提高微生物催化劑在化學、藥學和燃料產(chǎn)品的合成中的效能（5)。先前在 工程改造具有高脂質合成的微生物的努力集中于擴大脂肪酸合成途徑中推測的限速步驟 (6)。然而這些努力都產(chǎn)生了好壞參半的結果，可以是因為調(diào)控脂肪酸流導致飽和脂肪酸水 平升高，飽和脂肪酸是脂肪酸生物合成酶的有力的變構抑制劑，也為脂肪酸生物合成創(chuàng)造 了負反饋循環(huán)（7)。本文描述了結合上游代謝物形成途徑的擴大和類似地增加下游代謝物 消耗途徑中代謝流的方法。如果得到平衡，則這種推-和-拉策略可產(chǎn)生大的代謝流的擴 增，而中間產(chǎn)物代謝物的濃度不會明顯偏離其的穩(wěn)態(tài)生理水平。
[0043] 產(chǎn)油酵母解脂耶氏酵母是生物柴油生產(chǎn)的一個有吸引力候選者，其也在其他工 業(yè)應用中有廣泛用途：檸檬酸生產(chǎn)、蛋白質生產(chǎn)（例如，蛋白酶和酯酶）以及生物修復 (8-10)。隨著對其基因組的完全測序和遺傳工程工具不斷完善，要完成對解脂耶氏酵母的 工程改造相對容易（11)。而且還發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母在培養(yǎng)基中生長旺盛，能夠在多種底物 上生長，并且也可用于在農(nóng)業(yè)工業(yè)廢品、工業(yè)甘油及工業(yè)脂肪上生產(chǎn)脂質（12-14)。其具有 極佳的脂質積累能力，通常能積累高達36%細胞干重（DCW)的脂質（15)。
[0044] 已經(jīng)開始對解脂耶氏酵母中從頭開始的脂質合成的代謝途徑進行完整的作圖，圖 1中闡明了目前的脂質合成模型：進入糖酵解過程的葡萄糖會進入線粒體，用作TCA循環(huán) 中的丙酮酸；然而，多余的乙酰-CoA是通過檸檬酸穿梭途徑從線粒體進入細胞溶膠的。然 后細胞溶膠中的乙酰-CoA被乙酰-CoA羧化酶（ACC)轉化為丙二酰-CoA，這是脂肪酸合成 的第一個步驟。在脂肪酸合成后，甘油三酯（TAG)合成沿著肯尼迪途徑進行，這是在內(nèi)質 網(wǎng)（ER)和脂質小體中進行的。?；?CoA是?；筛视?3-磷酸骨架以形成溶血磷脂 酸（LPA)的前體，后者進一步?；纬闪字幔≒A)。隨后PA去磷酸化形成二脂酰甘油 (DAG)，最后二脂酰甘油?；D移酶（DGA)進行一步酰化反應產(chǎn)生TAG。
[0045] 乙酰-CoA從線粒體向細胞溶膠的運輸是通過以下進行的：ATP-通過檸檬酸穿梭 的檸檬酸裂解酶（ACL)介導的檸檬酸裂解產(chǎn)生乙酰-CoA和草酰乙酸（0ΑΑ)。然后乙酰-CoA 羧化酶（ACC)催化進行脂質生物合成的第一個關鍵步驟，將細胞溶膠中乙酰-CoA轉化為丙 二酰-CoA，后者是脂肪酸鏈延伸的主要前體。然后完整的脂肪酰-CoA鏈被運輸?shù)絻?nèi)質網(wǎng) (ER)或脂質小體膜，通過肯尼迪途徑進行甘油三酯（TAG)的最后組裝。解脂耶氏酵母中生 產(chǎn)的超過80 %的儲存脂質都是TAG形式（16)。細胞溶膠0ΑΑ被蘋果酸脫氫酶轉化為蘋果 酸并運輸回線粒體，以完成檸檬酸穿梭循環(huán)。NADPH形式的還原性等價物可由磷酸戊糖途徑 或轉氫酶途徑中的蘋果酸酶來提供。在解脂耶氏酵母中，有高的PPP代謝流且蘋果酸酶過 表達沒有效果，這表明前者是NADPH的主要來源（4, 17)。
[0046] 細胞內(nèi)脂質積累可經(jīng)由兩種方法進行：從頭開始的脂質合成或外源脂肪酸和脂質 的外部并入。在營養(yǎng)供應耗盡時又有多余碳源存在下，最常發(fā)生脂質的積累。在培養(yǎng)中，這 種狀態(tài)通常與靜止期的開始相吻合。在實踐中，最常用的限制性營養(yǎng)是氮，因為在培養(yǎng)基組 合物中非常容易控制氮的含量（15)。除了這些可誘導的條件，脂質合成途徑是受到高度調(diào) 節(jié)的，這樣生物體能夠使細胞生長與能量儲存達到平衡。例如，僅僅是ACC就在多個水平上 受到多種因素的調(diào)節(jié)（7)。
[0047] 這種緊密的調(diào)節(jié)在特定情況下也可以進行規(guī)避。通過消除過氧化物酶體氧化途 徑及對甘油代謝進行工程改造，解脂耶氏酵母能夠通過從頭脂質積累達到40% -70 %脂質 (18, 19)。Λ 6-和Λ 12-去飽和酶基因的共表達使得細胞產(chǎn)生顯著量的γ-亞麻酸（GLA) (20)。然而，在解脂耶氏酵母中工程改造脂質生物合成途徑相對而言依然沒有得到很好的 探索，人們依然在發(fā)展用于有效工程改造脂質生產(chǎn)途徑以使產(chǎn)率最大化的策略。
[0048] 本公開的一些方面提供了工程改造的微生物，用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前 體。術語"生物燃料"指的是衍生于生物學來源如活細胞、微生物、真菌或植物的燃料。該術 語包括例如直接由生物學來源獲得，例如，通過常規(guī)萃取、蒸餾或精煉方法得到的燃料，以 及通過加工獲自生物學來源的生物燃料前體而生產(chǎn)的燃料，如通過化學修飾如酯交換步驟 進行加工。直接獲得的生物燃料的實例為酒精類，如乙醇、丙醇和丁醇，脂肪和油?？赏ㄟ^ 加工生物燃料前體（例如脂質）而獲得的生物燃料的實例為生物柴油（例如通過對脂質進 行酯交換反應產(chǎn)生）以及綠色柴油/改性油染料（例如通過對油進行脫氫反應產(chǎn)生）。生 物柴油，也稱為脂肪酸甲酯（或乙酯）是現(xiàn)今在經(jīng)濟上最重要的生物燃料之一，可以通過對 脂質進行酯交換反應在工業(yè)規(guī)模上進行生產(chǎn)，在所述酯交換反應中，氫氧化鈉和甲醇（或 乙醇）與脂質如甘油三酯發(fā)生反應，產(chǎn)生生物柴油和甘油。
[0049] 生物柴油的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的原料包括動物脂肪、植物油、棕櫚油、麻、大豆、油菜 籽、亞麻、向日葵、油質和產(chǎn)油藻類。在其他方法中，由微生物將生物質轉化為生物燃料前體 如脂質，隨后將所述前體進行萃取并進一步加工生成生物燃料。術語"生物質"指的是通過 培養(yǎng)和/或繁殖活細胞或生物體（例如微生物）產(chǎn)生的物質。生物質可以包含細胞、微生 物和/或細胞間內(nèi)含物，例如細胞脂肪酸和TAGS，以及細胞外物質。細胞外物質包括但不限 于細胞分泌的化合物，例如分泌到細胞外的脂肪酸或TAG。用于生物燃料生產(chǎn)的重要的生物 質類型為藻類生物質和植物衍生的生物質，例如玉米秸桿和木纖維。在一些實施方式中，用 于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的生物質可包含植物衍生的糖類，例如蔗糖或玉米衍生糖 類。
[0050] 本公開的一些方面涉及脂質的微生物來源的工程改造和開發(fā)，其可用于例如經(jīng)濟 上可行的工業(yè)規(guī)模生物柴油生產(chǎn)。術語"脂質"指的是脂肪酸及其衍生物。相應地，脂質的 實例包括脂肪酸（FA，包括飽和及不飽和）；甘油酯或甘油脂，也稱為酰基甘油（如單甘油酯 (單?；视停?、甘油二酯（二酰基甘油）、甘油三酯（三酰基甘油，TAG，或中性脂肪）；磷酸 甘油酯（甘油磷酸酯）；非甘油酯（鞘脂，固醇脂，包括膽固醇和類固醇激素，異戊烯醇脂包 括萜類，脂肪醇，蠟和聚酮化合物）；以及復合脂質衍生物（糖連接的脂質或糖脂，和蛋白連 接的脂質）。脂質是活細胞和微生物細胞質膜中至關重要的部分。一些細胞和微生物還生 產(chǎn)脂質用于儲存能量，例如以三?；视偷男问剑嬖谟谥|小體、脂肪滴或液泡中。
[0051] 本發(fā)明的一些方面涉及工程改造的微生物用于生物燃料或生物燃料前體的生產(chǎn)。 在一些實施方式中，本文提供的微生物經(jīng)過工程改造以優(yōu)化其脂質代謝以生產(chǎn)脂質。術語 "脂質代謝"指的是涉及脂質的制造或降解的分子過程。脂肪酸合成、脂肪酸氧化、脂肪酸去 飽和、TAG合成、TAG儲存以及TAG降解都是細胞中脂質代謝組成部分的實例。因此，術語 "脂肪酸代謝"指的是涉及脂肪酸合成、產(chǎn)生、轉化或降解的所有細胞或生物體的過程。脂肪 酸合成、脂肪酸氧化、脂肪酸去飽和、TAG合成以及TAG降解都是細胞中脂肪酸代謝組成部 分的實例。
[0052] 術語"三酰基甘油"（TAG，有時也稱為甘油三酯）指的是如下分子，其包含通過酯 鍵共價連接于三個脂肪酸分子（為一元的脂肪族羧酸）的甘油的單個分子，在甘油分子的 三個羥基（0H)基團上分別連接一個脂肪酸分子。三?；视褪谴x能量的高度濃縮的儲 備，因為其特征為體積小、不含水，并且是生物柴油生產(chǎn)的合適的原料。
[0053] 許多細胞和生物體都以脂肪酸和脂肪酸衍生物的形式儲存代謝能量，如TAG。月旨 肪酸及其衍生物，如TAG，提供了儲存代謝能量的理想形式。在C-C鍵中包含的能量可通過 β_氧化反應得到有效釋放，這在形式上是等價于脂肪酸生物合成的逆反應的一個反應過 程，但是是由不同的酶組成的不同分子途徑介導和調(diào)節(jié)的。微生物可由外部供應、內(nèi)部轉換 及從頭合成而獲取脂肪酸。本發(fā)明的一些方面涉及基于微生物有效地從外部供應的碳源合 成及儲存脂肪酸或脂肪酸衍生物如TAG的能力，鑒別用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的 微生物。
[0054] 天然脂肪酸分子通常具有4-28個碳原子的無分支的脂肪鏈或尾巴。如果脂肪鏈 的所有碳原子都是經(jīng)由C-C單鍵連接，則脂肪酸被稱為"飽和的"，如果兩個或更多個碳原 子是經(jīng)由C-C雙鍵連接，則脂肪酸被稱為"不飽和的"。不飽和脂肪酸在膜的流動性、細胞活 性、代謝和控制基因轉錄的核內(nèi)事件中起重要作用。
[0055] 酵母中的脂肪酸譜主要由C16和C18脂肪酸組合，例如棕櫚酸（C16)、棕櫚油酸 (C16)、硬脂酸（C18)和油酸（C18)。棕櫚酸是無支鏈的飽和脂肪酸，脂肪鏈具有16個碳原子 (碳原子/不飽和鍵：16. 0)。硬脂酸是無支鏈的飽和脂肪酸，脂肪鏈有18個碳原子（18. 0)。 棕櫚油酸是單不飽和脂肪，脂肪鏈有16個碳原子（16. 1)。油酸是單不飽和脂肪，脂肪鏈有 18個碳原子（18. 1)。酵母中有少數(shù)脂肪酸種類包括C14和C26脂肪酸，這些在蛋白質修飾 中起至關重要的作用或分別作為鞘脂及GPI錨定物的組成部分。
[0056] 脂肪酸的從頭合成利用了大量代謝物、乙酰-CoA、ATP和NADPH，因此與依賴于這 些化合物的其他細胞過程相競爭。脂肪酸延伸循環(huán)中有兩個還原步驟都需要NADPH，這將脂 肪酸合成與細胞的代謝狀態(tài)關聯(lián)起來，使脂肪酸合成被限制在細胞具有高的能量負荷（表 現(xiàn)為ATP/AMP比率增加，還原性當量升高及乙酰-CoA庫升高）的條件下。幾乎所有亞細胞 細胞器都參與到脂肪酸代謝中，這表明脂肪酸平衡的維持需要在多種水平上進行調(diào)節(jié)。生 成用于脂質生物合成的代謝物、乙酰_CoA、ATP或NADPH的脂質合成步驟在本文中有時被稱 為脂質合成的"推步驟"。例如通過過表達介導如代謝物生產(chǎn)過程的基因產(chǎn)物對增加細胞中 脂質生物合成的代謝物、乙酰-CoA、ATP或NADPH的生產(chǎn)的這些過程進行擴增，在本文有時 被稱為"推修飾"。
[0057] 包括酵母在內(nèi)的大多數(shù)生物體能夠由多種碳源從頭合成脂肪酸。在起始步驟中， 乙酰-CoA由乙酰-CoA羧化酶（ACC ;在酵母中由ACC1和HFA1編碼）通過將C02添加到 丙二酰-CoA上進行羧化。生物素是該反應中一個至關重要的輔助因子，其通過生物素：載 脂蛋白連接酶（在酵母中由BPL1/ACC2編碼）這種酶的作用共價連接于ACC載脂蛋白上。 ACC是一種具有三重功能的酶，其具有生物素羧基運載蛋白（BCCP)結構域、生物素-羧化酶 (BC)結構域和羧基轉移酶（CT)結構域。在多數(shù)細菌中，這些結構域是作為單獨的多肽表 達，并組裝成異聚體復合物。相反，包括線粒體ACC變體（酵母中的Hfal)在內(nèi)的真核ACC 是在單多肽上具有上述這些功能。由ACC產(chǎn)生的丙二酰-CoA在由脂肪酸合成酶、FAS和延 伸酶催化的循環(huán)系列反應中作為兩個碳原子的供體發(fā)揮作用。
[0058] 從頭開始的脂肪酸合成的直接產(chǎn)物是飽和脂肪酸。已知在包括酵母在內(nèi)的真核細 胞中，飽和脂肪酸是不飽和脂肪酸的前體。通常不飽和脂肪酸是通過由特殊的酶類（稱為 去飽和酶）對飽和脂肪酸中的C-C單鍵進行去飽和作用而產(chǎn)生的。對掌控飽和脂肪酸向不 飽和脂肪酸的轉化的控制機制還沒有得到深入了解。在真核細胞中，不飽和脂肪酸在膜的 流動性、細胞活性、代謝和控制基因轉錄的細胞核事件的調(diào)控中起重要作用。通常，酵母脂 肪酸的大約80%為單不飽和脂肪酸，這意味著它們在其脂肪鏈上含有一個不飽和鍵。
[0059] 脂肪酸是脂肪酸合成的有效抑制劑，脂肪酸對脂肪酸合成的反饋抑制是對微生物 進行工程改造用于油生產(chǎn)的主要障礙。本公開的一些方面是基于這樣的認識，即盡管脂質 合成的推修飾通常不能蓋過脂肪酸介導的脂質合成的反饋抑制，然而推修飾（例如ACC1過 表達）與拉修飾（例如DGA1過表達）的組合能有效地繞過反饋抑制，由此全面實現(xiàn)脂質合 成途徑的碳流增加，例如在細胞的脂質小體或液泡中儲存的TGA。
[0060] 本公開的一些方面提供了工程改造微生物用于油生產(chǎn)的策略。在一些實施方式 中，這些策略采用了對產(chǎn)油微生物如解脂酵母進行遺傳工程改造，以同時擴增脂質合成的 推和拉步驟。如本文所公開的，使用這些策略使得產(chǎn)油酵母宿主細胞中的脂質生產(chǎn)得到顯 著增加。
[0061] 本公開的一些方面基于這樣的認識，即推-和-拉修飾如同時擴增生產(chǎn)脂質合成 途徑的代謝物生產(chǎn)的代謝步驟及隔離脂質合成的合成產(chǎn)物介導的反饋抑制的代謝步驟，導 致進入脂質合成途徑的碳流比只有推或只有拉修飾的工程改造情況得到顯著增加。本發(fā)明 的一些方面涉及一項驚人的發(fā)現(xiàn)，即DGA1基因產(chǎn)物在產(chǎn)油微生物如解脂耶氏酵母中的過 表達導致向脂質合成途徑中碳流的極大增加，同時過表達ACC1基因產(chǎn)物與DGA1過表達產(chǎn) 生協(xié)同作用，導致推-和-拉修飾的微生物具有碳流特性極大地增強，這一點適合于由多種 碳底物進行工業(yè)規(guī)模的油生產(chǎn)。
[0062] 對微生物中的代謝物生成步驟（如丙二酰-CoA的產(chǎn)生）以及產(chǎn)物隔離代謝步驟 (如二?；视王；蔀槿；视停┻M行平衡的調(diào)控會使得進入脂質合成的凈碳流 有顯著增加，這一發(fā)現(xiàn)對在工程改造的細胞的幫助下以可再生碳源轉化為生物燃料或生物 燃料前體為目標的過程具有重要意義?；诒景l(fā)明的一些方面，現(xiàn)在對微生物如產(chǎn)油酵母 (如解脂耶氏酵母）的脂質合成代謝進行修飾是可以的，以這樣的方式進行：賦予高度希 望的表型以進行工業(yè)規(guī)模的碳水化合物向生物燃料或生物燃料前體的轉化，例如脂肪酸合 成、TAG合成，以及脂質小體或液泡中脂肪酸和TAG儲存的極大增加。
[0063] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，在根據(jù)本文提供的方法微生物中修飾脂質代謝使得能夠 生成優(yōu)化的用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)過程的微生物，所述方法為例如同時過表達 介導代謝物生成（推）步驟的基因產(chǎn)物以及介導產(chǎn)物隔離（拉）步驟的基因產(chǎn)物。本發(fā)明 的一些方面提供了用于工程改造微生物中脂肪酸代謝的策略和方法，使得微生物中脂肪酸 及脂肪酸衍生物的合成速率及累積得到增加，這是通過同時擴增脂質生物合成的推步驟和 拉步驟而進行的。
[0064] 本發(fā)明的一些方面提供了方法，其包括遺傳修飾，使得調(diào)控用于生物燃料或生物 燃料前體生產(chǎn)的微生物的脂質代謝的基因產(chǎn)物表達和/或活性得到調(diào)制。根據(jù)本發(fā)明的一 些方面，這些遺傳修飾的目標是增加碳水化合物向脂肪酸和/或TAG的轉化，以優(yōu)化所修飾 的微生物用于由碳源（例如碳水化合物）的大規(guī)模生產(chǎn)脂質。根據(jù)本發(fā)明的一些方面所提 供的一些修飾，如對特定基因產(chǎn)物的過表達、敲除、敲低、激活和/或抑制可單獨發(fā)揮作用 或與本領域技術人員已知的其他修飾組合而發(fā)揮作用。術語"修飾"指的是遺傳操縱，例如 對特定基因產(chǎn)物的過表達、敲除、敲低、激活和/或抑制；以及非遺傳操縱，例如對生長培養(yǎng) 基、底物、底物預處理、pH、溫度、轉化過程等等的操縱。
[0065] 基因表達的修飾-在本文也稱作對基因表達的調(diào)制-可以是對天然的表 達調(diào)節(jié)的破壞或抑制，對給定基因的過表達、表達的抑制或完全消除。將異源啟動子插 入原生基因序列，如原生DGA1或ACC1基因序列的上游，或在啟動子內(nèi)部刪除調(diào)控序 列，如介導飽和脂肪酸對DGA1或ACC1基因的反饋抑制的調(diào)控序列，這些都是對表達的 天然調(diào)控的破壞或抑制的實例。用于調(diào)制基因表達的策略可包括遺傳改變，例如通過 重組技術如基因靶向或病毒轉導進行；或非遺傳改變，例如對已知會導致基因表達上 調(diào)或下調(diào)的環(huán)境進行改變；或調(diào)制子的瞬時遞送，例如將藥物或小RNA分子遞送至靶 標細胞。用于對微生物進行遺傳和非遺傳改變的方法對本領域技術人員已知，在例如 以下著作中有所描述：J. Sambrook 和 D. Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd edition(January15, 2001)； David C.Amberg, Daniel J.Burke ；和 Jeffrey N.Strathern, Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April2005) ；John N.Abelson, Melvin I.Simon,Christine Guthrie,和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volumel94(Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press(Marchll, 2004)； Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume350(Methods in Enzymology, V〇1350), Academic Press ； 1st edition(July2, 2002) ；Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C,Volume351, Academic Press ； 1st edition (July9,2002) ；Gregory N. Stephanopoulos,Aristos A. Aristidou 和 Jens Nielsen, Metabolic Engineering:Principles and Methodologies, Academic Press ；ledition(0ctoberl6, 1998)；以及 Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Handbook:Fundamentals,CRC Press ;ledition(July28, 2009)，其以全部并 入本文作為參考。宿主細胞包括細菌、酵母、藻類、昆蟲、哺乳動物和植物細胞。
[0066] 如本文所使用的，術語"過表達"指的是給定基因產(chǎn)物在給定細胞、細胞類型或細 胞狀態(tài)中表達水平相比于參考細胞得到增加，所述參考細胞為例如相同細胞類型的野生型 細胞或相同細胞類型但缺乏特定修飾（例如遺傳修飾）的細胞。解脂耶氏酵母細胞中DGA1 和/或ACC1基因的驅動的持續(xù)表達顯示濃度飽和脂肪酸，這樣的濃度會在野生型細胞中抑 制DGA1或ACC1基因表達，這是基因過表達的一個實例。
[0067] 本發(fā)明一些方面提供了用于操縱微生物中二?；视王；D移酶1(DGA1)基因 產(chǎn)物的活性用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的方法。DGA1基因編碼?；D移酶，其催化 三?；视停═AG)形成的最后一步，使用?；?CoA作為?；w對二?；视瓦M行?；?作用。此?；D移酶反應的結果是產(chǎn)生了三酰基甘油，其不會顯示像脂肪酸本身那樣的對 脂肪酸合成的抑制反饋效應。TAG通常儲存在產(chǎn)脂細胞的脂質小體或液泡中。在一些實施 方式中，所述的操縱為過表達。在一些實施方式中，所述操縱是通過將用于生物燃料或生物 燃料前體生產(chǎn)的微生物與包含編碼DGA1基因產(chǎn)物（例如DGAT2蛋白質）并可操作地連接于 異源啟動子如組成型或誘導型啟動子的核酸的表達構建體接觸而產(chǎn)生效應的。在一些實施 方式中，編碼DGA1基因產(chǎn)物的核酸包含SEQ ID NO: 1的編碼序列。在一些實施方式中，所述 DGA1為解脂耶氏酵母DGA1，例如包含SEQ ID勵:2的氨基酸序列的解脂耶氏酵母06八1。在 一些實施方式中，所述微生物為解脂耶氏酵母。在一些實施方式中，對微生物中DGA1基因 產(chǎn)物活性的操縱能夠賦予其有益的表型以將碳水化合物大規(guī)模地轉化為脂質，所述表型為 例如增加的脂肪合成速率、增加的碳水化合物至脂質的轉化效率、增加的脂質儲存和、增加 的生長速率、對碳源或脂質產(chǎn)物濃度升高的耐受性增加。DGA1基因及基因產(chǎn)物序列對于本 領域技術人員是已知的。示例性地，代表基因和基因產(chǎn)物序列可在NCBI數(shù)據(jù)庫（www.ncbi. nlm. nih. gov)中以索引號 XM_504700 找到。
[0068] DGA1核酸及蛋白質序列的合適序列的非限制性實例在下文提供。其他的合適的 DGA1序列，包括來自其他物種的序列對本領域技術人員是清楚的，本發(fā)明在此方面并不受 到限制。
[0069] >gi | 5〇554582 | ref | ΧΜ_5〇47〇0· 11 解脂耶氏酵母 YALI0E32769p (YALI0E32769g) mRNA,完全 cds
[0070] ATGACTATCGACTCACAATACTACAAGTCGCGAGACAAAAACGACACGGCACCCAAAATCGCGGGAATC CGATATGCCCCGCTATCGACACCATTACTCAACCGATGTGAGACCTTCTCTCTGGTCTGGCACATTTTCAGCATTCC CACTTTCCTCACAATTTTCATGCTATGCTGCGCAATTCCACTGCTCTGGCCATTTGTGATTGCGTATGTAGTGTACG CTGTTAAAGACGACTCCCCGTCCAACGGAGGAGTGGTCAAGCGATACTCGCCTATTTCAAGAAACTTCTTCATCTGG AAGCTCTTTGGCCGCTACTTCCCCATAACTCTGCACAAGACGGTGGATCTGGAGCCCACGCACACATACTACCCTCT GGACGTCCAGGAGTATCACCTGATTGCTGAGAGATACTGGCCGCAGAACAAGTACCTCCGAGCAATCATCTCCACCA TCGAGTACTTTCTGCCCGCCTTCATGAAACGGTCTCTTTCTATCAACGAGCAGGAGCAGCCTGCCGAGCGAGATCCT CTCCTGTCTCCCGTTTCTCCCAGCTCTCCGGGTTCTCAACCTGACAAGTGGATTAACCACGACAGCAGATATAGCCG TGGAGAATCATCTGGCTCCAACGGCCACGCCTCGGGCTCCGAACTTAACGGCAACGGCAACAATGGCACCACTAACC GACGACCTTTGTCGTCCGCCTCTGCTGGCTCCACTGCATCTGATTCCACGCTTCTTAACGGGTCCCTCAACTCCTAC GCCAACCAGATCATTGGCGAAAACGACCCACAGCTGTCGCCCACAAAACTCAAGCCCACTGGCAGAAAATACATCTT CGGCTACCACCCCCACGGCATTATCGGCATGGGAGCCTTTGGTGGAATTGCCACCGAGGGAGCTGGATGGTCCAAGC TCTTTCCGGGCATCCCTGTTTCTCTTATGACTCTCACCAACAACTTCCGAGTGCCTCTCTACAGAGAGTACCTCATG AGTCTGGGAGTCGCTTCTGTCTCCAAGAAGTCCTGCAAGGCCCTCCTCAAGCGAAACCAGTCTATCTGCATTGTCGT TGGTGGAGCACAGGAAAGTCTTCTGGCCAGACCCGGTGTCATGGACCTGGTGCTACTCAAGCGAAAGGGTTTTGTTC GACTTGGTATGGAGGTCGGAAATGTCGCCCTTGTTCCCATCATGGCCTTTGGTGAGAACGACCTCTATGACCAGGTT AGCAACGACAAGTCGTCCAAGCTGTACCGATTCCAGCAGTTTGTCAAGAACTTCCTTGGATTCACCCTTCCTTTGAT GCATGCCCGAGGCGTCTTCAACTACGATGTCGGTCTTGTCCCCTACAGGCGACCCGTCAACATTGTGGTTGGTTCCC CCATTGACTTGCCTTATCTCCCACACCCCACCGACGAAGAAGTGTCCGAATACCACGACCGATACATCGCCGAGCTG CAGCGAATCTACAACGAGCACAAGGATGAATATTTCATCGATTGGACCGAGGAGGGCAAAGGAGCCCCAGAGTTCCG AATGATTGAGTAA(SEQ ID N0:1)
[0071] >gi I 5〇554583 I ref I XP_5〇47〇0. 11YALI0E32769P [解脂耶氏酵母]
[0072] MTIDSQYYKSRDKNDTAPKIAGIRYAPLSTPLLNRCETFSLVWHIFSIPTFLTIFMLCCAIPLLWPFVI AYVVYAVKDDSPSNGGVVKRYSPISRNFFIWKLFGRYFPITLHKTVDLEPTHTYYPLDVQEYHLIAERYWPQNKYLR AIISTIEYFLPAFMKRSLSINEQEQPAERDPLLSPVSPSSPGSQPDKWINHDSRYSRGESSGSNGHASGSELNGNGN NGTTNRRPLSSASAGSTASDSTLLNGSLNSYANQIIGENDPQLSPTKLKPTGRKYIFGYHPHGIIGMGAFGGIATEG AGWSKLFPGIPVSLMTLTNNFRVPLYREYLMSLGVASVSKKSCKALLKRNQSICIVVGGAQESLLARPGVMDLVLLK RKGFVRLGMEVGNVALVPIMAFGENDLYDQVSNDKSSKLYRFQQFVKNFLGFTLPLMHARGVFNYDVGLVPYRRPVN IVVGSPIDLPYLPHPTDEEVSEYHDRYIAELQRIYNEHKDEYFIDWTEEGKGAPEFRMIE(SEQ ID NO:2)
[0073] 本發(fā)明的一些方面提供了用于在用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的微生物如 解脂耶氏酵母中操縱乙酰-CoA羧化酶（ACC)基因產(chǎn)物的方法。ACC基因產(chǎn)物介導了乙 酰-CoA向丙二酰-CoA的轉化，其中前者為脂肪酸合成中主要的C2-前體，此步驟被認為是 脂肪酸合成中第一個關鍵步驟，因此被認為也是脂肪酸合成中的限速步驟（見Cao Y，Yang J,Xian M,Xu X,Liu W. Increasing unsaturated fatty acid contents in Escherichia coli by coexpression of three different genes. Appl Microbiol Biotechnol. 2010)〇 在一些實施方式中，ACC活性操縱是將ACC進行過表達。在一些實施方式中，所述操縱是通 過將用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的微生物與包含編碼ACC基因產(chǎn)物（例如ACC1蛋 白）的核酸的表達構建體接觸而實現(xiàn)，所述核酸可操作地連接于異源啟動子如組成型或誘 導型啟動子。在一些實施方式中，編碼ACC基因產(chǎn)物的核酸包含SEQ ID N0:3的編碼序列。 在一些實施方式中，ACC基因產(chǎn)物是包含SEQ ID N0:4氨基酸序列的ACC1蛋白質。在一些 實施方式中，微生物中ACC的過表達增加了脂肪酸合成速率及/或賦予微生物有益的表型， 用于將碳水化合物大規(guī)模轉化為生物燃料或生物燃料前體，例如增加的脂質合成速率、增 加的碳水化合物向脂質轉化效率、增加的脂質儲存以及增加的生長速率、增加的對特定物 質如碳源、生物燃料或生物燃料前體的濃度的耐受性。ACC基因及基因產(chǎn)物序列對本領域技 術人員是已知的。示例性地，代表基因和基因產(chǎn)物序列可在NCBI數(shù)據(jù)庫（www. ncbi.nlm. nih. gov)中在登記號GenelD:855750和2909424的條目下，或以索引號NC_006069找到。
[0074] 合適的ACC核酸序列和蛋白質序列的非限制性實例在下文提供。其他的合適的 ACC序列，包括來自其他物種的序列對本領域技術人員是清楚的，本發(fā)明在此方面并不受到 限制。
[0075] ACC編碼核酸序列：
[0076] atgcgactgcaattgaggacactaacacgtcggtttttcaggtgagtaaacgacggtggccgtggc ca cgacagccgaggcgtcacgatgggccagacgagcacattctcgccgccacaacctcgccagca caagaaactaacc cagtatggcttcaggatcttcaacgccagatgtggctcccttggtggacccca acattcacaaaggtctcgcctct catttctttggactcaattctgtccacacagccaagccctcaaaa gtcaaggagtttgtggcttctcacggaggtc atacagttatcaacaaggtgagtatttgacgtttaga ctgtataacaggcggccgcagtgcaacaacgaccaaaaa gggtcgaaaaagggtcgaaaacgg acacaaaagctggaaaacaagagtgtaatacattcttacacgtccaattgtt agacaaacacggct gttcggtcccaaaaccaccagtatcacctattttccacttgtgtctcggatctgatcataat ctgatct caagatgaaatttacgccaccgacatgatattgtgattttcggattctccagaccgagcagattcca g caataccaccacttgcccaccttcagcggcctctcggcgcgattcgccactttccccaacgagtgtt actaaccca ggtcctcatcgctaacaacggtattgccgcagtaaaggagatccgttcagtacgaaa atgggcctacgagaccttt ggcgacgagcgagcaatctcgttcaccgtcatggccacccccgaaga tctcgctgccaacgccgactacattagaa tggccgatcagtacgtcgaggtgcccggaggaaccaa caacaacaactacgccaacgtcgagctgattgtcgacgt ggctgagcgattcggcgtcgatgccgt gtgggccggatggggccatgccagtgaaaatcccctgctccccgagtcg ctagcggcctctccccg caagattgtcttcatcggccctcccggagctgccatgagatctctgggagacaaaattt cttctacca ttgtggcccagcacgcaaaggtcccgtgtatcccgtggtctggaaccggagtggacgaggttgtgg ttgacaagagcaccaacctcgtgtccgtgtccgaggaggtgtacaccaagggctgcaccaccggtc ccaagcaggg tctggagaaggctaagcagattggattccccgtgatgatcaaggcttccgaggga ggaggaggaaagggtattcga aaggttgagcgagaggaggacttcgaggctgcttaccaccagg tcgagggagagatccccggctcgcccatcttca ttatgcagcttgcaggcaatgcccggcatttgga ggtgcagcttctggctgatcagtacggcaacaatatttcact gtttggtcgagattgttcggttcagc gacggcatcaaaagattattgaggaggctcctgtgactgtggctggccag cagaccttcactgcca tggagaaggctgccgtgcgactcggtaagcttgtcggatatgtctctgcaggtaccgttg aatatct gtattcccatgaggacgacaagttctacttcttggagctgaatcctcgtcttcaggtcgaacatccta ccaccgagatggtcaccggtgtcaacctgcccgctgcccagcttcagatcgccatgggtatccccct cgatcgaat caaggacattcgtctcttttacggtgttaaccctcacaccaccactccaattgatttcga cttctcgggcgaggat gctgataagacacagcgacgtcccgtcccccgaggtcacaccactgcttg ccgaatcacatccgaggaccctggag agggtttcaagccctccggaggtactatgcacgagctcaa cttccgatcctcgtccaacgtgtggggttacttctc cgttggtaaccagggaggtatccattcgttctc ggattcgcagtttggtcacatcttcgccttcggtgagaaccga agtgcgtctcgaaagcacatggtt gttgctttgaaggaactatctattcgaggtgacttccgaaccaccgtcgagt acctcatcaagctgct ggagacaccggacttcgaggacaacaccatcaccaccggctggctggatgagcttatctc caaca agctgactgccgagcgacccgactcgttcctcgctgttgtttgtggtgctgctaccaaggcccatcga gc ttccgaggactctattgccacctacatggcttcgctagagaagggccaggtccctgctcgagaca ttctcaagacc cttttccccgttgacttcatctacgagggccagcggtacaagttcaccgccacccgg tcgtctgaggactcttaca cgctgttcatcaacggttctcgatgcgacattggagttagacctctttct gacggtggtattctgtgtcttgtagg tgggagatcccacaatgtctactggaaggaggaggttggag ccacgcgactgtctgttgactccaagacctgcctt ctcgaggtggagaacgaccccactcagetteg atctccctctcccggtaagctggttaagttcctggtcgagaacg gcgaccacgtgcgagccaacca gccctatgccgagattgaggtcatgaagatgtacatgactctcactgctcagga ggacggtattgtc cagctgatgaagcagcccggttccaccatcgaggctggcgacatcctcggtatcttggccctt gatg atccttccaaggtcaagcatgccaagccctttgagggccagcttcccgagcttggaccccccactct cage ggtaacaagcctcatcagcgatacgagcactgccagaacgtgctccataacattctgcttgg tttcgataaccagg tggtgatgaagtccactcttcaggagatggttggtctgctccgaaaccctgag cttccttatctccagtgggctca tcaggtgtcttctctgcacacccgaatgagcgccaagctggatgc tactcttgctggtctcattgacaaggccaag cagcgaggtggcgagtttcctgccaagcagcttctg cgagcccttgagaaggaggcgagctctggcgaggtcgatg cgctcttccagcaaactcttgctcctc tgtttgaccttgctcgagagtaccaggacggtcttgctatccacgagct tcaggttgctgcaggcctt ctgcaggcctactacgactctgaggcccggttctgcggacccaacgtacgtgacgag gatgtcattc tcaagcttcgagaggagaaccgagattctcttcgaaaggttgtgatggcccagctgtctcattctc g agtcggagccaagaacaaccttgtgctggcccttctcgatgaatacaaggtggccgaccaggctgg caccgact ctcctgcctccaacgtgcacgttgcaaagtacttgcgacctgtgctgcgaaagattgtg gagctggaatctcgagc ttctgccaaggtatctctgaaagcccgagagattctcatccagtgcgctc tgccctctctaaaggagcgaactgac cagcttgagcacattctgcgatcttctgtcgtcgagtctcga tacggagaggttggtctggagcaccgaactcccc gagccgatattctcaaggaggttgtcgactcc aagtacattgtctttgatgtgcttgcccagttctttgcccacga tgatccctggatcgtccttgctgccc tggagctgtacatccgacgagcttgcaaggcctactccatcctggacatc aactaccaccaggact cggacctgcctcccgtcatctcgtggcgatttagactgcctaccatgtcgtctgctttgt acaactcag tagtgtcttctggctccaaaacccccacttccccctcggtgtctcgagctgattccgtctccgactt ttc gtacaccgttgagcgagactctgctcccgctcgaaccggagcgattgttgccgtgcctcatctggat gatct ggaggatgctctgactcgtgttctggagaacctgcccaaacggggcgctggtcttgccatct ctgttggtgctagc aacaagagtgccgctgcttctgctcgtgacgctgctgctgctgccgcttcatcc gttgacactggcctgtccaaca tttgcaacgttatgattggtcgggttgatgagtctgatgacgacga cactctgattgcccgaatctcccaggtcat tgaggactttaaggaggactttgaggcctgttctctgc gacgaatcaccttctccttcggcaactcccgaggtact tatcccaagtatttcacgttccgaggcccc gcatacgaggaggaccccactatccgacacattgagcctgctctgg ccttccagctggagctcgcc cgtctgtccaacttcgacatcaagcctgtccacaccgacaaccgaaacatccacgt gtacgaggct actggcaagaacgctgcttccgacaagcggttcttcacccgaggtatcgtacgacctggtcgtctt c gagagaacatccccacctcggagtatctcatttccgaggctgaccggctcatgagcgatattttgga cgctcta gaggtgattggaaccaccaactcggatctcaaccacattttcatcaacttctcagccgtct ttgctctgaagcccg aggaggttgaagctgcctttggcggtttcctggagcgatttggccgacgtctg tggcgacttcgagtcaccggtgc cgagatccgaatgatggtatccgaccccgaaactggctctgctt tccctctgcgagcaatgatcaacaacgtctct ggttacgttgtgcagtctgagctgtacgctgaggcc aagaacgacaagggccagtggattttcaagtctctgggca agcccggctccatgcacatgcggtct atcaacactccctaccccaccaaggagtggctgcagcccaagcggtacaa ggcccatctgatgggt accacctactgctatgacttccccgagctgttccgacagtccattgagtcggactggaag aagtatg acggcaaggctcccgacgatctcatgacttgcaacgagctgattctcgatgaggactctggcgagc tg caggaggtgaaccgagagcccggcgccaacaacgtcggtatggttgcgtggaagtttgaggcc aagacccccgagt accctcgaggccgatctttcatcgtggtggccaacgatatcaccttccagattg gttcgtttggccctgctgagga ccagttcttcttcaaggtgacggagctggctcgaaagctcggtatt cctcgaatctatctgtctgccaactctggt gctcgaatcggcattgctgacgagctcgttggcaagta caaggttgcgtggaacgacgagactgacccctccaagg gcttcaagtacctttacttcacccctgag tctcttgccaccctcaagcccgacactgttgtcaccactgagattga ggaggagggtcccaacggc gtggagaagcgtcatgtgatcgactacattgtcggagagaaggacggtctcggagtc gagtgtctg cggggctctggtctcattgcaggcgccacttctcgagcctacaaggatatcttcactctcactcttg tc acctgtcgatccgttggtatcggtgcttaccttgttcgtcttggtcaacgagccatccagattgagggc cage ccatcattctcactggtgcccccgccatcaacaagctgcttggtcgagaggtctactcttccaa ettgeagettgg tggtactcagatcatgtacaacaacggtgtgtctcatctgactgcccgagatgate tcaacggtgtccacaagatc atgcagtggctgtcatacatccctgcttctcgaggtcttccagtgcct gttctccctcacaagaccgatgtgtggg atcgagacgtgacgttccagcctgtccgaggcgagcag tacgatgttagatggcttatttctggccgaactctcga ggatggtgctttcgagtctggtctctttgac aaggactctttccaggagactctgtctggctgggccaagggtgtt gttgttggtcgagctcgtcttgg cggcattcccttcggtgtcattggtgtcgagactgcgaccgtcgacaatacta cccctgccgatcccg ccaacccggactctattgagatgagcacctctgaagccggccaggtttggtaccccaactc ggcctt caagacctctcaggccatcaacgacttcaaccatggtgaggcgcttcctctcatgattcttgctaact g gcgaggcttttctggtggtcagcgagacatgtacaatgaggttctcaagtacggatctttcattgtt gatgctctg gttgactacaagcagcccatcatggtgtacatccctcccaccggtgagetgcgaggtg gttcttgggttgtggttg accccaccatcaactcggacatgatggagatgtacgctgacgtcgagtct cgaggtggtgtgctggagcccgaggg aatggtcggtatcaagtaccgacgagacaagctactgga caccatggctcgtctggatcccgagtactcctctctc aagaagcagcttgaggagtctcccgattctg aggagctcaaggtcaagctcagcgtgcgagagaagtctctcatgc ccatctaccagcagatctccg tgcagtttgccgacttgcatgaccgagctggccgaatggaggccaagggtgtcat tegtgaggetet tgtgtggaaggatgctcgtcgattcttcttctggcgaatccgacgacgattagtcgaggagtac ctca ttaccaagatcaatagcattctgccctcttgcactcggcttgagtgtctggctcgaatcaagtcgtgg aag cctgccactcttgatcagggctctgaccggggtgttgccgagtggtttgacgagaactctgatg ccgtctctgctc gactcagcgagctcaagaaggacgcttctgcccagtcgtttgcttctcaactgaga aaggaccgacagggtactct ccagggcatgaagcaggctctcgcttctctttctgaggctgagcgg getgagetgctcaaggggttgtga (SEQ ID NO :3)
[0077] >gi |5〇5485〇3|ref|XP_5〇l 72l. 1 |YALIOCll4〇7p [解脂耶氏酵母]
[0078] MRLQLRTLTRRFFSMASGSSTPDVAPLVDPNIHKGLASHFFGLNSVHTAKPSKVKEFVASHGGHTVINK VLIANNGIAAVKEIRSVRKWAYETFGDERAISFTVMATPEDLAANADYIRMADQYVEVPGGTNNNNYANVELIVDVA ERFGVDAVWAGWGHASENPLLPESLAASPRKIVFIGPPGAAMRSLGDKISSTIVAQHAKVPCIPWSGTGVDEVVVDK STNLVSVSEEVYTKGCTTGPKQGLEKAKQIGFPVMIKASEGGGGKGIRKVEREEDFEAAYHQVEGEIPGSPIFIMQL AGNARHLEVQLLADQYGNNISLFGRDCSVQRRHQKIIEEAPVTVAGQQTFTAMEKAAVRLGKLVGYVSAGTVEYLYS HEDDKFYFLELNPRLQVEHPTTEMVTGVNLPAAQLQIAMGIPLDRIKDIRLFYGVNPHTTTPIDFDFSGEDADKTQR RPVPRGHTTACRITSEDPGEGFKPSGGTMHELNFRSSSNVWGYFSVGNQGGIHSFSDSQFGHIFAFGENRSASRKHM VVALKELSIRGDFRTTVEYLIKLLETPDFEDNTITTGWLDELISNKLTAERPDSFLAVVCGAATKAHRASEDSIATY MASLEKGQVPARDILKTLFPVDFIYEGQRYKFTATRSSEDSYTLFINGSRCDIGVRPLSDGGILCLVGGRSHNVYWK EEVGATRLSVDSKTCLLEVENDPTQLRSPSPGKLVKFLVENGDHVRANQPYAEIEVMKMYMTLTAQEDGIVQLMKQP GSTIEAGDILGILALDDPSKVKHAKPFEGQLPELGPPTLSGNKPHQRYEHCQNVLHNILLGFDNQVVMKSTLQEMVG LLRNPELPYLQWAHQVSSLHTRMSAKLDATLAGLIDKAKQRGGEFPAKQLLRALEKEASSGEVDALFQQTLAPLFDL AREYQDGLAIHELQVAAGLLQAYYDSEARFCGPNVRDEDVILKLREENRDSLRKVVMAQLSHSRVGAKNNLVLALLD EYKVADQAGTDSPASNVHVAKYLRPVLRKIVELESRASAKVSLKAREILIQCALPSLKERTDQLEHILRSSVVESRY GEVGLEHRTPRADILKEVVDSKYIVFDVLAQFFAHDDPWIVLAALELYIRRACKAYSILDINYHQDSDLPPVISWRF RLPTMSSALYNSVVSSGSKTPTSPSVSRADSVSDFSYTVERDSAPARTGAIVAVPHLDDLEDALTRVLENLPKRGAG LAISVGASNKSAAASARDAAAAAASSVDTGLSNICNVMIGRVDESDDDDTLIARISQVIEDFKEDFEACSLRRITFS FGNSRGTYPKYFTFRGPAYEEDPTIRHIEPALAFQLELARLSNFDIKPVHTDNRNIHVYEATGKNAASDKRFFTRGI VRPGRLRENIPTSEYLISEADRLMSDILDALEVIGTTNSDLNHIFINFSAVFALKPEEVEAAFGGFLERFGRRLWRL RVTGAEIRMMVSDPETGSAFPLRAMINNVSGYVVQSELYAEAKNDKGQWIFKSLGKPGSMHMRSINTPYPTKEWLQP KRYKAHLMGTTYCYDFPELFRQSIESDWKKYDGKAPDDLMTCNELILDEDSGELQEVNREPGANNVGMVAWKFEAKT PEYPRGRSFIVVANDITFQIGSFGPAEDQFFFKVTELARKLGIPRIYLSANSGARIGIADELVGKYKVAWNDETDPS KGFKYLYFTPESLATLKPDTVVTTEIEEEGPNGVEKRHVIDYIVGEKDGLGVECLRGSGLIAGATSRAYKDIFTLTL VTCRSVGIGAYLVRLGQRAIQIEGQPIILTGAPAINKLLGREVYSSNLQLGGTQIMYNNGVSHLTARDDLNGVHKIM QffLSYIPASRGLPVPVLPHKTDVWDRDVTFQPVRGEQYDVRWLISGRTLEDGAFESGLFDKDSFQETLSGWAKGVVV GRARLGGIPFGVIGVETATVDNTTPADPANPDSIEMSTSEAGQVWYPNSAFKTSQAINDFNHGEALPLMILANWRGF SGGQRDMYNEVLKYGSFIVDALVDYKQPIMVYIPPTGELRGGSWVVVDPTINSDMMEMYADVESRGGVLEPEGMVGI KYRRDKLLDTMARLDPEYSSLKKQLEESPDSEELKVKLSVREKSLMPIYQQISVQFADLHDRAGRMEAKGVIREALV WKDARRFFFWRIRRRLVEEYLITKINSILPSCTRLECLARIKSWKPATLDQGSDRGVAEffFDENSDAVSARLSELKK DASAQSFASQLRKDRQGTLQGMKQALASLSEAERAELLKGL(SEQ ID NO:4).
[0079] 本發(fā)明的一些方面提供了用于在用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的微生物中 操縱硬脂酰-CoA-去飽和酶（S⑶）活性的方法。S⑶是一種Λ 9去飽和酶，其能夠在偶聯(lián) 于CoA的硬脂酸的C9和C10之間插入雙鍵，這是生成去飽和脂肪酸及其衍生物的一個關鍵 步驟，這在本文其他地方有更詳盡的描述。在一些實施方式中，所述操縱是進行過表達。在 一些實施方式中，所述操縱是通過將用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的微生物與包含編 碼SCD基因產(chǎn)物（例如SCD蛋白）的核酸的表達構建體接觸而實現(xiàn)，所述核酸可操作地連 接于異源啟動子如組成型或誘導型啟動子。在一些實施方式中，編碼SCD基因產(chǎn)物的核酸 包含SEQ ID N0:5的編碼序列。在一些實施方式中，S⑶基因產(chǎn)物是解脂耶氏酵母的S⑶， 例如包含SEQ ID N0:6氨基酸序列的解脂耶氏酵母SCD。在一些實施方式中，所述微生物為 解脂耶氏酵母在一些實施方式中，微生物中對SCD活性的操縱賦予微生物有益的表型，用 于將碳水化合物大規(guī)模轉化為生物燃料或生物燃料前體，例如增加的脂質合成速率、增加 的碳水化合物向脂質轉化效率、增加的脂質儲存以及增加的生長速率、增加的對碳源或脂 質產(chǎn)物濃度升高的耐受性。硬脂酰-CoA去飽和酶基因及基因產(chǎn)物序列對本領域技術人員 是已知的。示例性地，代表基因和基因產(chǎn)物序列可在NCBI數(shù)據(jù)庫（www. ncbi. nlm. nih. gov) 中在登記號GenelD :852825的條目下找到。
[0080] 合適的SCD核酸序列和蛋白質序列的非限制性實例在下文提供。其他的合適的 SCD序列，包括來自其他物種的序列對本領域技術人員是清楚的，本發(fā)明在此方面并不受到 限制。
[0081] >gi |5〇548〇52|ref|XM_5〇l 496· 11 解脂耶氏酵母 YALIOC〇595lp(YALIOC〇595lg) mRNA,完整 cds
[0082] ATGGTGAAAAACGTGGACCAAGTGGATCTCTCGCAGGTCGACACCATTGCCTCCGGCCGAGATGTCAAC TACAAGGTCAAGTACACCTCCGGCGTTAAGATGAGCCAGGGCGCCTACGACGACAAGGGCCGCCACATTTCCGAGCA GCCCTTCACCTGGGCCAACTGGCACCAGCACATCAACTGGCTCAACTTCATTCTGGTGATTGCGCTGCCTCTGTCGT CCTTTGCTGCCGCTCCCTTCGTCTCCTTCAACTGGAAGACCGCCGCGTTTGCTGTCGGCTATTACATGTGCACCGGT CTCGGTATCACCGCCGGCTACCACCGAATGTGGGCCCATCGAGCCTACAAGGCCGCTCTGCCCGTTCGAATCATCCT TGCTCTGTTTGGAGGAGGAGCTGTCGAGGGCTCCATCCGATGGTGGGCCTCGTCTCACCGAGTCCACCACCGATGGA CCGACTCCAACAAGGACCCTTACGACGCCCGAAAGGGATTCTGGTTCTCCCACTTTGGCTGGATGCTGCTTGTGCCC AACCCCAAGAACAAGGGCCGAACTGACATTTCTGACCTCAACAACGACTGGGTTGTCCGACTCCAGCACAAGTACTA CGTTTACGTTCTCGTCTTCATGGCCATTGTTCTGCCCACCCTCGTCTGTGGCTTTGGCTGGGGCGACTGGAAGGGAG GTCTTGTCTACGCCGGTATCATGCGATACACCTTTGTGCAGCAGGTGACTTTCTGTGTCAACTCCCTTGCCCACTGG ATTGGAGAGCAGCCCTTCGACGACCGACGAACTCCCCGAGACCACGCTCTTACCGCCCTGGTCACCTTTGGAGAGGG CTACCACAACTTCCACCACGAGTTCCCCTCGGACTACCGAAACGCCCTCATCTGGTACCAGTACGACCCCACCAAGT GGCTCATCTGGACCCTCAAGCAGGTTGGTCTCGCCTGGGACCTCCAGACCTTCTCCCAGAACGCCATCGAGCAGGGT CTCGTGCAGCAGCGACAGAAGAAGCTGGACAAGTGGCGAAACAACCTCAACTGGGGTATCCCCATTGAGCAGCTGCC TGTCATTGAGTTTGAGGAGTTCCAAGAGCAGGCCAAGACCCGAGATCTGGTTCTCATTTCTGGCATTGTCCACGACG TGTCTGCCTTTGTCGAGCACCACCCTGGTGGAAAGGCCCTCATTATGAGCGCCGTCGGCAAGGACGGTACCGCTGTC TTCAACGGAGGTGTCTACCGACACTCCAACGCTGGCCACAACCTGCTTGCCACCATGCGAGTTTCGGTCATTCGAG GCGGCATGGAGGTTGAGGTGTGGAAGACTGCCCAGAACGAAAAGAAGGACCAGAACATTGTCTCCGATGAGAGTGGA AACCGAATCCACCGAGCTGGTCTCCAGGCCACCCGGGTCGAGAACCCCGGTATGTCTGGCATGGCTGCTTAG(SEQ ID NO :5)
[0083] >gi I 5〇548〇53 I ref I XP_5〇l496· 11 YALIOC〇595lp [解脂耶氏酵母]
[0084] MVKNVDQVDLSQVDTIASGRDVNYKVKYTSGVKMSQGAYDDKGRHISEQPFTWANWHQHINWLNFILVI ALPLSSFAAAPFVSFNWKTAAFAVGYYMCTGLGITAGYHRMWAHRAYKAALPVRIILALFGGGAVEGSIRffffASSHR VHHRWTDSNKDPYDARKGFWFSHFGWMLLVPNPKNKGRTDISDLNNDffVVRLQHKYYVYVLVFMAIVLPTLVCGFGW GDWKGGLVYAGIMRYTFVQQVTFCVNSLAHWIGEQPFDDRRTPRDHALTALVTFGEGYHNFHHEFPSDYRNALIWYQ YDPTKWLIWTLKQVGLAWDLQTFSQNAIEQGLVQQRQKKLDKffRNNLNWGIPIEQLPVIEFEEFQEQAKTRDLVLIS GIVHDVSAFVEHHPGGKALIMSAVGKDGTAVFNGGVYRHSNAGHNLLATMRVSVIRGGMEVEVWKTAQNEKKDQNIV SDESGNRIHRAGLQATRVENPGMSGMAA(SEQ ID NO :6)
[0085] 本發(fā)明的一些方面提供了用于在用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的微生物中 操縱ATP-檸檬酸裂解酶（ACL)活性的方法。ACL通過裂解作為TCA循環(huán)產(chǎn)物從線粒體中 穿梭出來的檸檬酸而提供細胞溶膠乙酰-CoA。ACL基因產(chǎn)物將檸檬酸裂解為草酰乙酸和乙 酰-CoA，由此為ACC提供了乙酰-CoA底物，后者隨后介導乙酰-C 〇A(這是脂肪酸合成中的 主要C2-前體）向丙二酰-CoA的轉化，這一過程被視為脂肪酸合成中的第一關鍵步驟并 在本文其他地方會有更詳盡的描述。在一些實施方式中，ACL基因產(chǎn)物是由分別的基因編碼 的兩個亞基組成的蛋白質。在一些實施方式中，ACL基因產(chǎn)物是由相同基因編碼的兩個亞基 組成的。在一些實施方式中，所述操縱是進行過表達。在一些實施方式中，所述操縱是通過 將用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)的微生物與包含編碼ACL基因產(chǎn)物（例如ACL蛋白） 的核酸的表達構建體接觸而實現(xiàn)，所述核酸可操作地連接于異源啟動子如組成型或誘導型 啟動子。在一些實施方式中，編碼ACL基因產(chǎn)物的核酸包含SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:9 的編碼序列。在一些實施方式中，所述ACL是解脂耶氏酵母的ACL，例如包含SEQ ID NO: 8 和SEQ ID N0:10氨基酸序列的解脂耶氏酵母ACL。在一些實施方式中，所述微生物為解脂 耶氏酵母。在一些實施方式中，微生物中對ACL活性的操縱賦予微生物有益的表型，用于將 碳水化合物大規(guī)模轉化為生物燃料或生物燃料前體，例如增加的脂質合成速率、增加的碳 水化合物向脂質轉化效率、增加的脂質儲存以及增加的生長速率、增加的對碳源或脂質產(chǎn) 物濃度升高的耐受性。ATP-檸檬酸裂解酶基因及基因產(chǎn)物序列對本領域技術人員是已知 的。示例性地，代表基因和基因產(chǎn)物序列可在NCBI數(shù)據(jù)庫（www. ncbi. nlm. nih. gov)中在 GeneID:2912101 和 2910381 的條目下找到。
[0086] 合適的ACL核酸序列和蛋白質序列的非限制性實例在下文提供。其他的合適的 ACL序列，包括來自其他物種的序列對本領域技術人員是清楚的，本發(fā)明在此方面并不受到 限制。
[0087] ATP檸檬酸裂解酶（解脂耶氏酵母）亞基1，ACL1DNA
[0088] YALI0E34793g
[0089] XM-504787
[0090] atgtctgccaacgagaacatctcccgattcgacgcccctgtgggcaaggagcaccccgcctacgag ct cttccataaccacacacgatctttcgtctatggtctccagcctcgagcctgccagggtatgctgga cttcgacttc atctgtaagcgagagaacccctccgtggccggtgtcatctatcccttcggcggccagt tcgtcaccaagatgtact ggggcaccaaggagactcttctccctgtctaccagcaggtcgagaagg ccgctgccaagcaccccgaggtcgatgt cgtggtcaactttgcctcctctcgatccgtctactcctcta ccatggagctgctcgagtacccccagttccgaacc atcgccattattgccgagggtgtccccgagcg acgagcccgagagatcctccacaaggcccagaagaagggtgtga ccatcattggtcccgctaccg tcggaggtatcaagcccggttgcttcaaggttggaaacaccggaggtatgatgga caacattgtcg cctccaagctctaccgacccggctccgttgcctacgtctccaagtccggaggaatgtccaacgag ct gaacaacattatctctcacaccaccgacggtgtctacgagggtattgctattggtggtgaccgatac cctggt actaccttcattgaccatatcctgcgatacgaggccgaccccaagtgtaagatcatcgtcct ccttggtgaggttg gtggtgttgaggagtaccgagtcatcgaggctgttaagaacggccagatcaa gaagcccatcgtcgcttgggccat tggtacttgtgcctccatgttcaagactgaggttcagttcggcc acgccggctccatggccaactccgacctggag actgccaaggctaagaacgccgccatgaagtct gctggcttctacgtccccgataccttcgaggacatgcccgagg tccttgccgagctctacgagaaga tggtcgccaagggcgagctgtctcgaatctctgagcctgaggtccccaagat ccccattgactactc ttgggcccaggagcttggtcttatccgaaagcccgctgctttcatctccactatttccgat gaccgag gccaggagcttctgtacgctggcatgcccatttccgaggttttcaaggaggacattggtatcggcgg t gtcatgtctctgctgtggttccgacgacgactccccgactacgcctccaagtttcttgagatggttct catgctta ctgctgaccacggtcccgccgtatccggtgccatgaacaccattatcaccacccgagct ggtaaggatctcatttc ttccctggttgctggtctcctgaccattggtacccgattcggaggtgctctt gacggtgctgccaccgagttcacc actgcctacgacaagggtctgtccccccgacagttcgttgata ccatgcgaaagcagaacaagctgattcctggta ttggccatcgagtcaagtctcgaaacaaccccg atttccgagtcgagcttgtcaaggactttgttaagaagaactt cccctccacccagctgctcgactac gcccttgctgtcgaggaggtcaccacctccaagaaggacaacctgattctg aacgttgacggtgct attgctgtttcttttgtcgatctcatgcgatcttgcggtgcctttactgtggaggagactg aggactac ctcaagaacggtgttctcaacggtctgttcgttctcggtcgatccattggtctcattgcccaccatct c gatcagaagcgactcaagaccggtctgtaccgacatccttgggacgatatcacctacctggttggc caggaggc tatccagaagaagcgagtcgagatcagcgccggcgacgtttccaaggccaagactc gatcatag(SEQ ID NO :7)
[0091] ATP檸檬酸裂解酶（解脂耶氏酵母）亞基1，ACL1蛋白質
[0092] YALI0E34793p
[0093] XP_504787
[0094] MSANENISRFDAPVGKEHPAYELFHNHTRSFVYGLQPRACQGMLDFDFICKRENPSVAGVIYPFGGQFV TKMYWGTKETLLPVYQQVEKAAAKHPEVDVVVNFASSRSVYSSTMELLEYPQFRTIAIIAEGVPERRAREILHKAQK KGVTIIGPATVGGIKPGCFKVGNTGGMMDNIVASKLYRPGSVAYVSKSGGMSNELNNIISHTTDGVYEGIAIGGDRY PGTTFIDHILRYEADPKCKIIVLLGEVGGVEEYRVIEAVKNGQIKKPIVAWAIGTCASMFKTEVQFGHAGSMANSDL ETAKAKNAAMKSAGFYVPDTFEDMPEVLAELYEKMVAKGELSRISEPEVPKIPIDYSWAQELGLIRKPAAFISTISD DRGQELLYAGMPISEVFKEDIGIGGVMSLLWFRRRLPDYASKFLEMVLMLTADHGPAVSGAMNTIITTRAGKDLISS LVAGLLTIGTRFGGALDGAATEFTTAYDKGLSPRQFVDTMRKQNKLIPGIGHRVKSRNNPDFRVELVKDFVKKNFPS TQLLDYALAVEEVTTSKKDNLILNVDGAIAVSFVDLMRSCGAFTVEETEDYLKNGVLNGLFVLGRSIGLIAHHLDQK RLKTGLYRHPWDDITYLVGQEAIQKKRVEISAGDVSKAKTRS(SEQ ID N0:8)
[0095] ATP檸檬酸裂解酶（解脂耶氏酵母）亞基2, ACL2DNA
[0096] YALI0D24431g
[0097] XM-503231
[0098] atgtcagcgaaatccattcacgaggccgacggcaaggccctgctcgcacactttctgtccaaggcg cc cgtgtgggccgagcagcagcccatcaacacgtttgaaatgggcacacccaagctggcgtctctg acgttcgaggac ggcgtggcccccgagcagatcttcgccgccgctgaaaagacctacccctggctg ctggagtccggcgccaagtttg tggccaagcccgaccagctcatcaagcgacgaggcaaggccgg cctgctggtactcaacaagtcgtgggaggagtg caagccctggatcgccgagcgggccgccaagc ccatcaacgtggagggcattgacggagtgctgcgaacgttcctg gtcgagccctttgtgccccacg accagaagcacgagtactacatcaacatccactccgtgcgagagggcgactgga tcctcttctacc acgagggaggagtcgacgtcggcgacgtggacgccaaggccgccaagatcctcatccccgttga c attgagaacgagtacccctccaacgccacgctcaccaaggagctgctggcacacgtgcccgagga ccagcacca gaccctgctcgacttcatcaaccggctctacgccgtctacgtcgatctgcagtttacgt atctggagatcaacccc ctggtcgtgatccccaccgcccagggcgtcgaggtccactacctggatct tgccggcaagctcgaccagaccgcag agtttgagtgcggccccaagtgggctgctgcgcggtcccc cgccgctctgggccaggtcgtcaccattgacgccgg ctccaccaaggtgtccatcgacgccggccc cgccatggtcttccccgctcctttcggtcgagagctgtccaaggag gaggcgtacattgcggagctc gattccaagaccggagcttctctgaagctgactgttctcaatgccaagggccgaa tctggacccttg tggctggtggaggagcctccgtcgtctacgccgacgccattgcgtctgccggctttgctgacga get cgccaactacggcgagtactctggcgctcccaacgagacccagacctacgagtacgccaaaaccg tactgga tctcatgacccggggcgacgctcaccccgagggcaaggtactgttcattggcggaggaa tcgccaacttcacccag gttggatccaccttcaagggcatcatccgggccttccgggactaccagtc ttctctgcacaaccacaaggtgaaga tttacgtgcgacgaggcggtcccaactggcaggagggtct gcggttgatcaagtcggctggcgacgagctgaatct gcccatggagatttacggccccgacatgca cgtgtcgggtattgttcctttggctctgcttggaaagcggcccaag aatgtcaagccttttggcaccg gaccttctactgaggcttccactcctctcggagtttaa(SEQ ID NO :9)
[0099] 檸檬酸裂解酶（解脂耶氏酵母）亞基2, ACL2蛋白質
[0100] YALI0D24431p
[0101] XP_503231
[0102] MSAKSIHEADGKALLAHFLSKAPVWAEQQPINTFEMGTPKLASLTFEDGVAPEQIFAAAEKTYPWLLES GAKFVAKPDQLIKRRGKAGLLVLNKSWEECKPWIAERAAKPINVEGIDGVLRTFLVEPFVPHDQKHEYYINIHSVRE GDWILFYHEGGVDVGDVDAKAAKILIPVDIENEYPSNATLTKELLAHVPEDQHQTLLDFINRLYAVYVDLQFTYLEI NPLVVIPTAQGVEVHYLDLAGKLDQTAEFECGPKWAAARSPAALGQVVTIDAGSTKVSIDAGPAMVFPAPFGRELSK EEAYIAELDSKTGASLKLTVLNAKGRIWTLVAGGGASVVYADAIASAGFADELANYGEYSGAPNETQTYEYAKTVLD LMTRGDAHPEGKVLFIGGGIANFTQVGSTFKGIIRAFRDYQSSLHNHKVKIYVRRGGPNWQEGLRLIKSAGDELNLP MEIYGPDMHVSGIVPLALLGKRPKNVKPFGTGPSTEASTPLGV(SEQ ID NO:10)
[0103] 本發(fā)明的一些方面提供了用于油生產(chǎn)的產(chǎn)油微生物，其包含本文描述的任意修 飾，例如本文描述的DGA1修飾、如本文所描述的ACC1修飾及/或如本文所描述的SCD修 飾。在一些實施方式中，提供了修飾的產(chǎn)油微生物，其包含如本文描述的推修飾以及如本文 描述的拉修飾。在一些實施方式中，推修飾包含ACC1基因產(chǎn)物的過表達。在一些實施方式 中，拉修飾包含DGA1和/或S⑶基因產(chǎn)物。
[0104] 本發(fā)明的一些方面提供了核酸，其編碼的基因產(chǎn)物賦予微生物如解脂耶氏酵母生 產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體所需要的和/或希望的表型。在一些實施方式中，所述核酸是 來源于解脂耶氏酵母的核酸。在一些實施方式中，所述核酸編碼DGA1基因產(chǎn)物如DGA1蛋 白質。在一些實施方式中，所述核酸編碼ACC1基因產(chǎn)物如ACC1蛋白質。在一些實施方式 中，所述核酸編碼去飽和酶如Λ 9去飽和酶。在一些實施方式中，所述核酸編碼解脂耶氏酵 母Λ9去飽和酶（SCD)。在一些實施方式中，提供了編碼基因產(chǎn)物的組合的核酸，例如在多 順反子中，其包含過表達代表脂質生物合成中的推修飾的基因產(chǎn)物（如ACC1基因產(chǎn)物）和 過表達代表了脂質生物合成中的拉修飾的基因產(chǎn)物（例如DGA1和/或SCD基因產(chǎn)物）。
[0105] 術語"核酸"指的是包含多個相連的核苷酸的分子。"核酸"和"核酸分子"可交 換使用，指代寡核糖核苷酸以及寡脫氧核糖核苷酸。該術語還包括多核苷（即多核苷酸減 去磷酸）及任何其他含有核酸的有機堿。所述有機堿包括腺嘌呤、尿嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧 啶、胞嘧啶及肌苷。所述核酸可以為單鏈或雙鏈。所述核酸可以為天然或非天然存在的。 核酸可獲自天然來源，或可使用核酸合成儀進行合成（即合成的）。核酸的分離在本領域 是常規(guī)進行的，合適的方法可見于標準分子生物學課本（例如見Maniatis的Handbook of Molecular Biology)。如本文所描述的，所述核酸可以為DNA或RNA如基因組DNA、線粒體 DNA、mRNA、cDNA、rRNA、miRNA、PNA或LNA或其組合。非天然存在的核酸如細菌人工染色體 (BAC)及酵母人工染色體（YAC)也可根據(jù)本發(fā)明的一些方面而使用。
[0106] 本發(fā)明的一些方面涉及核酸衍生物的用途。特定核酸衍生物的用途可通過防止其 被消化而增加本發(fā)明核酸的穩(wěn)定性，尤其是在其接觸可以含有核酸酶的生物學樣品的情況 下。如本文所使用的，核酸衍生物是非天然存在的核酸或其單元。核酸衍生物可以含有非天 然存在的元素如非天然存在的核苷酸和非天然存在的骨架連接。根據(jù)本發(fā)明的一些方面的 核酸衍生物可含有骨架修飾，例如但不限于，硫代磷酸酯鍵、磷酸二酯修飾的核酸、磷酸二 酯和硫代磷酸酯核酸的組合、甲基膦酸酯、烷基膦、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、 氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酯、羧甲基酯、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，P-乙 氧基，及其組合。核酸的骨架組合物可以為同源或異源的。
[0107] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，核酸衍生物可以在糖和/或堿基部分含有置換或修飾。 例如，一些核酸衍生物可以包括這樣的核酸，其的骨架糖在3'位置共價附著至低分子量有 機基團而不是羥基基團，在5'位置也并非附著至磷酸基團（例如2'-0-烷基化核糖基團）。 核酸衍生物可以包括非核糖的糖類如阿拉伯糖。核酸衍生物可含有置換的嘌呤或嘧啶，如 C-5丙炔修飾的堿基、5-甲基胞嘧陡、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2, 6-二氨基嘌呤、次 黃嘌呤、2-硫尿嘧啶和假異胞嘧啶。
[0108] 在一些實施方式中，核酸可以包含肽核酸（PNA)、鎖核酸（LNA)、DNA、RNA或上述核 酸的共-核酸如DNA-LNA共-核酸。
[0109] 如本文所使用的，術語"分離的核酸分子"指的是不在天然環(huán)境下的核酸分子，例 如這樣的核酸：（i)通過本領域已知的方法從細胞或微生物如細菌或真菌中被提取和/或 純化的核酸，所述方法為例如對宿主細胞進行堿裂解并隨后例如使用硅吸附步驟對核酸進 行純化；（ii)例如通過聚合酶鏈反應（PCR)在體外擴增的核酸；（iii)通過克隆而重組生 產(chǎn)的核酸，例如將核酸克隆至表達載體；（iv)經(jīng)過片斷化并通過大小被分離的核酸，例如 通過體外酶消化或通過剪切并隨后進行凝膠分離；或（v)例如通過化學合成而合成的核 酸。在一些實施方式中，術語"分離的核酸分子"指的是（vi)在化學上與任何天然存在的 核酸有極大不同的核酸。在一些實施方式中，可通過本領域已知的重組DNA技術容易地對 分離的核酸進行操縱。因此，克隆入載體的核酸或遞送到宿主細胞中并整合進入宿主基因 組的核酸被認為是分離的，但以其天然狀態(tài)在天然宿主中的核酸則不是。分離的核酸可以 大體上得到純化，但不一定需要如此。例如，在克隆或表達載體內(nèi)分離的核酸不是純化的， 因為其可以含有少量百分比的其居留的細胞中的物質。然而如本文所使用的術語一樣，這 樣的核酸也是分離的。
[0110] 本發(fā)明的一些方面涉及這樣的核酸，其編碼的基因產(chǎn)物賦予微生物需要的或期望 的表型，用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)，所述核酸連接于啟動子或其他轉錄激活元件。 在一些實施方式中，編碼基因產(chǎn)物并連接于啟動子的核酸是包含在表達載體或表達構建體 中的。如本文所使用的，術語"表達載體"或"表達構建體"指的是重組或合成生成的核酸構 建體，具有一系列特異的核酸元件允許特定核酸在宿主微生物如產(chǎn)油酵母中的轉錄。在一 些實施方式中，表達載體可為質粒、病毒或核酸片段的部分。在一些實施方式中，表達載體 包括可操作地連接于啟動子的待轉錄的編碼核酸。啟動子是一種核酸元件，其促進待轉錄 核酸的轉錄。啟動子通常位于其控制轉錄的核酸序列的相同鏈上，并位于其上游（或5'）。 在一些實施方式中，表達載體包括可操作地連接于異源啟動子的待轉錄的編碼核酸。異源 啟動子是并非天然可操作連接于給定核酸序列的啟動子。例如，解脂耶氏酵母中的DGA1基 因天然可操作地連接于解脂耶氏酵母DGA1基因啟動子。因此例如在表達構建物中野生型 解脂耶氏酵母DGA1基因啟動子之外的任何啟動子（其可操作地連接于DGA1基因）或其部 分因此在上下文中就是異源啟動子。例如，連接于編碼DGA1基因產(chǎn)物的核酸的TEF1啟動 子對于DGA1來說就是異源啟動子。
[0111] 在一些實施方式中，表達載體包括編碼核酸，例如編碼DGA1，ACC1和/或S⑶基 因產(chǎn)物的核酸，其可操作地連接于組成型啟動子。術語"組成型啟動子"指的是允許相連 的基因得到持續(xù)轉錄的啟動子。在一些實施方式中，表達載體包括編碼核酸，例如編碼 DGA1，ACC1和/或SCD基因產(chǎn)物的核酸，其可操作地連接于誘導型啟動子。術語"誘導型啟 動子"在本文可與術語"條件型啟動子"交換使用，指的是只在一些在生物或非生物因素下 才允許與其相連的基因進行轉錄的啟動子。藥物誘導啟動子如四環(huán)素/強力霉素誘導的啟 動子、他莫昔芬誘導啟動子以及依賴于重組事件而被激活的啟動子，例如ere-介導的ΙοχΡ 位點的重組，這些都是本領域熟知的誘導型啟動子的實例。
[0112] 本公開的一些方面涉及驚人的發(fā)現(xiàn)，即產(chǎn)油微生物中給定基因產(chǎn)物在異源啟動子 下過表達可通過在相應表達構建物中包含內(nèi)含子得到顯著增強。本發(fā)明的一些方面提供 了內(nèi)含子增強的組成型啟動子用于在產(chǎn)油微生物中的基因過表達，并且提供了這種內(nèi)含子 增強啟動子的表達構建體和載體。在一些實施方式中，提供了內(nèi)含子增強的TEF啟動子，其 包含TEF啟動子序列、轉錄起始位點、轉錄起始位點下游的內(nèi)含子序列以及編碼合適序列， 例如編碼DGA1，ACC1和/或SCD基因產(chǎn)物的核酸序列。在一些實施方式中，所述內(nèi)含子位 于翻譯起始位點的下游，但仍然位于基因序列的開放閱讀框之內(nèi)，例如，位于起始密碼子之 后，但在編碼所述基因產(chǎn)物核酸序列的終止位點之前。在一些實施方式中，所述內(nèi)含子緊接 著位于翻譯起始位點如ATG起始密碼子下游，但仍然在編碼序列的其余部分的上游。為了 闡述清楚，提供如下所示的內(nèi)含子增強表達構建體的非限制的示例性結構：
[0113] 5' 一TEF啟動子一轉錄起始位點-內(nèi)含子一DGA1編碼序列一3'。下文提供了 另一個內(nèi)含子增強表達構建體的非限制的示例性結構：
[0114] 5' 一TEF啟動子一轉錄起始位點-起始密碼子一內(nèi)含子一DGA1編碼序列-終 止密碼子一3'。ACC1和S⑶基因產(chǎn)物的表達構建體分別具有DGA1編碼序列置換ACC或 S⑶編碼序列。
[0115] 合適的TEF啟動子序列及合適的內(nèi)含子序列對本領域技術人員是清楚的。一些無 內(nèi)含子TEF啟動子序列在例如美國專利#6, 265, 185中已經(jīng)公開。下文提供了一些示例代 表性序列。然而，要理解的是本發(fā)明在此方面不限于此。
[0116] 示例性TEF啟動子序列：
[0117] agagaccgggttggcggcgcatttgtgtcccaaaaaacagccccaattgccccaattgaccc caaatt gacccagtagcgggcccaaccccggcgagagcccccttctccccacatatcaaacctccc ccggttcccacacttg ccgttaagggcgtagggtactgcagtctggaatctacgcttgttcagacttt gtactagtttctttgtctggccat ccgggtaacccatgccggacgcaaaatagactactgaaaatttt tttgctttgtggttgggactttagccaagggt ataaaagaccaccgtccccgaattacctttcctcttc ttttctctctctccttgtcaactcacacccgaaatcgtt aagcatttccttctgagtataagaatcattc aaa(SEQ ID NO:11)
[0118] 示例性內(nèi)含子序列：
[0119] gtgagtttcagaggcagcagcaattgccacgggctttgagcacacggccgggtgtggtccc attccca tcgacacaagacgccacgtcatccgaccagcactttttgcagtactaaccgcag(SEQ ID NO:12)
[0120] 在啟動子和內(nèi)含子序列之間含有起始密碼子（ATG)的示例性TEF啟動子-內(nèi)含子 序列：
[0121] agagaccgggttggcggcgcatttgtgtcccaaaaaacagccccaattgccccaattgaccc caaatt gacccagtagcgggcccaaccccggcgagagcccccttctccccacatatcaaacctccc ccggttcccacacttg ccgttaagggcgtagggtactgcagtctggaatctacgcttgttcagacttt gtactagtttctttgtctggccat ccgggtaacccatgccggacgcaaaatagactactgaaaatttt tttgctttgtggttgggactttagccaagggt ataaaagaccaccgtccccgaattacctttcctcttc ttttctctctctccttgtcaactcacacccgaaatcgtt aagcatttccttctgagtataagaatcattc aaaATGgtgagtttcagaggcagcagcaattgccacgggctttga gcacacggccgggtgtggt cccattcccatcgacacaagacgccacgtcatccgaccagcactttttgcagtacta accgcag
[0122] (SEQ ID NO: 13)
[0123] 將表達載體或表達構建物遞送入微生物如酵母細胞的方法對本領域技術人員 是熟知的。包括表達載體在內(nèi)的核酸可通過生物相關領域技術人員熟知的多種方法遞 送入原核及真核微生物中。根據(jù)本發(fā)明的一些方面將核酸遞送入微生物的方法包括 但不限于不同的化學、電化學及生物學方法，例如熱激轉化、電穿孔、轉染如脂質體介 導的轉染、DEAE-葡聚糖-介導的轉染或磷酸鈣轉染。在一些實施方式中，使用媒介物 或載體將核酸構建體如包含DGA1、ACC1和/或SCD編碼核酸序列的組合的表達構建 體引入宿主微生物用于轉移遺傳物質。用于將遺傳物質轉移至微生物的方法對本領 域技術人員是已知的，包括例如質粒、人工染色體和病毒載體。用于構建核酸構建體 包括含有組成型或誘導型異源啟動子的表達構建體、敲除或敲低構建體的方法，以及 將核酸或核酸構建體遞送至微生物的方法及載體對本領域技術人員是熟知的，在例如 下列著作中有所描述：J. Sambrook 和 D. Russell, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd edition(January15, 2001)； David C.Amberg, Daniel J.Burke ；和 Jeffrey N.Strathern, Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April2005) ；John N.Abelson, Melvin I.Simon,Christine Guthrie,和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volumel94(Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press(Marchll, 2004)； Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume350(Methods in Enzymology, V〇1350), Academic Press ； 1st edition(July2, 2002) ；Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C,Volume351, Academic Press ； 1st edition (July9,2002) ；Gregory N. Stephanopoulos,Aristos A. Aristidou 和 Jens Nielsen, Metabolic Engineering:Principles and Methodologies, Academic Press ；ledition(0ctoberl6, 1998)；以及 Christina Smolke, The Metabolic Pathway Engineering Handbook:Fundamentals,CRC Press ;ledition(July28, 2009)，其以全部并 入本文作為參考。
[0124] 在一些實施方式中，編碼基因產(chǎn)物的基因的原生啟動子例如原生DGA1、ACC1或 SCD啟動子賦予了微生物需要的或希望的表型，在微生物中，這些啟動子得到修飾以改變其 轉錄活性的調(diào)節(jié)。在一些實施方式中，經(jīng)過修飾的啟動子相比于未修飾的對等物轉錄活性 增加。如本文所使用的，術語"經(jīng)修飾啟動子"指的是其核苷酸序列受到人為改變的啟動子。 單獨的核苷酸刪除、插入或突變或其組合都是所述人為改變的實例。人為的啟動子改變可 以以靶向的方式實現(xiàn)，例如通過同源重組手段如基因靶向、敲除、敲入、定點誘變或人工鋅 指核酸酶介導的策略實現(xiàn)。備選地，這樣的改變可通過隨機或準隨機事件實現(xiàn)，如輻射或非 靶向核苷酸整合并隨后進行篩選。啟動子修飾一般是不斷改進的以調(diào)制相應啟動子轉錄激 活特性。例如，在對細胞內(nèi)脂肪酸水平升高作出應答時介導DGA1、ACC1或SCD啟動子的抑 制的調(diào)節(jié)元件的破壞或刪除會導致相應的基因甚至在細胞內(nèi)脂肪酸水平升高的條件下持 續(xù)轉錄激活。類似地，組成型激活的轉錄激活元件插入條件型啟動子區(qū)域可以對相應的基 因在正常的抑制性條件下的過表達產(chǎn)生影響。用于在微生物中靶向破壞原生啟動子例如原 生DGA1、ACC1或SCD啟動子，例如用于靶向破壞使得轉錄速率增加的方法對本領域技術人 員是熟知的。
[0125] 本發(fā)明的一些方面涉及微生物如解脂耶氏酵母的工程改造，以顯示用于生物燃料 或生物燃料前體的大規(guī)模生產(chǎn)所需要和/或希望的表型。本發(fā)明的一些方面涉及脂質合成 途徑的代謝工程改造以產(chǎn)生就生物燃料生產(chǎn)而優(yōu)化的微生物。本發(fā)明的一些方面涉及代謝 改造，其包含調(diào)制那些調(diào)節(jié)進入脂質合成途徑的碳流的基因的表達的遺傳修飾的組合，以 產(chǎn)生就生物燃料生產(chǎn)而優(yōu)化的微生物。在一些實施方式中，所述遺傳修飾的組合包括推修 飾和拉修飾。在一些實施方式中，推修飾包含增加細胞中用于脂質合成的代謝物乙酰-CoA、 ATP或NADPH水平的遺傳修飾，例如ACC1基因產(chǎn)物的過表達。在一些實施方式中，拉修飾是 降低脂質合成中那些顯示有反饋抑制功能的產(chǎn)物或中間產(chǎn)物，如脂肪酸水平的遺傳修飾。 在一些實施方式中，拉修飾包含DGA1和/或S⑶基因產(chǎn)物的過表達。
[0126] 本發(fā)明的一些方面提供了通過調(diào)制解脂耶氏酵母的原生脂質代謝極大地增加解 脂耶氏酵母介導的碳源向脂質轉化效率的方法。顯著而意外地，相比于僅僅分別調(diào)制推或 拉過程的單獨的修飾，根據(jù)本發(fā)明提供的一些方法的脂質代謝的推-和-拉修飾的組合能 使得進入脂質合成途徑的碳流有顯著的增加。
[0127] 本發(fā)明的一些方面涉及工程改造和/或優(yōu)化用于大規(guī)模生物燃料或生物燃料前 體生產(chǎn)的微生物。在一些實施方式中，提供了工程改造的微生物，其已經(jīng)通過本發(fā)明的一些 方面提供的方法或使用了本發(fā)明的一些方面提供的核酸或蛋白質進行操縱，所述核酸或蛋 白質為例如本文提供的表達構建體或表達構建體組合，其導致介導脂質合成推過程的基因 產(chǎn)物（例如ACC1產(chǎn)物）與介導脂質合成拉過程的基因產(chǎn)物（例如DGA1和/或SCD基因產(chǎn) 物）的組合的過表達。在一些實施方式中，提供了工程改造的微生物，其過表達的基因產(chǎn)物 的推-和-拉的組合，根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式賦予所述微生物用于生物燃料或生物燃 料前體生產(chǎn)必需的及/或希望的表型。在一些實施方式中，提供了微生物，其包含的DGA1、 ACC1和/或SCD基因產(chǎn)物活性得到增加。在一些實施方式中，所述微生物顯示了增加的脂 肪酸合成速率、增加的TAG儲存及/或此外的必需或希望的特征。
[0128] 如本文在微生物脂質合成的上下文中所使用的，例如在本文描述的產(chǎn)油微生物的 脂肪酸合成速率的上下文中所使用的，術語"增加的合成速率"或"合成速率增加"指的是 在工程改造的微生物中合成速率相比于相同種屬野生型微生物中相應的合成速率得到增 力口。例如，在本文描述的工程改造的解脂耶氏酵母微生物中，TAG合成速率增加指的是脂 質合成速率比野生型TAG合成速率得到增加。在一些實施方式中，增加的脂質合成速率， 例如TAG或總脂質合成速率指的是細胞培養(yǎng)物例如工程改造的微生物培養(yǎng)物中脂肪酸合 成速率。在一些實施方式中，增加的脂質合成速率是脂質合成如TAG合成或總脂質合成速 率為至少0. 〇lg/L/h (脂質克每升培養(yǎng)基每小時）、至少0. 004g/L/h、至少0. 05g/L/h、至少 0· lg/L/h、至少 0· 14g/L/h、至少 0· 15g/L/h、至少 0· 2g/L/h、至少 0· 3g/L/h、至少 0· 4g/L/ h、至少 0. 5g/L/h、至少 0. 6g/L/h、至少 0. 7g/L/h、至少 0. 8g/L/h、至少 0. 9g/L/h、至少 lg/ L/h、至少 2g/L/h、至少 3g/L/h、至少 4g/L/h、至少 5g/L/h、至少 6g/L/h、至少 7g/L/h、至少 8g/L/h、至少 9g/L/h、至少 10g/L/h 或至少 25g/L/h。
[0129] 在一些實施方式中，本上下文中合成速率為生物反應器進行一個完整的運行周期 中測量的合成速率，例如由生物反應器運行總時間內(nèi)或脂質測量的總時間內(nèi)合成的脂質例 如TAG總量計算合成速率。這種合成速率的類型在本文有時候稱作"總脂質生產(chǎn)效率"或 "總體脂質生產(chǎn)效率"，通常以g/L/h(每小時運行時間每升培養(yǎng)基生產(chǎn)的脂質克數(shù)）為單位 提供。在一些實施方式中，提供了工程改造的微生物，例如工程改造的解脂耶氏酵母，其過 表達ACC1基因產(chǎn)物、DGA1基因產(chǎn)物及/或S⑶基因產(chǎn)物，與野生型微生物如野生型解脂耶 氏酵母相比，總脂質生產(chǎn)效率顯示了至少5倍的增加、至少6倍的增加、至少7倍的增加、至 少8倍的增力口、至少9倍的增力口、至少10倍的增力口、至少12倍的增力口、至少10倍的增力口、至 少12. 5倍的增加、至少15倍的增加、至少20倍的增加、至少30倍的增加、至少40倍的增 力口、至少50倍的增加、至少60倍的增加、至少70倍的增加、至少80倍的增加、至少90倍的 增加、至少100倍的增加、至少500倍的增加，或至少1000倍的增加。
[0130] 在一些實施方式中，增加的總脂質合成速率或增加的總脂質生產(chǎn)效率為至少 0· 01g/L/h、至少 0· 004g/L/h、至少 0· 05g/L/h、至少 0· lg/L/h、至少 0· 14g/L/h、至少 0· 15g/ L/h、至少 0. 2g/L/h、至少 0. 3g/L/h、至少 0. 4g/L/h、至少 0. 5g/L/h、至少 0. 6g/L/h、至少 0· 7g/L/h、至少 0· 8g/L/h、至少 0· 9g/L/h、至少 lg/L/h、至少 2g/L/h、至少 3g/L/h、至少 4g/ L/h 或至少 5g/L/h。
[0131] 在一些實施方式中，合成速率是在例如優(yōu)化的生長條件下有營養(yǎng)物的存在下測量 的最大合成速率或峰合成速率。這種類型的合成速率在本文有時候稱為"最大脂質生產(chǎn)效 率"。在一些實施方式中，增加的最大脂質合成速率是脂質合成如TAG合成的速率為至少 0· 2g/L/h、至少 0· 3g/L/h、至少 0· 4g/L/h、至少 0· 5g/L/h、至少 0· 6g/L/h、至少 0· 7g/L/h、至 少 0· 8g/L/h、至少 0· 9g/L/h、至少 lg/L/h、至少 2g/L/h、至少 3g/L/h、至少 4g/L/h、至少 5g/ L/h、至少 6g/L/h、至少 7g/L/h、至少 8g/L/h、至少 9g/L/h、至少 10g/L/h，或至少 25g/L/h。
[0132] 在一些實施方式中，工程改造的微生物是產(chǎn)油酵母如解脂耶氏酵母。在一些實施 方式中，本發(fā)明提供的工程改造的酵母顯示了一種或多種高度所需的且預期外的表型特 征，例如：增加的碳-油轉化率或效率，增加的脂質小體中的脂質積累。
[0133] 在一些實施方式中，本發(fā)明的某些方面提供的工程改造的微生物，例如工程改造 的酵母，顯示的碳-油轉化率（本文也稱為"脂質產(chǎn)率"）在大約0.02g/g(生產(chǎn)的油、月旨 質或TAG(g)/碳（g)，例如消耗的葡萄糖、醋酸鹽或醋酸）-大約0. 3g/g的范圍內(nèi)。在一 些實施方式中，本發(fā)明的某些方面提供的工程改造的微生物，例如工程改造的酵母，顯示的 碳-油轉化率為大約〇· 〇l〇g/g、大約〇· 〇2g/g、大約0· 025g/g、大約0· 03g/g、大約0· 04g/ g、大約 〇· 05g/g、大約 0· 06g/g、大約 0· 07g/g、大約 0· 075g/g、大約 0· 08g/g、大約 0· 09g/ g、大約 〇· lg/g、大約 〇· llg/g、大約 〇· 12g/g、大約 0· 13g/g、大約 0· 14g/g、大約 0· 15g/g、 大約 0· 16g/g、大約 0· 17g/g、大約 0· 18g/g、大約 0· 19g/g、大約 0· 2g/g、大約 0· 21g/g、大 約 0· 22g/g、大約 0· 23g/g、大約 0· 24g/g、大約 0· 25g/g、大約 0· 26g/g、大約 0· 27g/g、大 約0· 28g/g、大約0· 29g/g、大約0· 3g/g、大約0· 31g/g、大約0· 32g/g或接近理論值。在一 些實施方式中，本發(fā)明的某些方面提供的工程改造的微生物，例如工程改造的酵母，顯示的 碳-油轉化率為至少大約〇.〇l〇g/g(生產(chǎn)的脂質（g)/碳（g)，例如，消耗的葡萄糖、醋酸 鹽或醋酸）、至少大約〇. 〇2g/g、至少大約〇. 〇25g/g、至少大約0. 03g/g、至少大約0. 04g/ g、至少大約0. 05g/g、至少大約0. 06g/g、至少大約0. 07g/g、至少大約0. 075g/g、至少大約 0· 08g/g、至少大約0· 09g/g、至少大約0· lg/g、至少大約0· llg/g、至少大約0· 12g/g、至少 大約0. 13g/g、至少大約0. 14g/g、至少大約0. 15g/g、至少大約0. 16g/g、至少大約0. 17g/ g、至少大約0. 18g/g、至少大約0. 19g/g、至少大約0. 2g/g、至少大約0. 21g/g、至少大約 0· 22g/g、至少大約0· 23g/g、至少大約0· 24g/g、至少大約0· 25g/g、至少大約0· 26g/g、至少 大約0· 27g/g、至少大約0· 28g/g、至少大約0· 29g/g、至少大約0· 3g/g、至少大約0· 31g/g、 至少大約〇. 32g/g或接近理論值。
[0134] 如本文使用的術語"脂質滴度"在微生物脂質合成的上下文中，例如在本文描述的 產(chǎn)油微生物進行脂肪酸合成的上下文中，指的是每份體積的包含所述產(chǎn)油微生物的微生物 培養(yǎng)物合成的脂質的量。在一些實施方式中，改造的微生物例如本文描述的改造的解脂耶 氏酵母微生物可達到或確實達到的脂質滴度為至少lg/L(脂質克數(shù)每升微生物培養(yǎng)物）、 至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L、至少5g/L、至少6g/L、至少7g/L、至少8g/L、至少9g/L、 至少10g/L、至少15g/L、至少20g/L、至少25g/L、至少30g/L、至少40g/L、至少50g/L、至少 60g/L、至少 70g/L、至少 80g/L、至少 90g/L、至少 100g/L、至少 200g/L 或至少 250g/L。
[0135] 在一些實施方式中，如本文所提供的工程改造的微生物在碳-油轉化中顯示了增 加的脂質滴度。如本文在微生物脂質合成的上下文中例如在本文描述的產(chǎn)油微生物進行脂 肪酸合成的上下文中所使用的術語"增加的脂質滴度"指的是每份體積的包含所述產(chǎn)油微 生物的微生物培養(yǎng)物中合成的脂質的量相比于相同種屬的野生型微生物在相同條件（例 如，在相同生長基質中、具有相同的C/N比率、等量的氧氣、相同的pH、相同的營養(yǎng)物，等等） 下相應的脂質滴度得到增加。例如，本文描述的工程改造的微生物解脂耶氏酵母達到的增 加的脂質滴度指的是脂質滴度相比于同一條件下野生解脂耶氏酵母達到的脂質滴度得到 增加。在一些實施方式中，增加的脂質滴度指的是脂質滴度為至少lg/L(脂質克數(shù)每升微 生物培養(yǎng)物）、至少2g/L、至少3g/L、至少4g/L、至少5g/L、至少6g/L、至少7g/L、至少8g/ L、至少9g/L、至少10g/L、至少15g/L、至少20g/L、至少25g/L、至少30g/L、至少40g/L、至 少50g/L、至少60g/L、至少70g/L、至少80g/L、至少90g/L、至少100g/L、至少200g/L或至 少 250g/L。
[0136] 本發(fā)明的一些方面提供了工程改造的微生物用于油生產(chǎn)，其可使用多種碳源，包 括但不限于可發(fā)酵糖類，例如C6糖，如葡萄糖和有機酸，例如醋酸和/或其他鹽，例如醋酸 鹽。
[0137] 本發(fā)明的一些方面涉及本文提供的遺傳修飾的微生物的培養(yǎng)物。在一些實施方式 中，所述培養(yǎng)物包括本文提供的遺傳修飾的微生物以及基質，例如液體基質。在一些實施方 式中，所述培養(yǎng)物包含本文提供的遺傳修飾的微生物以及碳源，例如可發(fā)酵碳水化合物源 或有機酸或其鹽。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物包含了本文提供的遺傳修飾的微生物以 及構成鹽度、滲透壓以及pH條件的鹽和/或緩沖液，適合于微生物的存活、生長和/或碳水 化合物向生物燃料或生物燃料前體的轉化。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物包含其他的組 分例如添加劑。添加劑的非限制性實例為營養(yǎng)物、酶、氨基酸、白蛋白、生長因子、酶抑制劑 (例如蛋白酶抑制劑）、脂肪酸、脂質、激素（例如地塞米松和赤霉酸）、痕量元素、無機化合 物（例如還原試劑如鎂）、氧化還原調(diào)節(jié)劑（例如抗氧化劑）、穩(wěn)定試劑（例如二甲基亞砜）、 聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、明膠、抗生素（例如，布雷菲德菌素 A)、鹽（如NaCl)、螯 合劑（例如EDTA、EGTA)和酶（如纖維素酶、分散酶、透明質酸酶或脫氧核糖核酸酶）。在 一些實施方式中，所述培養(yǎng)物可以包含誘導或抑制條件型或誘導型啟動子調(diào)控的轉錄的藥 物，例如多西環(huán)素、四環(huán)素，他莫昔芬，IPTG，激素，或金屬離子。
[0138] 雖然特定培養(yǎng)條件如碳源濃度會取決于要培養(yǎng)的工程改造的微生物自身，然 而用于生成微生物培養(yǎng)物的通用方法和培養(yǎng)物條件對本領域技術人員是已知的，在例 如以下著作中有所描述：J. Sambrook 和 D. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd edition (January15, 2001)； David C.Amberg, Daniel J.Burke ；和 Jeffrey N.Strathern,Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (April2005) ； John N.Abel son, Melvin I.Simon, Christine Guthrie,和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Part A, Volumel94(Methods in Enzymology Series, 194), Academic Press(Marchll, 2004)； Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B, Volume350(Methods in Enzymology, V〇1350), Academic Press ； 1st edition (July2,2002) ；Christine Guthrie 和 Gerald R. Fink, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C, Volume351, Academic Press ；lst edition(July9, 2002)，其以全部并入本文作為參考。為生成油，本文描述的工程改造的微 生物培養(yǎng)物在適合油積累的條件下進行培養(yǎng)。
[0139] 在一些實施方式中，所述遺傳修飾的微生物顯示了相對于相同種類野生型微生物 和/或相對于其他微生物（例如通常發(fā)現(xiàn)會污染用于碳源向生物燃料或生物燃料前體轉化 的微生物培養(yǎng)物的那些微生物）的生長優(yōu)勢。在一些實施方式中，本發(fā)明的某些方面提供 的工程改造的微生物的生長和/或增殖優(yōu)勢轉化為使用非滅菌培養(yǎng)和發(fā)酵條件用于生物 燃料或生物燃料前體的生產(chǎn)的可能性，因為培養(yǎng)物中污染性微生物過度生長的問題能得到 緩解或完全消除。在一些實施方式中，本發(fā)明的某些方面提供的工程改造的微生物是在非 滅菌條件下培養(yǎng)的，用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)。例如，在一些實施方式中，非滅菌 原料、非滅菌的培養(yǎng)基、非滅菌的補充物或非滅菌的生物反應器（例如在非滅菌環(huán)境中的 開放式反應器）被用于生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)。
[0140] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面，多種不同的微生物都可進行遺傳修飾并用于工業(yè)規(guī) 模的生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)，例如來自多種酵母來源如產(chǎn)油酵母、細菌、藻類和 真菌的微生物。合適的酵母細胞的非限制性實例為來自以下種屬的細胞：解脂耶氏酵 母（Yarrowia lipolytica)、多形漢遜（Hansenula polymorpha)、畢赤酵母（Pichia pastoris)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、貝酵母（S. bayanus)、乳酸克魯 維酵母（S. K. lactis)、Waltomyces lipofer、高山被抱霉（Mortierella alpine)、黃 被抱霉（Mortierella isabellina)、多形漢遜、魯氏毛霉（Mucor rouxii)、皮狀絲抱 酵母（Trichosporon cutaneu)、粘紅酵母釀酒（Rhodotorula glutinis)、糖化酵母 (Saccharomyces diastasicus)、西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis)、釀酒酵 母（S. cerevisiae)、樹干畢赤酵母（Pichia stipitis)和裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)。合適的細菌的非限制性實例有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)、沙門氏 菌（Salmonella)、大腸埃希氏菌（Escherichia coli)、霍亂弧菌（Vibrio cholerae)、 鏈霉菌屬（Streptomyces)、突光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida)、假單胞菌屬（Pseudomonas sp·)、紅球菌屬（Rhodococcus sp·)、鏈 霉菌屬（Streptomyces sp.)和產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes sp)。合適的真菌細胞的非限制性 實例可以培養(yǎng)自，例如，Aspergillus shirousamii、黑曲霉（Aspergillus niger)和里氏 木霉（Trichoderma reesei)等種屬。合適的藻細胞的非限制性實例為來自以下種屬的細 胞：富油新綠藻（Neochloris oleoabundans)、斜生柵藻（Scenedesmus obliquus)、微綠球 藻屬（Nannochloropsis sp·)、杜氏鹽藻（Dunaliella tertiolecta)、小球藻（Chlorella vulgaris)、浮水小球藻（Chlorella emersonii)和極大螺旋藻（Spirulina maxima)。
[0141] 本發(fā)明的一些方面提供了用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的方法，所述方法使 用了本文提供的遺傳修飾的微生物。在一些實施方式中，提供了以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)生物燃料 或生物燃料前體的方法。
[0142] 使用本文提供的方法和/或遺傳修飾的微生物可以將多種碳源轉化為生物燃料 或生物燃料前體。在一些實施方式中，碳源包含碳水化合物。糖類、淀粉以及纖維都是適合 于本文提供的轉化方法的碳水化合物來源的實例。根據(jù)本發(fā)明的一些方面，碳水化合物來 源可包含精煉的和/或粗制的糖、淀粉和/或纖維，或這些物質的任意組合。糖的非限制性 的實例為可發(fā)酵糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖和乳糖。淀粉的非限制性實例為直鏈淀粉和 支鏈淀粉。纖維的非限制性實例為植物纖維如纖維素、半纖維素和木纖維。本發(fā)明的一些 方面涉及工業(yè)副產(chǎn)品、中間產(chǎn)物、或廢品的用作碳源用途，例如植物粗提取物、糖蜜、秸桿或 污水作為碳源。在一些實施方式中，碳源來自藻類。在一些實施方式中，藻類生物質特別生 產(chǎn)為用作微生物介導的生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)中的碳源。
[0143] 在一些實施方式中，提供了用于生產(chǎn)生物燃料或生物燃料前體的方法，包括使用 便宜、豐富且易得的碳源原料作為碳源。在一些實施方式中，纖維素或半纖維素被用作碳 源。在一些實施方式中，纖維素或半纖維素來自工業(yè)副產(chǎn)品或廢品。在一些實施方式中，纖 維素或半纖維素直接來源于植物或藻類生物質。植物或藻類生物質是最豐富的原料之一， 并且包含顯著量的不可發(fā)酵糖和纖維，例如纖維素和本纖維素。在一些實施方式中，對生物 質原料進行預處理以將不可發(fā)酵糖或纖維轉化為可發(fā)酵糖類，這樣使其能夠用于微生物生 長及微生物介導的生物燃料或生物燃料前體生產(chǎn)。在一些實施方式中，生物質原料的預處 理包括使纖維素和/或半纖維素組分解聚為單體糖，所使用的預處理方法對本領域技術人 員是熟知的，例如使用稀釋酸或氨纖維膨脹（AFEX)法（見例如，Yang B，Wyman CE. Dilute acid and autohydrolysis pretreatment. Methods Mol Biol. 2009 ;581:103-14 ;Balan V,Bals B,Chundawat SP, Marshall D, Dale BE, Lignocellulosic biomass pretreatment using AFEX Methods Mol Biol. 2009;581:61-77)。其他用于將生物質多聚體解聚為單體 糖的方法對本領域技術人員是熟知的，并且預期會在本發(fā)明的一些實施方式中使用。
[0144] 在一些實施方式中，使用了稀釋酸法對含有不可發(fā)酵糖的生物質原料進行預處 理，將不可發(fā)酵糖解聚為單體的可發(fā)酵糖。在一些實施方式中，在適度溫和的溫度下用稀釋 的硫酸對生物質處理一段限定的時間。例如，在一些實施方式中，用大約〇. 5%、大約1%、 大約2 %、大約3 %、大約4 %、大約5 %或大約6 %的硫酸對生物質進行處理。在一些實施方 式中，在大約30°C、大約37°C、大約40°C、大約50°C、大約60°C、大約70°C、大約80°C、大約 90°C、大約 100°C、大約 1KTC、大約 120°C、大約 130°C、大約 140°C、大約 150°C、大約 175°C、 大約200°C或大約200°C以上的溫度下對生物質進行處理。
[0145] 在一些實施方式中，所得的水解物含有不溶的木質素及溶解的纖維素和半纖維素 多聚物。后者產(chǎn)物可使用本領域技術人員熟知的方法進一步處理，如使用纖維素酶或其他 水解酶處理生產(chǎn)六碳糖和五碳糖，如葡萄糖和木糖單體。在一些實施方式中，用稀釋酸對 不可發(fā)酵糖進行預處理導致一些副產(chǎn)品的生成，包括毒性化合物，其抑制沒有根據(jù)本發(fā)明 的方面進行工程改造的微生物的生長、降低其活力且/或抑制其的生物燃料或生物燃料生 產(chǎn)。在一些實施方式中，用有助于微生物生長、生物燃料或生物燃料生產(chǎn)的基質對預處理過 的原料進行洗滌和補充，且/或對原料過石灰（over-limed)以脫毒。
[0146] 在一些實施方式中，使用AFEX法對含有不可發(fā)酵糖的生物質原料預處理以將不 可發(fā)酵糖解聚成單體可發(fā)酵糖。在一些實施方式中，在高溫高壓下用液態(tài)氨對生物質進行 一段限定時間的處理。在一些實施方式中，對生物質的處理為大約10分鐘、大約20分鐘、大 約30分鐘、大約40分鐘、大約50分鐘、大約60分鐘、大約70分鐘、大約80分鐘、大約90分 鐘或更長。在一些實施方式中，在大約30°C、大約37°C、大約40°C、大約50°C、大約60°C、大 約70°C、大約80°C、大約90°C、大約KKTC、大約1KTC、大約120°C、大約130°C、大約140°C、 大約150°C、大約175°C、大約200°C或大約200°C以上的溫度下對生物質進行處理。在一些 實施方式中，AFEX預處理使原料中所含的結晶纖維素轉化為無定形、可發(fā)酵的形式。在一 些實施方式中，經(jīng)過AFEX預處理的生物原料不含有顯著量的抑制微生物生長和/或生物燃 料或生物燃料生產(chǎn)的毒性副產(chǎn)品，并且不經(jīng)過預先的脫毒步驟就可以用作微生物生物燃料 或生物燃料生產(chǎn)。
[0147] 在一些實施方式中，經(jīng)過或不經(jīng)過預處理的生物質原料，都用水解或解聚糖多聚 物的酶進行處理，例如使用纖維素酶或半纖維素酶進行處理。在一些實施方式中，將原料與 所述酶在液相中接觸，并在允許酶催化解聚或水解反應的溫度下孵育一段時間，時間足以 水解或解聚生物質原料中顯著量的不可發(fā)酵糖或纖維。在一些實施方式中，在孵育進行水 解和解聚后，通過例如離心的方法將原料與酶接觸的液相（含有可溶的、可發(fā)酵糖部分）與 包含不可發(fā)酵糖和纖維的固相相分離。在一些實施方式中，隨后將原料的液體部分與微生 物，例如本文的一些方面提供的微生物接觸，以轉化為生物燃料或生物燃料前體。在一些實 施方式中，不可發(fā)酵糖或纖維的酶轉化是在綜合的生物過程中進行的，例如，所產(chǎn)生的可發(fā) 酵糖向生物燃料或生物燃料前體的微生物轉化過程也在同時且/或在同一個反應器中發(fā) 生。在一些實施方式中，首先進行酶轉化，隨后將接觸了酶的原料與用于生物燃料或生物燃 料前體生產(chǎn)的微生物接觸.在一些實施方式中，酶和微生物轉化在同時且在同一個反應器 中進行。
[0148] 在一些實施方式中，如本文提供的工程改造的微生物例如過表達DGA1、ACC1和/ 或S⑶基因產(chǎn)物的解脂耶氏酵母，以醋酸鹽為主要碳源生長。在一些實施方式中，微生物 生長的溶液中醋酸濃度為大約1 %、大約2%、大約3%、大約4%、大約5%、大約6%、大約 7%、大約 8%、大約 9%、大約 10% vol/vol、大約 20% vol/vol、大約 25% vol/vol,或大約 30% vol/vol。在一些實施方式中，醋酸鹽的濃度為3%-10% wt/vol之間。在一些實施方 式中，將包含如本文提供的遺傳修飾的微生物并以醋酸鹽或醋酸為主要碳源的細胞培養(yǎng)物 與甘油接觸或"穿刺（spike)"混入甘油。在一些實施方式中，間歇地將遺傳修飾的微生物 與甘油接觸。在一些實施方式中，連續(xù)或半連續(xù)地將微生物與甘油接觸。在一些實施方式 中，將微生物與濃度為大約0. 5%、大約1 %、大約2%、大約3%、大約4%或大約5% vol/ vol的甘油接觸。將本文提供的工程改造的微生物與甘油接觸為TAG的生產(chǎn)提供代謝物，并 為由碳水化合物生產(chǎn)脂肪酸提供還原性部分。在一些實施方式中，甘油穿刺是在使用了醋 酸鹽之外的碳源，例如任何本文描述的碳源的物燃料或生物燃料生產(chǎn)方法中進行的。
[0149] 在一些實施方式中，如本文提供的工程改造的微生物，例如過表達DGA1基因產(chǎn) 物，且/可選地表達ACC1和/或S⑶基因產(chǎn)物的解脂耶氏酵母是在碳源例如醋酸鹽或醋酸 上生長的，在生長過程中或培養(yǎng)階段可以得到更新（replenished)，例如在培養(yǎng)一定時間段 之后例如8小時后、24小時后或48小時后通過將微生物與添加量的碳源或與一定量的此外 的碳源接觸而更新。在一些實施方式中，如本文提供的工程改造的微生物在包含低碳氮（C/ N)比的培養(yǎng)基中起始培養(yǎng)第一個6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72小時，例如(：/^ 比率為大約10、大約20、大約25、大約30、低于大約30、低于25或低于20。在一些實施方 式中，低C/N比率是通過向培養(yǎng)基中補充氮源實現(xiàn)的，如補充氨以達到所需的C/N比率。在 一些實施方式中，例如在其中碳源（例如醋酸鹽或醋酸）加料于如本文所述的產(chǎn)油微生物 培養(yǎng)物的實施方式中，在碳源中補充了氮源，如氨。在一些實施方式中，在起始培養(yǎng)一段時 間后停止用氮源進行補充，例如在培養(yǎng)的第一個6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72 小時之后，由此使得培養(yǎng)物中工程改造的微生物能消耗氮源，這樣進而增加了 C/N比率。C/ N比率的這一變化可通過向沒有補充氮源的培養(yǎng)物中加料額外的碳源，例如通過加料不補 充氨或任何其他氮源的醋酸或醋酸鹽而得到增強或加速。在一些實施方式中，本文描述的 工程改造的微生物進行油生產(chǎn)的優(yōu)化的C/N比率在80-120的范圍內(nèi)。
[0150] 在一些實施方式中，用于大規(guī)模微生物介導的碳水化合物向脂質轉化的發(fā)酵過程 可在反應器中施行。如本文所使用的，術語"生物反應器"和"發(fā)酵罐"在本文交換使用，指 的是封閉或部分封閉的空間，其中發(fā)生生物學和/或化學反應，所述反應至少有一部分涉 及活體生物或活體生物的一部分。"大規(guī)模生物反應器"或"工業(yè)規(guī)模反應器"是用于在商 業(yè)或準商業(yè)規(guī)模上生成產(chǎn)品如生物燃料或生物燃料前體（如脂肪酸和/或TAG)的反應器。 大規(guī)模生物反應器通常具有的容積在升、數(shù)百升、數(shù)千升或者更大的范圍內(nèi)。
[0151] 根據(jù)本發(fā)明的某些方面的生物反應器可包含微生物或微生物培養(yǎng)物。在一些實施 方式中，生物反應器可包含本發(fā)明的某些方面提供的任意微生物的孢子和/或任意種類的 休眠細胞類型，例如干粉狀態(tài)的細胞。在一些實施方式中，將合適的碳水化合物源加入這樣 的生物反應器可導致休眠細胞的活化，例如導致酵母孢子的出牙并隨后至少部分地將碳水 化合物源轉化為生物燃料或生物燃料前體。
[0152] 根據(jù)本發(fā)明的某些方面的一些生物反應器可包括細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其中微生物與移 動的液體和/或氣泡接觸。根據(jù)本發(fā)明的某些方面的微生物或微生物培養(yǎng)物可懸浮生長或 貼附于固相載體而生長。載體細胞的非限制性實例包括微載體（例如聚合物球、微珠以及 微盤，可以為多孔或無孔的）、負荷特異性化學基團（例如季銨基團）的交聯(lián)珠子（例如葡 聚糖）、2D微載體（包括捕獲在非多孔多聚物纖維中的細胞）、3D微載體（例如載體纖維、 中空纖維、多管反應器、和可包含多孔纖維的半透膜）、離子交換能力減弱的微載體、膠囊細 胞、毛細管以及絮凝物。載體可由物質如葡聚糖、明膠、玻璃和纖維素制造。
[0153] 根據(jù)本發(fā)明方面的工業(yè)規(guī)模的碳水化合物向脂質轉化的過程可以連續(xù)、半連續(xù)或 非連續(xù)的模式操作。根據(jù)本發(fā)明的操作模式的非限制性實例為批式、補料批式、延長批式、 重復批式、取出/注滿、旋轉壁、轉瓶和/或灌注的操作模式。
[0154] 在一些實施方式中，可使用允許底物原料如碳水化合物源的連續(xù)或半連續(xù)更新， 和/或產(chǎn)物如分泌的脂質、包含脂質的有機相和/或顯示了所需的脂質含量的細胞與反應 器進行連續(xù)或半連續(xù)分離的生物反應器。
[0155] 根據(jù)本發(fā)明的生物反應器的非限制性實例為：攪拌槽發(fā)酵罐、由旋轉混合設備攪 拌的生物反應器、恒化器、由振蕩設備攪拌的生物反應器、氣升式發(fā)酵罐、堆積床反應器、固 定床反應器、流化床反應器、采用波式誘導攪拌的生物反應器、離心式生物反應器、滾瓶以 及中空纖維生物反應器、滾輪設備（例如臺式設備、載車式設備和/或自動控制的這些種 類）、垂直堆放的平板、轉瓶、攪拌或搖瓶、振蕩的多孔板、MD瓶、T-瓶、Roux瓶、多表面組織 培養(yǎng)繁殖器、修飾的發(fā)酵罐以及包被的珠子（例如，由血清蛋白質、硝酸纖維素或羧甲基纖 維素包被珠子以防止細胞附著）。
[0156] 根據(jù)本發(fā)明的方面的生物反應器和發(fā)酵罐可選地包含感受器和/或控制系統(tǒng)以 測量和/或調(diào)整反應參數(shù)。反應參數(shù)的非限制性實例為：生物學參數(shù)例如生長速率、細胞大 小、細胞數(shù)量、細胞密度、細胞類型或細胞狀態(tài)，化學參數(shù)如pH、氧化還原勢能、反應底物和 /或產(chǎn)物的濃度、溶解氣體的濃度如氧氣濃度和co2濃度、營養(yǎng)物濃度、代謝物濃度、葡萄糖 濃度、谷氨酰胺濃度、丙酮酸濃度、磷石灰濃度、寡肽的濃度、氨基酸的濃度、維生素的濃度、 激素的濃度、添加劑的濃度、血清濃度、離子強度、離子的濃度、相對濕度、摩爾濃度、滲透 壓、其他化學物例如緩沖試劑、佐劑或反應副產(chǎn)物的濃度，物理/機械參數(shù)如密度、電導率、 攪拌度、壓力和流速、剪切力、剪切速率、粘度、顏色、渾濁度、光吸收、混合速率、轉化率以及 熱動力學參數(shù)如溫度、光強度/質量等等。
[0157] 機械和電子領域的相關技術人員對能夠測量如本文所述的參數(shù)的傳感器是熟知 的。能夠基于如本文所描述的傳感器的輸入信號調(diào)整反應器中參數(shù)的控制系統(tǒng)對生物反應 器工程領域的技術人員是熟知的。
[0158] 根據(jù)本發(fā)明的某些方面的用于向生物燃料或生物燃料前體轉化所采用的碳源類 型取決于所采用的特定微生物。本發(fā)明的某些方面提供的一些微生物能夠有效地轉化特定 的碳水化合物源，但是相同的微生物可不能高效地加工不同的碳水化合物來源或根本無法 加工。根據(jù)本發(fā)明的方面，例如產(chǎn)油酵母解脂耶氏酵母能有效地將糖類如葡萄糖、果糖、蔗 糖和/或乳糖，及富含糖類的碳水化合物，例如糖蜜和植物纖維轉化為脂肪酸及其衍生物。
[0159] 在一些實施方式中，由碳源原料生成的生物燃料或生物燃料前體如脂肪酸或三酰 基甘油是由本發(fā)明的某些方面提供的微生物例如產(chǎn)油酵母如解脂耶氏酵母細胞分泌的，或 至少由其分泌的。在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的某些方面的微生物與在生物反應器中 的水溶液中的碳水化合物源接觸，并且分泌的生物燃料或生物燃料前體形成了可以與水相 相分離的有機相。如本文使用的，術語有機相指的是包含非極性、有機化合物例如脂肪酸、 TAG和/或其他非極性脂質的液相。根據(jù)本發(fā)明的有機相可以進一步含有微生物、碳水化 合物或在相應生物反應器中其他相的中發(fā)現(xiàn)的其他化合物。用于進行工業(yè)規(guī)模的相分離的 方法對本領域一般技術人員是熟知的。在一些實施方式中，有機相是持續(xù)或半持續(xù)虹吸出 去。在一些實施方式中，采用了包含分離器的生物反應器，分離器能夠連續(xù)或半連續(xù)地萃取 有機相。
[0160] 在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的某些方面，生物燃料或生物燃料前體在細胞中 積累。在一些實施方式中，例如通過離心、沉淀或過濾的方式，連續(xù)或半連續(xù)地將積累了所 需量的生物燃料或生物燃料前體的細胞從生物反應器中分離。細胞分離可進一步例如基于 細胞物理特征如細胞大小或密度，通過本領域技術人員熟知的方法實現(xiàn)。隨后可使用本領 域技術人員熟知的標準萃取方法如溶劑正己烷萃取法，從相應的細胞中萃取積累的生物燃 料或生物燃料前體。在一些實施方式中，以3倍于所收集的細胞體積的正己烷收集和萃取 微生物細胞。在一些實施方式中，對萃取的生物燃料或生物燃料前體進行進一步的精煉。在 一些實施方式中，使用本領域技術人員熟知的方法例如酯交換步驟將生物燃料前體如三酰 基甘油轉化為生物燃料如生物柴油。
[0161] 本發(fā)明的這些和其他實施方式的功能和優(yōu)勢將從下文實施例得到更全面的理解。 以下實施例意欲闡述本發(fā)明的益處，但并未示例說明本發(fā)明的全部范圍。因此，要理解的是 實施例章節(jié)不意欲限制本發(fā)明的范圍。 實施例
[0162] 實施例1.
[0163] 材料和方法
[0164] 酵母菌株、生長及培養(yǎng)條件
[0165] 用于本研究的解脂耶氏酵母菌株來自野生型解脂耶氏酵母W29菌株 (ATCC20460)。用于所有轉化的營養(yǎng)缺陷型Polg(Leu-)獲自Yeastern Biotech公司 (Taipei, Taiwan)。本研究使用的所有菌株列于表1。
[0166] 表1.解脂耶氏酵母菌株的總脂肪酸含量、產(chǎn)率和分布。50mL培養(yǎng)物在100小時之 后的總脂肪酸含量表示為平均值土S.D. (n = 3)(C/N摩爾比率為20)。脂肪酸譜表示為脂 肪酸相對于總脂肪酸的百分比，誤差低于2. 5%。
[0167]
【權利要求】
1. 分離的產(chǎn)油細胞，其包含增加 DGA1基因產(chǎn)物的表達的遺傳修飾。
2. 權利要求1的分離的產(chǎn)油細胞，其進一步包含增加 ACC1基因產(chǎn)物的表達的遺傳修 飾。
3. 權利要求1或權利要求2的分離的產(chǎn)油細胞，其進一步包含增加 SCD基因產(chǎn)物的表 達的遺傳修飾。
4. 權利要求1-3的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其進一步包含增加 ACL基因產(chǎn)物的表 達的遺傳修飾。
5. 權利要求1-4的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中的遺傳修飾包含增加基因產(chǎn)物表 達的核酸構建體，所述核酸構建體包含 (a) 包含在合適的同源或異源啟動子的控制下的、編碼基因產(chǎn)物的核酸序列的表達盒， 及/或 (b) 當插入細胞基因組時，調(diào)制基因產(chǎn)物的表達水平的核酸序列。
6. 權利要求5的分離的產(chǎn)油細胞，其中啟動子為誘導型或組成型啟動子。
7. 權利要求5或權利要求6的分離的產(chǎn)油細胞，其中啟動子為TEF啟動子。
8. 權利要求5-7的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中表達構建體進一步包含內(nèi)含子。
9. 權利要求8的分離的產(chǎn)油細胞，其中內(nèi)含子位于轉錄起始位點的下游。
10. 權利要求8或權利要求9的分離的產(chǎn)油細胞，其中內(nèi)含子是在編碼基因產(chǎn)物的核酸 序列之內(nèi)。
11. 權利要求1-10的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中核酸構建體抑制或破壞對編碼 基因產(chǎn)物的原生基因的天然調(diào)控，導致原生基因的過表達。
12. 權利要求11的分離的產(chǎn)油細胞，其中對原生基因的天然調(diào)控的抑制或破壞是通過 對調(diào)控所述基因表達的調(diào)控區(qū)域或調(diào)控區(qū)域的部分進行刪除、破壞、突變和/或置換而介 導的。
13. 權利要求1-12的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中基因產(chǎn)物是轉錄物。
14. 權利要求1-13的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中基因產(chǎn)物為蛋白質。
15. 權利要求5-14的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中核酸構建體插入細胞的基因組 內(nèi)。
16. 權利要求1-15的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中基因產(chǎn)物的表達增加賦予細胞 將碳源向脂肪酸、脂肪酸衍生物和/或甘油三酯（TAG)轉化的有益表型。
17. 權利要求16的分離的產(chǎn)油細胞，其中有益表型包括修飾的脂肪酸譜、修飾的TAG 譜、增加的脂肪酸和/或甘油三酯合成速率、增加的轉化產(chǎn)率、增加的細胞中甘油三酯積累 及/或增加的細胞脂質體中甘油三酯的積累。
18. 權利要求16或17的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同 細胞類型的未修飾細胞增加至少2倍。
19. 權利要求18的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同類型 細胞類型的未修飾細胞增加至少5倍。
20. 權利要求18的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞的脂肪酸或TAG的合成速率比相同類型 細胞類型的未修飾細胞增加至少10倍。
21. 權利要求16-20的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞將碳源轉化為脂肪酸或 TAG的轉化率在大約0. 025g/g-大約0. 32g/g (產(chǎn)生的TAG g/消耗的葡萄糖g)的范圍內(nèi)。
22. 權利要求21的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞將碳源轉化為脂肪酸或TAG的轉化率為 至少大約0. llg/g。
23. 權利要求22的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞將碳源轉化為脂肪酸或TAG的轉化率為 至少大約〇· 195g/g。
24. 權利要求23的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞將碳源轉化為脂肪酸或TAG的轉化率為 至少大約0. 24g/g。
25. 權利要求24的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞將碳源轉化為脂肪酸或TAG的轉化率為 至少大約0. 27g/g。
26. 權利要求1-25的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞包含脂質小體或液泡。
27. 權利要求1-26的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞為細菌細胞、藻類細胞、真 菌細胞或酵母細胞。
28. 權利要求1-27的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞為產(chǎn)油酵母細胞。
29. 權利要求1-28的任何一項的分離的產(chǎn)油細胞，其中細胞為解脂耶氏酵母細胞。
30. 培養(yǎng)物，其包含權利要求1-29的任何一項的產(chǎn)油細胞。
31. 權利要求30的培養(yǎng)物，其進一步包含碳源。
32. 權利要求31的培養(yǎng)物，其中碳源包含可發(fā)酵糖。
33. 權利要求32的培養(yǎng)物，其中可發(fā)酵糖為C6糖。
34. 權利要求33的培養(yǎng)物，其中碳源包含葡萄糖。
35. 權利要求31-34的任何一項的培養(yǎng)物，其中碳源包含有機酸。
36. 權利要求35的培養(yǎng)物，其中有機酸為醋酸。
37. 權利要求36的培養(yǎng)物，其中醋酸的濃度為至少5% vol/vol、至少10% vol/vol、至 少 15% vol/vol、至少 20% vol/vol、至少 25% vol/vol 或至少 30% vol/vol。
38. 權利要求31-37的任何一項的培養(yǎng)物，其中碳源包含醋酸。
39. 權利要求38的培養(yǎng)物，其中醋酸鹽的濃度為至少1% vol/vol。
40. 權利要求38的培養(yǎng)物，其中醋酸鹽的濃度為至少2% vol/vol。
41. 權利要求38的培養(yǎng)物，其中醋酸鹽的濃度為至少3% vol/vol。
42. 權利要求38的培養(yǎng)物，其中醋酸鹽的濃度為至少4% vol/vol。
43. 權利要求38的培養(yǎng)物，其中醋酸鹽的濃度為至少5% vol/vol。
44. 權利要求30-43的任何一項的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物包含甘油。
45. 權利要求44的培養(yǎng)物，其中甘油濃度為大約2% vol/vol。
46. 權利要求30-45的任何一項的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物包含溶解氧水平為至少5%、至 少10%、至少15%或至少20%。
47. 權利要求30-46的任何一項的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物顯示的pH在pH7. 0-pH7. 5的范 圍內(nèi)。
48. 權利要求30-47的任何一項的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物包含硫酸銨。
49. 權利要求48的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物包含以1:2比率的硫酸銨和醋酸。
50. 權利要求30-49的任何一項的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物顯示5g/l-60g/l之間的脂質滴 度。
51. 權利要求30-50的任何一項的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物顯示0. 04g/l/h-0. 60g/l/h之間 的脂質生廣。
52. 權利要求30-51的任何一項的培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物顯示0. lg/1/h-lg/l/h之間的最 大脂質生產(chǎn)效率。
53. 方法，其包含 將碳源與分離的產(chǎn)油細胞接觸，所述細胞包含增加 DGA1基因產(chǎn)物的表達的遺傳修飾； 以及 將碳源與細胞接觸在適合細胞將至少部分碳源轉化為脂肪酸或甘油三酯的條件下進 行孵育。
54. 權利要求53的方法，其中產(chǎn)油細胞進一步包含增加 ACC1基因產(chǎn)物的表達的遺傳修 飾。
55. 權利要求53或權利要求54的方法，其中產(chǎn)油細胞進一步包含增加 SCD基因產(chǎn)物的 表達的遺傳修飾。
56. 權利要求53-55的任何一項的方法，其中產(chǎn)油細胞進一步包含增加 ACL基因產(chǎn)物的 表達的遺傳修飾。
57. 權利要求53-56的任何一項的方法，其中分離的產(chǎn)油細胞是權利要求1-27中任何 一項的分離的產(chǎn)油細胞。
58. 權利要求53-57的任何一項的方法，其中碳源包含可發(fā)酵糖。
59. 權利要求58的方法，其中碳源包含葡萄糖。
60. 權利要求53-59的任何一項的方法，其中碳源包含醋酸鹽。
61. 權利要求60的方法，其中醋酸鹽的濃度為至少1% vol/vol。
62. 權利要求60的方法，其中醋酸鹽的濃度為至少2% vol/vol。
63. 權利要求60的方法，其中醋酸鹽的濃度為至少3% vol/vol。
64. 權利要求60的方法，其中醋酸鹽的濃度為至少4% vol/vol。
65. 權利要求60的方法，其中醋酸鹽的濃度為至少5% vol/vol。
66. 權利要求53-65的任何一項的方法，其中碳源包含醋酸。
67. 權利要求66的方法，其中醋酸的濃度為至少5% vol/vol、至少10% vol/vol、至少 15% vol/vol、至少 20% vol/vol、至少 25% vol/vol 或至少 30% vol/vol。
68. 權利要求53-67的任何一項的方法，其中方法包括將細胞與溶解氧接觸，其中溶解 氧水平為至少5%、至少10%、至少15%，或至少20%。
69. 權利要求53-68的任何一項的方法，其中的接觸和/或孵育是在pH7. 0-pH7. 5的 pH范圍內(nèi)進行的。
70. 權利要求53-69的任何一項的方法，其中的方法包括將細胞與硫酸銨接觸。
71. 權利要求70的方法，其中方法包括將細胞與比率為1:2的硫酸銨和醋酸接觸。
72. 權利要求53-71的任何一項的方法，其中方法進一步包含將細胞與甘油接觸。
73. 權利要求72的方法，其中方法包括將細胞與濃度為大約2% vol/vol的甘油接觸。
74. 權利要求53-73的任何一項的方法，其中與分離的產(chǎn)油細胞接觸的碳源在反應器 中進行孵育。
75. 權利要求53-74的任何一項的方法，其中將碳源與分離的產(chǎn)油細胞接觸，并在分批 補料過程中進行孵育，使碳源轉化為脂肪酸或甘油三酯。
76. 權利要求53-75的任何一項的方法，其中將碳源與分離的產(chǎn)油細胞接觸，并在連續(xù) 過程中進行孵育，使碳源轉化為脂肪酸或甘油三酯。
77. 權利要求53-76的任何一項的方法，其進一步包括在孵育步驟中一次或多次地將 額外量的碳源或一定量的額外碳源與接觸分離的產(chǎn)油細胞的碳源進行接觸。
78. 權利要求53-77的任何一項的方法，其中通過溶劑萃取法從接觸分離的產(chǎn)油細胞 的碳源中萃取脂肪酸或甘油三酯。
79. 權利要求78的方法，其中溶劑萃取包括氯仿甲醇萃取。
80. 權利要求78的方法，其中溶劑萃取包括正己烷萃取。
81. 權利要求53-80的任何一項的方法，其中將脂肪酸或甘油三酯與接觸分離的產(chǎn)油 細胞的碳源分離，并隨后通過酯交換反應進行精煉。
82. 方法，其包括通過增加細胞中DGA1基因產(chǎn)物的表達以在產(chǎn)油細胞中修飾脂肪酸 譜、甘油三酯譜、脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍生物積累的程度、脂肪酸衍 生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化率、和/或碳水化合物向脂肪 酸或脂肪酸衍生物轉化的有效產(chǎn)率。
83. 權利要求82的方法，其進一步包括增加細胞中ACC1基因產(chǎn)物的表達。
84. 權利要求82或權利要求83的方法，其進一步包括增加細胞中SCD基因產(chǎn)物的表達
85. 權利要求82-84的任何一項的方法，其進一步包括增加細胞中ACL基因產(chǎn)物的表 達。
86. 權利要求82-85的任何一項的方法，其中脂肪酸衍生物積累的程度是脂肪酸衍生 物在脂質小體中積累的程度。
87. 權利要求82-86的任何一項的方法，其中脂肪酸衍生物為甘油三酯。
88. 權利要求82-87的任何一項的方法，其中對產(chǎn)油細胞中脂肪酸譜、甘油三酯譜、月旨 肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪酸衍生物積累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳 水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化率、和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物 轉化的有效產(chǎn)率的修飾包含增加產(chǎn)油細胞中的脂肪酸合成速率、甘油三酯合成速率、脂肪 酸衍生物積累的程度、脂肪酸衍生物分泌速率、碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉 化率、和/或碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物轉化的有效產(chǎn)率。
89. 權利要求88的方法，其中對細胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化效 率的修飾包含使轉化效率增加至少2倍。
90. 權利要求88的方法，其中對細胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化效 率的修飾包含使轉化效率增加至少3倍。
91. 權利要求88的方法，其中對細胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化效 率的修飾包含使轉化效率增加至少4倍。
92. 權利要求88的方法，其中對細胞中碳水化合物向脂肪酸或脂肪酸衍生物的轉化效 率的修飾包含使轉化效率增加至少5倍。
93. 權利要求82-92的任何一項的方法，其中細胞為酵母細胞。
94. 權利要求93的方法，其中酵母細胞為耶氏酵母屬細胞。
95. 權利要求94的方法，其中產(chǎn)油酵母為解脂耶氏酵母。
96. 分離的核酸分子，其包含： a) 編碼SEQ ID N0:2(解脂耶氏酵母DGA1)的核苷酸序列，或 b) 與a)的核苷酸序列至少85%相同的核苷酸序列。
97. 權利要求96的分離的核酸分子，其中編碼SEQ ID NO: 2的核苷酸序列包含SEQ ID N0:1。
98. 表達盒，其包含權利要求96或97的分離的核酸分子以及異源啟動子。
99. 權利要求98的表達盒，其中啟動子為組成型啟動子或誘導型啟動子。
100. 權利要求99的表達盒，其中異源啟動子為翻譯延長因子（TEF)啟動子。
101. 權利要求98-100的任何一項的表達盒，其中異源啟動子包含內(nèi)含子。
102. 權利要求98-101的任何一項的表達盒，其中異源啟動子進一步包含起始密碼子。
103. 權利要求102的表達盒，其中內(nèi)含子位于編碼SEQ ID NO:2的核苷酸序列的翻譯 起始位點的下游。
104. 載體，其包含權利要求98-103中任何一項的表達盒。
105. 細胞，其包含權利要求98-104中任何一項的表達盒或權利要求104的載體的至少 一部分。
【文檔編號】C12P7/64GK104160020SQ201280060959
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2012年10月19日 優(yōu)先權日:2011年10月19日
【發(fā)明者】G·斯蒂芬諾珀羅斯, M·泰, S·查克拉伯蒂 申請人:麻省理工學院