表達(dá)cd40l的哺乳動物細(xì)胞及其用途
【專利摘要】本文報道了用于在存在IL-2和IL-21的情況下共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞集合或單個放置的兔B-細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，其中表達(dá)CD40L的CHO細(xì)胞用作飼養(yǎng)細(xì)胞。
【專利說明】表達(dá)CD40L的晡乳動物細(xì)胞及其用途
[0001] 本專利申請是B-細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。本文報道了這樣的培養(yǎng)系統(tǒng)，其用于刺激和擴展兔和人來源的抗體分泌細(xì)胞，如激活的B-細(xì)胞、成漿細(xì)胞以及在存在兔或人表達(dá)CD40L的飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下從疾病中存活后免疫的兔或人分離的B-細(xì)胞。
_2] 發(fā)明背景
[0003]已經(jīng)報道，來自不同物種的分離的B-細(xì)胞、成漿細(xì)胞和漿細(xì)胞難以在體外進(jìn)行培養(yǎng)。實際上，這正常通過將原代B-細(xì)胞與雜交瘤配偶體融合產(chǎn)生無限增殖B-細(xì)胞系或無限增殖化來克服。對于兔，還開發(fā)了漿細(xì)胞瘤融合配偶體(Spieker-Polet，!!.，等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA92 (1995) 9348-9352，但是雜交瘤技術(shù)在兔中不能很好地運行。對于兔B-細(xì)胞在體外的持續(xù)存活，提供必要的激活刺激劑和存活因子是必需的。已經(jīng)描述了多種化 合物，如IL-2、IL-4、IL-1O及其他(參見例如Zubler，R.，等，Eur.J.1mmunol.14 (1984) 357-363 和 J.Exp.Med.160 (1984) 1170-1183)。
[0004]在生理學(xué)上，B-細(xì)胞在遭遇特異抗原加例如通過⑶40/⑶40L途徑(綜述于Neron, S.，等，Arch.1mmunol.Ther.Exp.59 (2011) 25-40)和 / 或通過來自天然背景的細(xì)胞因子和/或生長因子，例如通過樹狀突細(xì)胞或T細(xì)胞輔助的額外激活后被激活。
[0005]在體外系統(tǒng)中，可以通過與EL4-B5胸腺瘤細(xì)胞的共培養(yǎng)或添加可溶性的或固定化的抗⑶40抗體或⑶40L模擬⑶40/⑶40L的相互作用。僅有的系統(tǒng)缺少足夠的效力并且僅描述了與使用不同飼養(yǎng)混合物(例如Zubler混合物；IL_4、IL-10等)(Zubler, R.,上文)或胸腺細(xì)胞上清液(TSN)的其他所需刺激劑的組合。
[0006]ffeitkamp, J-H.,等，(J.1mmunol.Meth.275 (2003) 223-237)報道了針對來自利用熒光病毒樣顆粒選擇的單個抗原特異性B-細(xì)胞的輪狀病毒產(chǎn)生重組人單克隆抗體。在US2006/0051348中報道了針對多個近親抗原產(chǎn)生多個分離抗體的方法。在W02008/144763和TO2008/045140中分別報道了針對IL-6的抗體及其用途，以及用于獲得抗原特異性B-細(xì)胞的克隆群體的培養(yǎng)方法。在US2007/0269868中報道了用于獲得抗原特異性B-細(xì)胞的克隆群體的培養(yǎng)方法。Masri等(在Mol.1mmunol.44 (2007) 2101-2106中)報道了從針對炭疽毒素的單個人淋巴細(xì)胞中獲得的功能性Fab片段在大腸桿菌(E.coli)中的克隆與表達(dá)。在W02007/031550中報道了用于制備免疫球蛋白文庫的方法。
[0007]在W02009/10515中報道了制備表達(dá)有用的抗體的雜交細(xì)胞的方法。在W02008/085878中報道了中和葡萄球菌(Staphylococcus)腸毒素B的高親和力抗體。Amanna, 1.J.和Slifka，M.K.報道了通過兩種獨立的且互補的方法定量稀有的記憶B-細(xì)胞群體(J.1mmunol.Meth.317 (2006) 175-185)。在 W02011/052545 中報道了用于產(chǎn)生抗原特異性B-細(xì)胞群體的方法。
[0008]發(fā)明概沭
[0009]本文報道了用于從兔(或人)B_細(xì)胞開始快速、有效并可重復(fù)地產(chǎn)生兔(或人)抗體并包括至少一個培養(yǎng)步驟的新方法。
[0010]本文進(jìn)一步報道了可以與表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞組合使用的飼養(yǎng)混合物，其提供高度有效的兔B-細(xì)胞刺激和培養(yǎng)系統(tǒng)。[0011]本文進(jìn)一步報道了可以與表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞組合使用的飼養(yǎng)混合物，其提供高度有效的人B-細(xì)胞刺激和培養(yǎng)系統(tǒng)。
[0012]如本文報道的一個方面是用于共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞的方法。
[0013]如本文報道的一個方面是用于在存在IL-2和IL-21的情況下/與其一起共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞的方法。在一個實施方案中，表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞是CHO或BHK細(xì)胞。
[0014]如本文報道的一個方面是用于共培養(yǎng)人B-細(xì)胞與表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞的方法。
[0015]如本文報道的一個方面是用于在存在IL-2和/或IL-21和/或IL_6的情況下/與其一起共培養(yǎng)人B-細(xì)胞與表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞的方法。
[0016]在一個實施方案中，表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞是BHK或CHO細(xì)胞。
[0017]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0018]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情況下。
[0019]在一個實施方案中，用于共培養(yǎng)的白細(xì)胞介素均是人白細(xì)胞介素。
[0020]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生兔抗體的方法，其包括以下步驟:培養(yǎng)分泌抗體的兔B-細(xì)胞和表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞并從培養(yǎng)上清液中回收抗體，由此產(chǎn)生兔抗體。
[0021]在一個實施方案中，表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞是CHO或BHK細(xì)胞。
[0022]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生兔抗體的方法，其包括以下步驟:在存在IL-2和IL-21的情況下/與其一起培養(yǎng)一個或多個分泌抗體的兔B-細(xì)胞和表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞并從培養(yǎng)上清液中回收抗體，由此產(chǎn)生兔抗體。
[0023]在一個實施方案中，表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞是CHO或BHK細(xì)胞。
[0024]在一個實施方案中，在培養(yǎng)開始時加入IL-2和IL-21。
[0025]在一個實施方案中，在培養(yǎng)開始時單獨加入IL-2和IL-21。
[0026]在一個實施方案中，兔B-細(xì)胞是未經(jīng)處理的或非成熟的兔B-細(xì)胞。
[0027]在一個實施方案中，所述B-細(xì)胞是IgG陽性的B-細(xì)胞(IgG+)。IgG陽性的B-細(xì)胞呈現(xiàn)可以檢測和標(biāo)記的細(xì)胞表面標(biāo)志物IgG。
[0028]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生人抗體的方法，其包括以下步驟:培養(yǎng)分泌抗體的人B-細(xì)胞和表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞并從培養(yǎng)上清液中回收抗體，由此產(chǎn)生人抗體。
[0029]在一個實施方案中，表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞是BHK或CHO細(xì)胞。
[0030]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生人抗體的方法，其包括以下步驟:在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情況下/與其一起培養(yǎng)一個或多個分泌抗體的人B-細(xì)胞和表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞并從培養(yǎng)上清液中回收抗體，由此產(chǎn)生人抗體。 [0031]在一個實施方案中，所述培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0032]在一個實施方案中，所述培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情況下。
[0033]在一個實施方案中，用于培養(yǎng)的白細(xì)胞介素均是人白細(xì)胞介素。
[0034]在一個實施方案中，表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞是BHK或CHO細(xì)胞。[0035]在一個實施方案中，在培養(yǎng)開始時加入白細(xì)胞介素。
[0036]在一個實施方案中，在培養(yǎng)開始時單獨加入白細(xì)胞介素。
[0037]在一個實施方案中，人B-細(xì)胞是成熟的人B-細(xì)胞。
[0038]在一個實施方案中，所述B-細(xì)胞是IgG陽性的B-細(xì)胞(IgG+)。IgG陽性的B-細(xì)胞呈現(xiàn)可以檢測和標(biāo)記的細(xì)胞表面標(biāo)志物IgG。
[0039]如本文報道的一個方面是包含表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞和IL_2以及IL-21的試劑盒。
[0040]如本文報道的一個方面是包含表達(dá)人⑶40L的BHK細(xì)胞和IL_2和/或IL-21和/或IL-6的試劑盒。
[0041]在一個實施方案中，所述試劑盒包含IL-2和IL-21。
[0042]在一個實施方案中，所述試劑盒包含IL-2和IL-21和IL_6。
[0043]在一個實施方案中，所述白細(xì)胞介素均是人白細(xì)胞介素。
[0044]如本文報道的 一個方面是用于共培養(yǎng)B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2或IL~21的情況下共培養(yǎng)B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0045]如本文報道的一個方面是用于共培養(yǎng)B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情況下共培養(yǎng)B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0046]如本文報道的一個方面是用于共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情況下共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0047]在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞或BHK細(xì)胞。
[0048]如本文報道的一個方面是用于共培養(yǎng)B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情況下共培養(yǎng)B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0049]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0050]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情況下。
[0051]如本文報道的一個方面是用于共培養(yǎng)人B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情況下共培養(yǎng)人B-細(xì)胞與表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0052]在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是BHK細(xì)胞或CHO細(xì)胞。
[0053]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0054]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情況下。
[0055]在一個實施方案中，用于共培養(yǎng)的白細(xì)胞介素均是人白細(xì)胞介素。
[0056]如本文報道的一個方面是用于培養(yǎng)分泌T-細(xì)胞抑制化合物的B-細(xì)胞的方法，其包括共培養(yǎng)B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0057]如本文報道的一個方面是用于培養(yǎng)分泌抗體的B-細(xì)胞的方法，其以以下順序包括
[0058]i)在存在促有絲分裂刺激劑的情況下B-細(xì)胞與表達(dá)CD40L的哺乳動物細(xì)胞的第
一步次培養(yǎng)，和
[0059]ii)在存在抗體產(chǎn)生刺激劑的情況下B-細(xì)胞與表達(dá)CD40L的哺乳動物細(xì)胞的隨后
第二次共培養(yǎng)。
[0060]在一個實施方案中，所述第一次和第二次共培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)容器中進(jìn)行。
[0061]在一個實施方案中，用于培養(yǎng)分泌抗體的B-細(xì)胞的方法包括共培養(yǎng)B-細(xì)胞與表達(dá)CD40L的哺乳動物細(xì)胞，由此向培養(yǎng)中加入第一種促有絲分裂刺激劑，然后向所述培養(yǎng)中加入抗體產(chǎn)生刺激劑。
[0062]在一個實施方案中，在加入促有絲分裂刺激劑后至少一小時加入抗體產(chǎn)生刺激劑。在一個實施方案中，在向培養(yǎng)中加入促有絲分裂刺激劑后一至三天加入抗體產(chǎn)生刺激劑。
[0063]在一個實施方案中，所述促有絲分裂刺激劑選自⑶40-和⑶40L相互作用的化合物、ICOS-和 ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白細(xì)胞介素-1 ( α / β )、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素_5、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-14、白細(xì)胞介素-21、SAP (信號傳遞淋巴細(xì)胞激活分子[SLAM]相關(guān)蛋白質(zhì))、葡萄球菌A菌株Cowanl顆粒(SAC ;熱殺死的、福爾馬林固定的)、TLR配體如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、腫瘤壞死因子(TNF) α、1型干擾素(例如IFNa/β)，和II型干擾素(例如IFN Y )。還可以通過抗IgG、抗⑶20和/或抗⑶27抗體誘導(dǎo)B-細(xì)胞激活。 [0064]在一個實施方案中，所述抗體產(chǎn)生刺激劑選自⑶40-和⑶40L相互作用的化合物、ICOS-和 ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF, CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCLl3,CXCL16、Flt-3L、白細(xì)胞介素-1 ( a / β )、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素_5、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素_9、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-13、白細(xì)胞介素-21、白細(xì)胞介素-33、SAP(信號傳遞淋巴細(xì)胞激活分子[SLAM]相關(guān)蛋白質(zhì))、葡萄球菌A菌株Cowanl顆粒(SAC ;熱殺死的、福爾馬林固定的)、TLR配體如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、腫瘤壞死因子(TNF) α、I型干擾素(例如IFN α / β )，和II型干擾素(例如IFN Y )。還可以通過抗IgG、抗⑶20和/或抗⑶27抗體誘導(dǎo)B-細(xì)胞刺激。
[0065]在一個實施方案中，在第一次共培養(yǎng)開始時加入促有絲分裂刺激劑。
[0066]在一個實施方案中，在第一次共培養(yǎng)開始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天加入所述促有絲分裂刺激劑。
[0067]在一個實施方案中，在加入促有絲分裂刺激劑后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14天后加入抗體產(chǎn)生刺激劑。
[0068]在一個實施方案中，共培養(yǎng)中的每一次進(jìn)行5-14天。
[0069]在一個實施方案中，培養(yǎng)5-21天的總時長。在一個實施方案中，培養(yǎng)6-14天的總時長。
[0070]在一個實施方案中，在第二次共培養(yǎng)開始前去除促有絲分裂刺激劑。在一個實施方案中，通過交換培養(yǎng)上清液和或用中性培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞進(jìn)行去除。
[0071]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗原的抗體的方法，其包括以下步驟:
[0072]a)共培養(yǎng)放置的(cbposite)分泌抗體的B-細(xì)胞集合或單個B-細(xì)胞與表達(dá)CD40L的哺乳動物細(xì)胞，
[0073]b)分離編碼特異性結(jié)合抗原的抗體的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列之核酸并分離編碼所述抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列之核酸，
[0074]c)培養(yǎng)包含在一個或多個表達(dá)盒中含有b)中分離的核酸或其編碼輕鏈和/或重鏈可變域的人源化形式的變體的細(xì)胞，[0075]d)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
[0076]在一個實施方案中，共培養(yǎng)是在存在促有絲分裂刺激劑和/或抗體產(chǎn)生刺激劑的情況下。
[0077]在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0078]a)提供分泌抗體的(成熟的)B-細(xì)胞群體(其獲得自實驗動物或人的血液)，
[0079]b)用至少一種熒光染料(在一個實施方案中用1-3，或2-3種熒光染料)染色B-細(xì)胞群體的細(xì)胞，
[0080]c)將B-細(xì)胞染色群體的單個細(xì)胞或來自B-細(xì)胞染色群體的細(xì)胞集合放置在單獨的容器中(在一個實施方案中是這樣的容器，其為多孔平板的一個孔)，
[0081]d)在存在表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞和任選地IL-2和/或IL-21和/或IL_6的情況下培養(yǎng)放置的單獨B-細(xì)胞，
[0082]e)測定在單獨的B-細(xì)胞的培養(yǎng)中分泌的抗體的結(jié)合特異性，
[0083]f)通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測序測定特異性結(jié)合的抗體的可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并由此獲得單克隆抗體可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的編碼核酸，
[0084]g)在表達(dá)盒中引入單克隆抗體輕鏈和重鏈可變域的編碼核酸用于表達(dá)抗體，
[0085]h)在細(xì)胞中引入核酸，
[0086]i)培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
[0087]在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0088]a)提供分泌抗體的(成熟的)兔B-細(xì)胞群體，
[0089]b)用至少一種熒光染料(在一個實施方案中用1-3，或2-3種熒光染料)染色兔B-細(xì)胞群體的細(xì)胞，
[0090]c)將兔B-細(xì)胞染色群體的單個細(xì)胞或來自兔B-細(xì)胞染色群體的細(xì)胞集合放置在單獨的容器中(在一個實施方案中是這樣的容器，其為多孔平板的一個孔)，
[0091]d)在存在表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞以及IL-2和IL-21的情況下培養(yǎng)放置的兔B-細(xì)胞，
[0092]e)測定在兔B-細(xì)胞的培養(yǎng)中分泌的抗體的結(jié)合特異性，
[0093]f)通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測序測定特異性結(jié)合的抗體的可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并由此獲得單克隆抗體可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的編碼核酸，
[0094]g)在表達(dá)盒中引入單克隆抗體輕鏈和重鏈可變域的編碼核酸用于表達(dá)抗體，
[0095]h)在細(xì)胞中引入核酸，
[0096]i)培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
[0097]在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟: [0098]a)提供分泌抗體的(成熟的)人B-細(xì)胞群體，
[0099]b)用至少一種熒光染料(在一個實施方案中用1-3，或2-3種熒光染料)染色人B-細(xì)胞群體的細(xì)胞，
[0100]c)將人B-細(xì)胞染色群體的單個細(xì)胞或來自人B-細(xì)胞染色群體的細(xì)胞集合放置在單獨的容器中(在一個實施方案中是這樣的容器，其為多孔平板的一個孔)，[0101]d)在存在表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞和IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情況下培養(yǎng)放置的人B-細(xì)胞，
[0102]e)測定在人B-細(xì)胞的培養(yǎng)中分泌的抗體的結(jié)合特異性，
[0103]f)通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測序測定特異性結(jié)合的抗體的可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并由此獲得單克隆抗體可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的編碼核酸，
[0104]g)在表達(dá)盒中引入單克隆抗體輕鏈和重鏈可變域的編碼核酸用于表達(dá)抗體，
[0105]h)在細(xì)胞中引入核酸，
[0106]i)培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
[0107]在一個實施方案中，所述培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0108]在一個實施方案中，所述培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情況下。
[0109]在一個實施方案中，用于共培養(yǎng)的白細(xì)胞介素均是人白細(xì)胞介素。
[0110]在一個實施方案中，細(xì)胞集合包含約10個B-細(xì)胞至約1，000，000個B-細(xì)胞。在一個實施方案中，所述集合包含約500個B-細(xì)胞至約100，000個B-細(xì)胞。在一個實施方案中，所述集合包含約500個B-細(xì)胞。
[0111]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗原的抗體的方法，其包括以下步驟:
[0112]a)共培養(yǎng)分泌抗體的兔B-細(xì)胞的集合或分泌抗體的單個放置的兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞以及IL-2和IL-21，
[0113]b)分離編碼特異性結(jié)合抗原的抗體的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列之核酸并分離編碼所述抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列之核酸，
[0114]c)培養(yǎng)包含在一個或多個表達(dá)盒中含有b)中分離的核酸或其編碼輕鏈和/或重鏈可變域的人源化形式的變體的細(xì)胞，
[0115]d)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
[0116]在一個實施方案中，共培養(yǎng)是在存在促有絲分裂刺激劑和/或抗體產(chǎn)生刺激劑的情況下。
[0117]在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0118]a)提供分泌抗體的(成熟的)兔B-細(xì)胞群體，
[0119]b)用至少一種熒光染料(在一個實施方案中用1-3，或2-3種熒光染料)染色B-細(xì)胞群體的細(xì)胞，
[0120]c)將B-細(xì)胞染色群體的單個細(xì)胞或來自B-細(xì)胞染色群體的細(xì)胞集合放置在單獨的容器中(在一個實施方案中是這樣的的容器，其為多孔平板的一個孔)，
[0121]d)在存在表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞以及任選地IL-2和IL-21的情況下培養(yǎng)放置的單獨的B-細(xì)胞，
[0122]e)測定在單獨的B-細(xì)胞的培養(yǎng)中分泌的抗體的結(jié)合特異性，
[0123]f)通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測序測定特異性結(jié)合的抗體的可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并由此獲得單克隆抗體可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的編碼核酸，
[0124]g)在表達(dá)盒中引入單克隆抗體輕鏈和重鏈可變域的編碼核酸或其編碼輕鏈和/或重鏈可變域的人源化形式的變體用于表達(dá)抗體，[0125]h)在細(xì)胞中引入核酸，
[0126]i)培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
[0127]在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0128]a)提供分泌抗體的(成熟的)兔B-細(xì)胞群體，
[0129]b)用至少一種熒光染料(在一個實施方案中用1-3，或2-3種熒光染料)染色兔B-細(xì)胞群體的細(xì)胞，
[0130]c)將兔B-細(xì)胞染色群體的單個細(xì)胞或來自兔B-細(xì)胞染色群體的細(xì)胞集合放置在單獨的容器中(在一個實施方案中是這樣的的容器，其為多孔平板的一個孔)，
[0131]d) 在存在表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞以及IL-2和IL-21的情況下培養(yǎng)放置的兔B-細(xì)胞，
[0132]e)測定在兔B-細(xì)胞的培養(yǎng)中分泌的抗體的結(jié)合特異性，
[0133]f)通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測序測定特異性結(jié)合的抗體的可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并由此獲得單克隆抗體可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的編碼核酸，
[0134]g)在表達(dá)盒中引入單克隆抗體輕鏈和重鏈可變域的編碼核酸用于表達(dá)抗體，
[0135]h)在細(xì)胞中引入核酸，
[0136]i)培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
[0137]在一個實施方案中，細(xì)胞集合包含約10個B-細(xì)胞至約1，000，000個B-細(xì)胞。在一個實施方案中，所述集合包含約500個B-細(xì)胞至約100，000個B-細(xì)胞。在一個實施方案中，所述集合包含約500個B-細(xì)胞。
[0138]如本文報道的一個方面是表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞在共培養(yǎng)分泌抗體的兔B-細(xì)胞中的用途。
[0139]在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
[0140]在一個實施方案中，所述兔⑶40L具有SEQ ID N0:01的氨基酸序列。
[0141]如本文報道的一個方面是表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞在共培養(yǎng)分泌抗體的人B-細(xì)胞中的用途。
[0142]在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是BHK細(xì)胞。
[0143]在一個實施方案中，所述人⑶40L具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
[0144]如本文報道的一個方面是SAC在共培養(yǎng)分泌抗體的B-細(xì)胞和表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞中的用途。
[0145]如本文報道的一個方面是表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞以及IL-2和IL-21在共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞中的用途。
[0146]如本文報道的一個方面是表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞和IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培養(yǎng)人B-細(xì)胞中的用途。
[0147]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0148]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情況下。
[0149]在一個實施方案中，用于共培養(yǎng)的白細(xì)胞介素均是人白細(xì)胞介素。
[0150]如本文報道的一個方面是用于共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情況下培養(yǎng)單個放置的兔B-細(xì)胞或兔B-細(xì)胞集合與表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞的步驟。
[0151]在如本文報道的所有方面的一個實施方案中，IL-2是人IL-2或小鼠IL_2并且IL-21 是人 IL-21 或小鼠 IL-21。
[0152]如本文報道的一個方面是用于共培養(yǎng)人B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情況下培養(yǎng)單個放置的人B-細(xì)胞或人B-細(xì)胞集合與表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞的步驟。
[0153]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0154]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情況下。
[0155]在一個實施方案中，用于共培養(yǎng)的白細(xì)胞介素均是人白細(xì)胞介素。
[0156]如本文報道的一個方面是表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞、IL-2和IL-21在共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞用于改善細(xì)胞生長中的用途。
[0157]如本文報道的一個方面是表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞、IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培養(yǎng)人B-細(xì)胞用于改善細(xì)胞生長中的用途。
[0158]在一個實施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0159]在一個實 施方案中，所述共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情況下。
[0160]在一個實施方案中，用于共培養(yǎng)的白細(xì)胞介素均是人白細(xì)胞介素。
[0161]如本文報道的一個方面是用于改善兔B-細(xì)胞的細(xì)胞生長的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情況下培養(yǎng)單個放置的兔B-細(xì)胞或兔B-細(xì)胞集合與表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞的步驟。
[0162]在如本文報道的所有方面的一個實施方案中，IL-2是人IL-2或小鼠IL_2并且IL-21 是人 IL-21 或小鼠 IL-21。
[0163]如本文報道的一個方面是用于改善人B-細(xì)胞的細(xì)胞生長的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情況下培養(yǎng)單個放置的人B-細(xì)胞或人B-細(xì)胞集合與表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞的步驟。
[0164]在一個實施方案中,所述培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0165]在一個實施方案中，所述培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21和IL_6的情況下。
[0166]在一個實施方案中，用于共培養(yǎng)的白細(xì)胞介素均是人白細(xì)胞介素。
[0167]附圖詳沭
[0168]本文報道的主題提供了用于從兔(或人)B_細(xì)胞開始快速、有效并可重復(fù)地產(chǎn)生兔(或人)抗體并包括至少一個培養(yǎng)步驟的一般性可應(yīng)用方法。
[0169]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，添加表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞以及IL-2和IL-21可以改善兔B-細(xì)胞的生長特性，即兔B-細(xì)胞(單個放置的細(xì)胞或作為細(xì)胞集合)比在缺少表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞以及IL-2和IL-21的情況下可以更快速地生長至高細(xì)胞密度。因此，短時間內(nèi)在培養(yǎng)上清液中獲得高的兔B-細(xì)胞密度和相應(yīng)地高IgG濃度是可能的。
[0170]本文報道的一個方面是表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞。
[0171]如本文報道的一個方面是表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞與IL_2和IL-21 —起在共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞中的用途。
[0172]如本文報道的一個方面是可以與表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞或其他飼養(yǎng)細(xì)胞組合使用，以提供高度有效的B-細(xì)胞刺激和培養(yǎng)系統(tǒng)的合成飼養(yǎng)混合物。
[0173]本文報道的一個方面是表達(dá)人⑶40L的BHK細(xì)胞。
[0174]如本文報道的一個方面是表達(dá)人⑶40L的BHK細(xì)胞與IL_2和/或IL-21 —起在共培養(yǎng)人B-細(xì)胞中的用途。
[0175]如本文報道的一個方面是可以與表達(dá)人⑶40L的BHK細(xì)胞或其他飼養(yǎng)細(xì)胞組合使用，以提供高度有效的B-細(xì)胞刺激和培養(yǎng)系統(tǒng)的合成飼養(yǎng)混合物。
[0176]本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和技術(shù)(其用于實施本發(fā)明)描述于例如Ausubel, F.M.,編輯，Current Protocols in Molecular Biology,卷 1-1II (1997)，Wiley 和 Sons ;Sambrook,等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)中。
[0177]
[0178]出于本文中的目的，“受體人構(gòu)架”是包含來自人免疫球蛋白構(gòu)架或如下文定義的人共有構(gòu)架的輕鏈可變域(VL)構(gòu)架或重鏈可變域(VH)構(gòu)架的氨基酸序列的構(gòu)架?！皝碜浴比嗣庖咔虻鞍讟?gòu)架或人共有構(gòu)架的受體人構(gòu)架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列變化。在一些實施方案中，氨基酸變化的數(shù)目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些實施方案中，VL受體人構(gòu)架與VL人免疫球蛋白構(gòu)架序列或人共有構(gòu)架序列在序列上相同。
[0179]“親和力成熟的”抗體指在一個或多個高變區(qū)(HVR)中具有一個或多個改變的抗體，與不擁有此類改變的親本抗體相比，此類改變導(dǎo)致該抗體對抗原的親和力改善。
[0180]如本申請中所用的術(shù)語“氨基酸”表示羧基α-氨基酸組，其可以直接或以前體形式由核酸編碼?？梢酝ㄟ^由三個核苷酸(所謂的密碼子或堿基三聯(lián)體)組成的核酸編碼各氨基酸。每個氨基酸由至少一個密碼子編碼。不同密碼子編碼同一個氨基酸稱為“遺傳密碼的簡并性”。如本申請中所用的術(shù)語“氨基酸”表示天然發(fā)生的羧基α-氨基酸并且包括丙氨酸(三字母密碼:ala, —字母密碼:A)、精氨酸(arg, R)、天冬酰胺(asn, N)、天冬氨酸(asp, D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gin, Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、組氨酸(his, H)、異亮氨酸(ile, I)、亮氨酸(leu, L)、賴氨酸(lys, K)、甲硫氨酸(met, Μ)、苯丙氨酸(phe，F(xiàn))、脯氨酸(pro, P)、絲氨酸(ser, S)、蘇氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr, Y)和纟顏氨酸(val, V)。
[0181]本文中的術(shù)語“抗體”以最廣義使用，并且包括多種抗體結(jié)構(gòu)，包括但不限于單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的抗原結(jié)合活性。
[0182]“抗體片段”指除完整抗體外的分子，其包含結(jié)合完整抗體結(jié)合的抗原的完整抗體的部分?？贵w片段的實例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’)2 ;雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv);和由抗體片段形成的多特異性抗體。
[0183]術(shù)語“嵌合”抗體指其中重鏈和/或輕鏈的部分自特定的來源或物種，而重鏈和/或輕鏈的剩余部分自不同來源或物種的抗體。
[0184] 抗體的“類”指其重鏈擁有的恒定域或恒定區(qū)的類型。有5大類抗體:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且這些中的幾種可以進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如，IgGpIgG2UgG^IgG4、IgAjP IgA2。對應(yīng)于不同類的免疫球蛋白的重鏈恒定域分別稱為α、δ、ε、Y和μ。[0185]術(shù)語“克隆”表示來自/源自單個B-細(xì)胞的分裂和分泌抗體的B-細(xì)胞群體。因此，B-細(xì)胞克隆產(chǎn)生單克隆抗體。
[0186]如本文所用，術(shù)語“表達(dá)”指細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯過程?？稍诩?xì)胞中存在的相應(yīng)mRNA量的基礎(chǔ)上測定細(xì)胞中目的核酸序列的轉(zhuǎn)錄水平。例如，可通過RT-PCR或Northern雜交對從目的序列轉(zhuǎn)錄的mRNA進(jìn)行定量(參閱Sambrook,等，1989,上文)?？赏ㄟ^多種方法，例如通過ELISA，通過測定多肽的生物活性，或通過使用不依賴該活性的測定，如Western印跡或放射免疫測定，使用識別并結(jié)合多肽的免疫球蛋白對目的核酸編碼的多肽進(jìn)行定量(參見Sambrook,等，1989,上文)。
[0187]“表達(dá)盒”指含有用于細(xì)胞中至少所含核酸表達(dá)的必需調(diào)節(jié)元件，如啟動子和多腺苷酸化位點的構(gòu)建體。
[0188]以瞬時表達(dá)或持久表達(dá)進(jìn)行基因的表達(dá)。目的多肽一般是分泌的多肽，并因而含有N-端延伸(也稱為信號序列)，其為多肽通過細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運/分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中所必需的。一般而言，信號序列可來自編碼分 泌的多肽的任何基因。如果使用異源信號序列，其優(yōu)選為宿主細(xì)胞識別和加工的(即通過信號肽酶切割的)一種序列。例如對于在酵母中的分泌，待表達(dá)的異源基因的天然信號序列可以被來自分泌基因的同源酵母信號序列所取代，如酵母轉(zhuǎn)化酶信號序列、Ct-因子前導(dǎo)序列(包括酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)和漢森氏酵母屬(Hansenula) α-因子前導(dǎo)序列，第二種描述于US5，010，182中)、酸性磷酸酶信號序列，或白假絲酵母(C.albicans)葡萄糖淀粉酶信號序列(EP0362179)。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中，目的蛋白質(zhì)的天然信號序列對于人或鼠類起源的免疫球蛋白是令人滿意的，盡管其他哺乳動物信號序列是合適的，如相同或相關(guān)物種的分泌多肽的信號序列，以及病毒分泌信號序列，例如單純性皰疹糖蛋白D信號序列。編碼該前區(qū)段的DNA片段框內(nèi)連接，即有效連接至編碼目的多肽的DNA片段。
[0189]術(shù)語“實驗動物”表示非人動物。在一個實施方案中，實驗動物選自大鼠、小鼠、倉鼠、兔、駱駝、駱馬、非人靈長類、綿羊、狗、牛、雞、兩棲動物、鯊魚和爬行類動物。在一個實施方案中，實驗動物是哺乳動物。
[0190]本文中的術(shù)語“Fe區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C端區(qū)，其含有恒定區(qū)的至少一部分。所述術(shù)語包括天然序列Fe區(qū)和變體Fe區(qū)。在一個實施方案中，人IgG重鏈Fe區(qū)從Cys226或從Pro230延伸至重鏈的羧基端。然而，F(xiàn)e區(qū)的C端賴氨酸(Lys447)可以存在或缺失。除非本文另有規(guī)定，F(xiàn)e區(qū)或恒定區(qū)中氨基酸的編號根據(jù)EU編號系統(tǒng)，也稱為EU 索弓 I,如 Kabat, E.A.，等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD(1991), NIHPub I i cat ion91-3242,卷 1-3 中所述。
[0191]術(shù)語“飼養(yǎng)混合物”表示不同添加物，如生長因子、細(xì)胞因子和/或促進(jìn)B-細(xì)胞激活和/或存活和/或抗體分泌的其他蛋白質(zhì)的組合。飼養(yǎng)混合物可以是例如從胸腺細(xì)胞的培養(yǎng)上清液(TSN)(其是細(xì)胞因子的非限定性組合)中獲得的天然的飼養(yǎng)混合物，或飼養(yǎng)混合物可以是合成的飼養(yǎng)混合物，例如包含IL-21和/或IL-2和/或IL-6的混合物。
[0192]“構(gòu)架”或“FR”指除高變區(qū)(HVR)殘基以外的可變域殘基?？勺冇虻腇R —般由四個FR結(jié)構(gòu)域組成:FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以以下順序出現(xiàn):FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。[0193]術(shù)語“細(xì)胞”或“宿主細(xì)胞”指其中可以轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染例如編碼異源多肽的核酸的細(xì)胞。術(shù)語“細(xì)胞”包括用于增殖質(zhì)粒的原核細(xì)胞，和用于表達(dá)核酸并產(chǎn)生編碼的多肽的真核細(xì)胞。在一個實施方案中，所述真核細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞，任選地是CHO Kl細(xì)胞(ATCC CCL-61或DSM ACCl 10)或CHO DG44細(xì)胞(也稱為 CHO-DHFR[-]、DSM ACC126)或 CHO XL99 細(xì)胞、CH0-T 細(xì)胞(參見例如 Morgan, D.，等，Biochemistry26 (1987) 2959-2963)，或 CHO-S 細(xì)胞、或 Super-CHO 細(xì)胞(Pak, S.C.0.，等Cytotechnol.22(1996) 139-146)。如果這些細(xì)胞不適合于在無血清培養(yǎng)基或懸浮液中生長，那么有待在目前方法使用之前進(jìn)行適應(yīng)。如本文所用，表述“細(xì)胞”包括受試者細(xì)胞及其后代。因此，詞語“轉(zhuǎn)化體”和“轉(zhuǎn)化細(xì)胞”包括原代受試者細(xì)胞和來自其中的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)化或次代培養(yǎng)的次數(shù)。也理解，由于有意的或無意突變，所有后代在DNA含量上不必完全相同。包括具有與如在最初轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中所篩選的功能或生物活性相同的功能或生物活性的變體后代。
[0194] “人抗體”是擁有這樣的氨基酸序列的一種抗體，所述氨基酸序列對應(yīng)于由人或人細(xì)胞產(chǎn)生的或來自利用人抗體所有組成成分或其它人抗體編碼序列的非人來源的抗體的氨基酸序列。人抗體的此定義明確排除包含非人抗原結(jié)合殘基的人源化抗體。
[0195]“人共有構(gòu)架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH構(gòu)架序列選集中最常存在的氨基酸殘基的構(gòu)架。一般地，人免疫球蛋白VL或VH序列的選集來自可變域序列亞組。一般地，序列亞組是如 Kabat, E.A.,等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD(1991), NIHPublication91-3242,卷1_3中所述的亞組。在一個實施方案中，對于VL,亞組是如Kabat等,上文中所述的亞組K I。在一個實施方案中，對于VH，亞組是如Kabat等，上文中所述的亞組III。
[0196]“人源化”抗體指包含來自非人HVR的氨基酸殘基和來自人FR的氨基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施方案中，人源化抗體會包含至少一個，通常兩個基本上整個可變域，其中所有或基本上所有HVR(例如，CDR)對應(yīng)于非人抗體的那些，且所有或基本上所有FR對應(yīng)于人抗體的那些。任選地，人源化抗體可以包含來自人抗體的抗體恒定區(qū)的至少一部分?？贵w，例如非人抗體的“人源化形式”指已經(jīng)經(jīng)歷人源化的抗體。
[0197]如本文所用，術(shù)語“高變區(qū)”或“HVR”指抗體可變域中在序列上高變的和/或形成結(jié)構(gòu)上限定的環(huán)(“高變環(huán)”)的每個區(qū)。一般地，天然的4鏈抗體包含6個HVR;三個在VH中(H1、H2、H3)，且三個在VL中(L1、L2、L3)。HVR —般包含來自高變環(huán)和/或來自“互補決定區(qū)”(CDR)的氨基酸殘基，后一種具有最高序列變異性和/或參與抗原識別。示例性高變環(huán)發(fā)生在氨基酸殘基26-32 (LI)、50-52 (L2) ,91-96 (L3)、26-32 (Hl)、53-55 (H2)和 96-101 (H3)上。(Chothia, C.和 Lesk, Α.Μ.，J.Mol.Biol.196(1987)901-917)。示例性 CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1, CDR-H2 和 CDR-H3)發(fā)生在 LI 的氨基酸殘基 24-34、L2 的 50-56、L3 的 89-97、Hl 的 31-35B、H2 的 50-65 和 H3 的 95-102上。(Kabat, E.A.，等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991), NIHPublication91-3242,卷1_3)。除了 VH中的CDRl外，CDR —般包含形成高變環(huán)的氨基酸殘基。⑶R還包含“特異性決定殘基”或“SDR”，其是接觸抗原的殘基。SDR包含在稱為縮短的 CDR 或 a-CDR 的 CDR 的區(qū)內(nèi)。示例性 a_CDR (a-CDR-Ll、a_CDR_L2、a_CDR_L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2 和 a_CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸殘基 31-34、L2 的 50-55、L3 的 89-96、Hl 的31-35B、H2 的 50-58 和 H3 的 95-102 上。(參見 Almagro, J.C.和 Fransson, J.，F(xiàn)ront.Biosc1.13(2008) 1619-1633)。除非另有說明，可變域中的HVR殘基和其它殘基(例如，F(xiàn)R殘基)在本文中根據(jù)Kabat等，上文編號。
[0198]術(shù)語“標(biāo)記”表示表面標(biāo)志物的存在或缺失，其可以通過添加特異性結(jié)合和標(biāo)記的抗表面標(biāo)志物抗體來確定。因此，在與各自的特異性結(jié)合和標(biāo)記的抗表面標(biāo)記物抗體溫育后，例如在熒光標(biāo)記物的情況下通過熒光的出現(xiàn)確定表面標(biāo)記物的存在，而通過熒光的缺失確定表面標(biāo)記物的缺失。
[0199]如本文所用，術(shù)語“單克隆抗體”指從基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體，即群體包含的各抗體是相同的和/或結(jié)合相同表位，除了例如含有天然發(fā)生的突變的或在單克隆抗體制劑的產(chǎn)生過程中發(fā)生的可能的變體抗體外，此類變體一般以極小量存在。與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，單克隆抗體制劑的每種單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。因此，修飾語“單克隆”表示自基本上同質(zhì)的抗體群體獲得的抗體的特性，而不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來產(chǎn)生抗體。例如，可以通過多種技術(shù)制備待根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體，包括但不限于雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體展示方法和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因動物的方法，本文中描述了用于制備單克隆抗體的此類方法和其它示例性方法。
[0200]“天然抗體”指具有不同結(jié)構(gòu)的天然發(fā)生的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗體是約150，000道爾頓的異四聚體糖蛋白，其由通過二硫鍵結(jié)合的兩條相同的輕鏈和兩條相同的重鏈組成。從N至C端，每條重鏈具有可變區(qū)(VH)，又稱作可變重鏈結(jié)構(gòu)域或重鏈可變域，接著是三個恒定域(CH1、CH2和CH3)。類似地，從N至C端，每條輕鏈具有可變區(qū)(VL)，又稱作可變輕鏈結(jié)構(gòu)域或輕鏈可變域，接著是恒定輕鏈(CL)結(jié)構(gòu)域?；谄浜愣ㄓ虻陌被嵝蛄?，抗體輕鏈可歸入兩種類型(稱作卡帕(K)和拉姆達(dá)(λ))中的一種。
[0201]“核酸”或“核酸序列”(所述術(shù)語在該申請中可互換使用)指由各核苷酸(也稱為堿基)a、c、g和t (或在RNA中為u )組成的聚合分子，例如DNA、RNA或其修飾。該多核苷酸分子可以是天然發(fā)生的多核苷酸分子或合成的多核苷酸分子或一個或多個天然發(fā)生的多核苷酸分子與一個或多個合成的多核苷酸分子的組合。該定義中也包括的是天然發(fā)生的多核苷酸分子，其中一個或多個核苷酸改變(例如通過誘變)、缺失或添加。核酸可以是分離的或整合在另一核酸中的，例如在表達(dá)盒、質(zhì)?；蛩拗骷?xì)胞的染色體中。核酸的特征在于其由各核苷酸組成的核酸序列。
[0202]本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知程序和方法來將例如多肽的氨基酸序列轉(zhuǎn)變成編碼該氨基酸序列的對應(yīng)核酸序列。因而，核酸的特征在于其由各核苷酸組成的核酸序列，同樣在于由其編碼的多肽的氨基酸序列。
[0203]術(shù)語“特異性結(jié)合”及其語法等同物表示，抗體以KT7M或更小的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合其靶標(biāo)，在一個實施 方案中以IO-8M-KT13M的解離常數(shù)結(jié)合其靶標(biāo)，在其他實施方案中以KT9M-1O-13M的解離常數(shù)結(jié)合其靶標(biāo)。所述術(shù)語進(jìn)一步用于表示，所述抗體不特異性結(jié)合存在的其他生物分子，即其以10_6M或更大的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合其他生物分子，在一個實施方案中以10-6Μ-1Μ的解離常數(shù)結(jié)合其他生物分子。[0204]“轉(zhuǎn)染載體”是提供在宿主細(xì)胞中表達(dá)轉(zhuǎn)染載體中所包含的編碼核酸/結(jié)構(gòu)基因所有所需元件的核酸(也表示為核酸分子)。轉(zhuǎn)染載體包含原核質(zhì)粒增殖單位，例如對于大腸桿菌而言依次包含原核復(fù)制起點和賦予對原核選擇劑抗性的核酸，還包含在轉(zhuǎn)染載體中的，賦予對真核選擇劑抗性的一個或多個核酸和編碼目的多肽的一個或多個核酸。優(yōu)選的是每一種位于表達(dá)盒內(nèi)的賦予對選擇劑抗性的核酸和編碼目的多肽的核酸，由此每一個表達(dá)盒包含啟動子、編碼核酸和轉(zhuǎn)錄終止子，包括多腺苷酸化信號?；虮磉_(dá)一般處于啟動子控制下，并且此結(jié)構(gòu)基因稱為“有效連接”所述啟動子。類似的，如果調(diào)節(jié)元件調(diào)節(jié)核心啟動子的活性，那么調(diào)節(jié)元件與核心啟動子有效連接。
[0205]術(shù)語“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)域。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別為VH和VL) —般具有類似的結(jié)構(gòu)，其中每個結(jié)構(gòu)域包含4個保守的構(gòu)架區(qū)(FR)和3個高變區(qū)(HVR)。(參見例如Kindt, T.J.,等，KubyImmunology,第 6 版，W.H.Freeman and C0., N.Y.(2007),第 91 頁)。單個 VH 或 VL 結(jié)構(gòu)域可以足以賦予抗原結(jié)合特異性。此外，可以分別使用來自結(jié)合抗原的抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域篩選互補VL或VH結(jié)構(gòu)域的文庫來分離結(jié)合特定抗原的抗體。參見例如,Portolano, S.，等，J.1mmunol.150 ( 1993) 880-887 ；Clackson, Τ.，等，Nature352 (1991) 624-628)。
[0206]如本文所用，術(shù)語“載體”指能夠增殖與其連接的另一種核酸的核酸分子。該術(shù)語包括作為自身復(fù)制型核酸結(jié)構(gòu)的載體以及整合到其已經(jīng)引入的宿主細(xì)胞的基因組中的載體。某些載體能夠指導(dǎo)與其有效連接的核酸的表達(dá)。此類載體在本文中稱為“表達(dá)載體”。
[0207]術(shù)語“年輕動物”表示在出現(xiàn)性成熟以前的動物。例如，年輕倉鼠的年齡是小于6周，特別是小于4周。例如，年輕小鼠的年齡是小于8周，特別是小于5周。
[0208]免瘡
[0209]在本文報道的方法中，可以使用/加工從例如小鼠、大鼠、倉鼠、兔或人獲得的B-細(xì)胞。
[0210]在一個實施方案中，小鼠是NMR1-小鼠或balb/c-小鼠。
[0211]在一個實施方案中，倉鼠選自亞美尼亞倉鼠(倉鼠屬(Cricetulusmigratorius))、中國倉鼠(中國倉鼠(Cricetulus griseus))和敘利亞倉鼠(Mesocricetulus auratus)。在一個實施方案中，倉鼠是亞美尼亞倉鼠。
[0212]在一個實施方案中，B-細(xì)胞是兔B-細(xì)胞。在一個實施方案中，兔選自新西蘭白(NZff)兔、Zimmermann-兔(ZIKA)、Alicia-突變品系的兔、basilea突變品系的兔、具有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因兔、rblgM敲除的兔，及其雜交育種的兔。在一個實施方案中，從免疫兔或針對具體抗原接種后的兔獲得兔B-細(xì)胞。
[0213]在一個實施方案中，B-細(xì)胞是人B-細(xì)胞。在一個實施方案中，從非接種的健康人，或從針對具體抗原接種后的人，或從患有疾病的人，或從已經(jīng)從疾病中存活的人獲得人B-細(xì)胞。接種可以是向人或從具體疾病中存活者施用具體疫苗。
[0214]B-細(xì)朐的來源和分離
[0215]免疫實驗動物或接種的人的血液提供了產(chǎn)生抗體的B-細(xì)胞的高度多樣性。從中獲得的B-細(xì)胞分泌抗體，其在⑶R內(nèi)幾乎沒有相同的或重疊的氨基酸序列，因此顯示了高度多樣性。
[0216]在一個實施方案中，從免疫后4天直至免疫后15天或直至最近的加強獲得例如從實驗動物的血液獲得的實驗動物的或人的B-細(xì)胞。
[0217]在一個實施方案中，從免疫或最近加強后4天直至至多9天后獲得B_細(xì)胞。
[0218]該時間跨度允許本文報道的方法具有高度靈活性。在該時間跨度內(nèi)，提供最精確抗體的B-細(xì)胞從脾遷移到血液中(參見例如Paus, D.，等，JEM203 (2006) 1081 - 1091 ；Smith, K.G.S.,等，The EMBO J.I 6 (I 997) 2996 - 3O O6 ;Wrammert，J.，等，Nature453 (2008)667-672)。
[0219]共培養(yǎng)前的選擇步驟
[0220]可從外周血單核細(xì)胞(PBMC)中富集產(chǎn)生特異性結(jié)合抗原的抗體的B-細(xì)胞。因此，在本文報道的所有方法的一個實施方案中，從外周血單核細(xì)胞(PBMC)獲得B-細(xì)胞或從外周血單核細(xì)胞(PBMC)富集B-細(xì)胞集合。
[0221]可以通過使用淘選方法分別減少或富集不產(chǎn)生結(jié)合目的抗原的抗體的細(xì)胞，或以同樣方法分別減少或富集產(chǎn)生結(jié)合目的抗原的抗體的細(xì)胞。其中結(jié)合配偶體呈現(xiàn)為附著到表面并且如果進(jìn)一步加工結(jié)合的細(xì)胞，那么在細(xì)胞群體中選擇性富集與配偶體結(jié)合的細(xì)胞，或者如果進(jìn)一步加工溶液中剩余的細(xì)胞，那么在細(xì)胞群體中減少與配偶體結(jié)合的細(xì)胞。
[0222]本文報道的方法在一個實施方案中包括選擇步驟，其中基于細(xì)胞表面標(biāo)志物和熒光激活的細(xì)胞分選/門控選擇產(chǎn)生特異性抗體的B-細(xì)胞。在一個實施方案中，分選/富集/選擇成熟的B-細(xì)胞。為了從不同實驗動物物種中選擇B-細(xì)胞，可以使用不同的細(xì)胞表面標(biāo)志物。
[0223]通過標(biāo)記非靶標(biāo)細(xì)胞群體和非特異性結(jié)合的淋巴細(xì)胞，可以選擇性去除這些細(xì)胞。在此去除步驟中，一般可實現(xiàn)不完全的去除。雖然去除不是定量的，但是其為剩余細(xì)胞的后續(xù)熒光標(biāo)記提供了優(yōu)勢，因為可減少或甚至最小化干擾細(xì)胞的數(shù)目。
[0224]可以使用不同的表面標(biāo)志物標(biāo)記不同的細(xì)胞群體，如CD3+-細(xì)胞(T-細(xì)胞)、CD19+-細(xì)胞(一般而言是B-細(xì)胞)、IgM+-細(xì)胞(成熟的天然B-細(xì)胞)、IgG+-細(xì)胞(成熟的B-細(xì)胞)、CD38+-細(xì)胞(例如成漿細(xì)胞)和IgG+CD38+-細(xì)胞(前漿細(xì)胞)。
[0225]用于選擇成熟的IgG+-B-細(xì)胞，如記憶B-細(xì)胞、成漿細(xì)胞和漿細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記可以用于本文報道的方法中。
[0226]為了選擇或富集B-細(xì)胞,單個標(biāo)記或雙標(biāo)記或三標(biāo)記細(xì)胞。
[0227]需要進(jìn)行標(biāo)記，其導(dǎo)致標(biāo)記約0.1 % -2.5%的總細(xì)胞群體。
[0228]在一個實施方案中，通過標(biāo)記在群體中0.1% -2.5%的B-細(xì)胞上存在的表面分子選擇B-細(xì)胞。在一個實施方案中，通過標(biāo)記在群體中0.3% -1.5%的B-細(xì)胞上存在的表面分子選擇B-細(xì)胞。在一個實施方案中，通過標(biāo)記在群體中0.5% -1%的B-細(xì)胞上存在的表面分子選擇B-細(xì)胞。
[0229]單細(xì)胞放置
[0230]本文報道的方法在一個實施方案中包括將B-細(xì)胞群體的B-細(xì)胞放置為單細(xì)胞的步驟。
[0231]在一個實施方案中，通過熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)放置為單細(xì)胞。
[0232]在一個實施方案中，特異性標(biāo)記的B-細(xì)胞放置為單細(xì)胞。在一個實施方案中，標(biāo)記是用突光標(biāo)記的抗體標(biāo)記細(xì)胞表面標(biāo)志物。
[0233] 在一個實施方案中，本文報道的方法提供了單克隆抗體。[0234]本文報道的所有方法的一個實施方案中，B-細(xì)胞是成熟的B-細(xì)胞并且成熟的B-細(xì)胞放置為單細(xì)胞。
[0235]用于從實驗動物的血液獲得的B-細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記也可以用于標(biāo)記從實驗動物(如小鼠、大鼠、倉鼠或兔)的脾和其他免疫器官中獲得的B-細(xì)胞。
[0236]多細(xì)胞放置
[0237]本文報道的方法在一個實施方案中包括放置B-細(xì)胞集合的步驟。在該B-細(xì)胞集合中，從外周血經(jīng)歷磁力親和珠或FACS分離后，每孔中放置了全部的B-細(xì)胞。
[0238]在一個實施方案中，放置了約500個B-細(xì)胞。
[0239]在一個實施方案中，放置了約2，500個B-細(xì)胞。
[0240]在單個實驗中，放置的B-細(xì)胞的總數(shù)例如對于人B-細(xì)胞而言可以增加至多90，000個B-細(xì)胞或更多。
[0241]共?養(yǎng)
[0242]本文報道了產(chǎn)生抗體的B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞(如CHO或BHK細(xì)胞)的共培養(yǎng)。
[0243]因此， 在本文報道的所有方法的一個實施方案中，B-細(xì)胞集合或單個放置的B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的CHO細(xì)胞在存在IL-2和IL-21或飼養(yǎng)混合物的情況下共培養(yǎng)。
[0244]早已共培養(yǎng)約3、4、5、6、7、8、10、15或21天后，尤其3、4或5天后(約2，500個B-細(xì)胞的集合)，或尤其6、7或8天后(單個放置的B-細(xì)胞或約500個B-細(xì)胞的集合)，可以在上清液中獲得充足的抗體分子。利用由此提供的抗體量，可以進(jìn)行不同分析，以更詳細(xì)地表征抗體，例如關(guān)于結(jié)合特異性。利用在篩選/選擇過程中的該早期階段中對抗體的改善表征，可以減少所需核酸分離物和必須進(jìn)行的測序反應(yīng)的數(shù)量。
[0245]本文報道的所有方法的一個實施方案是在存在飼養(yǎng)混合物的情況下產(chǎn)生抗體的B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的CHO細(xì)胞的共培養(yǎng)。
[0246]所述飼養(yǎng)混合物可以是天然的飼養(yǎng)混合物或合成的飼養(yǎng)混合物。
[0247]天然的飼養(yǎng)混合物是例如胸腺細(xì)胞上清液(TSN)。其含有適當(dāng)?shù)目扇芤蜃樱撛噭┦钱愘|(zhì)的，成分描述并不充分并且在動物之間不同。
[0248]合成的飼養(yǎng)混合物是所謂的“Zubler飼養(yǎng)混合物”。其由鼠類細(xì)胞因子的確定組合組成(2ng/ml IL-1 β、50ng/ml IL_2、10ng/ml IL-10 和 2ng/ml TNF a )。
[0249]在本文報道的所有方法的一個實施方案中，飼養(yǎng)混合物是胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液。在一個實施方案中，B-細(xì)胞不是人B-細(xì)胞。
[0250]在一個實施方案中，從各年輕動物胸腺的胸腺細(xì)胞培養(yǎng)中獲得胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液。與從成體動物血液中分離胸腺細(xì)胞相比，尤其適合使用年輕動物的胸腺。
[0251]在一個實施方案中，從人的血液中獲得的人T-細(xì)胞培養(yǎng)中獲得胸腺細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
[0252]一般而言，本文報道的方法中的B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的CHO細(xì)胞的共培養(yǎng)步驟可以在許多額外步驟之前并也可以在這些步驟之后。
[0253]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞與IL_2和IL-21以及SAC的共培養(yǎng)可以用于激活早期(非成熟的或不成熟的)兔B-細(xì)胞。這些B-細(xì)胞不表達(dá)CD138。
[0254]在本文報道的所有方法的一個實施方案中，產(chǎn)生抗體的B-細(xì)胞與表達(dá)CD40L的CHO細(xì)胞的共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。在一個實施方案中，B-細(xì)胞是兔B-細(xì)胞并且⑶40L是兔⑶40L。在一個實施方案中，培養(yǎng)基基本上不含IL-4，即不向培養(yǎng)基中加入IL-4。在一個實施方案中，IL-2和IL-21與培養(yǎng)基一起在培養(yǎng)開始時被加入。
[0255]在本文報道的所有方法的一個實施方案中，產(chǎn)生抗體的兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞的共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下，由此培養(yǎng)基基本上不含IL-4，并且由此IL-2和IL-21與培養(yǎng)基一起在培養(yǎng)開始時被加入。
[0256]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，使用包含B-細(xì)胞、表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞、IL_2和IL-21的共培養(yǎng)基系統(tǒng)導(dǎo)致B-細(xì)胞的改善增殖，即與不包含IL-2、IL-21和表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞中的一種、兩種或全部的系統(tǒng)相比，所述B-細(xì)胞更快速地分裂并且在更短的時間里在培養(yǎng)上清液中分別可以獲得更高的細(xì)胞密度和抗體滴度。
[0257]還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對于兔B-細(xì)胞而言，包含表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞、人或鼠IL-2以及人或鼠IL-21的共培養(yǎng)系統(tǒng)尤其適合。
[0258]通過IgG產(chǎn)生表征共培養(yǎng)的細(xì)胞
[0259]對于共培養(yǎng)后分泌的IgG的(定性和定量)測定，一般可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有方法，如ELISA。在本文報道的所有方法的一個實施方案中，使用EILSA。對于人IgG水平的測定，已經(jīng)使用了流式蛋白定量技術(shù)(Cytometric Bead Array, CBA)技術(shù)(可從 BD Biosciences 獲得)。
[0260]根據(jù)表征結(jié)果，可以獲得，即選擇B-細(xì)胞克隆。
[0261]通過擴展和增殖表征共培養(yǎng)的細(xì)胞
[0262]對于細(xì)胞擴展的(定性和定量)測定，可以使用不同的讀出系統(tǒng)(商品化的細(xì)胞活性測試“細(xì)胞滴度發(fā)光” (Promega) XFSE稀釋法、3HThymidin摻入或細(xì)胞培養(yǎng)圖像)評估共培養(yǎng)的B-細(xì)胞的增殖或生存力。
[0263]mRNA的分離、克降與測序
[0264]產(chǎn)生高抗體滴度的B-細(xì)胞克隆提供了一些量的允許使用簡并PCR引物的編碼(近親)單克隆輕鏈和重鏈可變區(qū)的mRNA，并且避免了對高度特異性引物的需要。也減少了所需要的PCR循環(huán)數(shù)。因此，在一個實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄酶PCR使用輕鏈和重鏈可變域的簡并PCR引物。
[0265]對于B-細(xì)胞，可以分離總mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用各引物可以擴增近親VH和VL區(qū)的編碼核酸。
[0266]在本文報道的所有方法的一個實施方案中，氨基酸序列來自擴增的可變域的編碼核酸。通過定位EVQL/QVQL至VSS (VH區(qū))和DIVM/DIQM至KLEIK (VL區(qū))的氨基酸序列鑒定可變域的編碼核酸的精確起點和終點。
[0267]本f報道
[0268]本文報道的是分泌抗體的B-細(xì)胞通過以下途徑的共刺激:(i)使用照射的哺乳動物，例如CHO(中國倉鼠卵巢)或BHK(幼倉鼠腎)，例如兔起源的或人起源的CD40L轉(zhuǎn)染的飼養(yǎng)細(xì)胞的CD40/CD40L(CD154)途徑，和(ii)各細(xì)胞因子或包含例如人或小鼠白細(xì)胞介素2(IL-2)和21 (IL-21)，和/或熱殺死的福爾馬林固定的葡萄球菌A菌株Cowanl顆粒(SAC)的飼養(yǎng)混合物對培養(yǎng)基的補充。
[0269]本發(fā)明的方面和實施方案[0270]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情況下共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞的步驟。
[0271] 具有在存在IL-2和IL-21的情況下兔B-細(xì)胞(單個放置的細(xì)胞或細(xì)胞集合)與表達(dá)(例如細(xì)胞表面呈遞的)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞的共培養(yǎng)步驟時，提供了快速、有效且可重復(fù)的方法用于從兔B-細(xì)胞開始產(chǎn)生兔或人抗體。
[0272]在一個實施方案中，兔B-細(xì)胞是天然的兔B-細(xì)胞或非成熟的兔B-細(xì)胞。
[0273]在一個實施方案中，兔B-細(xì)胞是IgG+B-細(xì)胞。
[0274]在一個實施方案中，IL-2是人IL-2。在一個實施方案中，IL_2是鼠類IL_2。
[0275]在一個實施方案中，IL-21是人IL-21。在一個實施方案中，IL-21是鼠類IL-21。
[0276]在一個實施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是鼠類IL-21。
[0277]在一個實施方案中，IL-2是鼠類IL-2并且IL-21是鼠類IL-21。
[0278]在 Iv實施方案中，IL~2是人IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0279]在一個實施方案中，IL-2是鼠類IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0280]在一個實施方案中，培養(yǎng)是在缺少IL-4的情況下。在一個實施方案中，培養(yǎng)基不含 IL-4。
[0281]在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
[0282]在一個實施方案中，所述兔⑶40L具有SEQ ID N0:01的氨基酸序列。
[0283]在一個實施方案中，在用抗原最后一次免疫或加強兔后4-9天后獲得兔B-細(xì)胞。
[0284]在一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟中的一個或多個:
[0285]-從免疫的兔中獲得B-細(xì)胞，和/或
[0286]-單個放置所述B-細(xì)胞，和/或
[0287]-共培養(yǎng)B-細(xì)胞與表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞，和/或
[0288]-從共培養(yǎng)的兔B-細(xì)胞中獲得編碼兔抗體的可變域的核酸，和/或
[0289]-將兔抗體的可變域人源化，和/或
[0290]-培養(yǎng)包含編碼抗體的可變域的核酸的哺乳動物細(xì)胞并從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體。
[0291]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括共培養(yǎng)人B-細(xì)胞與表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞的步驟。
[0292]具有人B-細(xì)胞(單個放置的細(xì)胞或細(xì)胞集合)與表達(dá)(例如細(xì)胞表面呈遞的)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞的共培養(yǎng)步驟時，提供了有效且可重復(fù)的方法用于從人B-細(xì)胞開始產(chǎn)生人抗體。
[0293]在一個實施方案中，從人的血液中獲得人B-細(xì)胞。
[0294]在一個實施方案中，兔B-細(xì)胞是IgG+B-細(xì)胞。
[0295]在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是幼倉鼠腎細(xì)胞。
[0296]在一個實施方案中，向共培養(yǎng)中加入IL-2和/或IL-21和/或IL_6。
[0297]在一個實施方案中，IL-2是人IL-2。
[0298]在一個實施方案中，IL-21是人IL-21。
[0299]在一個實施方案中，IL-6是人IL-6。
[0300]在一個實施方案中，培養(yǎng)是在缺少IL-4的情況下。在一個實施方案中，培養(yǎng)基不含 IL-4。
[0301 ] 在一個實施方案中，所述人⑶40L具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
[0302]在一個實施方案中，在用抗原或疫苗免疫人后4-9天后獲得B-細(xì)胞。
[0303]在一個實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟中的一個或多個:
[0304]-從免疫的或接種的或患有疾病或從疾病中存活的人的血液中獲得B-細(xì)胞，和/或
[0305]-單個放置所述B-細(xì)胞，和/或
[0306]-共培養(yǎng)B-細(xì)胞與表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞，和/或
[0307]-從共培養(yǎng)的人B-細(xì)胞中獲得編碼人抗體的可變域的核酸，和/或
[0308]-培養(yǎng)包含編碼人抗體的可變域的核酸和任選地編碼人抗體的恒定區(qū)的核酸的哺乳動物細(xì)胞并從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體。
[0309]本文報道的一個方面是IL-2和IL-21用于共培養(yǎng)B-細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞的用途。
[0310]向B-細(xì)胞 與飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)中加入IL-2和IL-21提供了高度有效的B-細(xì)胞刺激和改善的生長特性，如改善的生長速率和/或抗體分泌。
[0311]在一個實施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0312]在一個實施方案中，B-細(xì)胞是兔B-細(xì)胞并且飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
[0313]本文報道的一個方面是IL-2和/或IL-21用于共培養(yǎng)B-細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞的用途。
[0314]向B-細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)中加入IL-2和/或IL-21和/或IL_6提供了高度有效的B-細(xì)胞刺激和改善的生長特性，如改善的生長速率和/或抗體分泌。
[0315]在一個實施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0316]在一個實施方案中，B-細(xì)胞是人B-細(xì)胞并且飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是幼倉鼠腎細(xì)胞。
[0317]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括共培養(yǎng)B-細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞以及IL-2和IL-21的步驟。
[0318]在一個實施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0319]在一個實施方案中，B-細(xì)胞是兔B-細(xì)胞并且飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
[0320]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括共培養(yǎng)B-細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞以及IL-2和/或IL-21和/或L-6的步驟。
[0321]在一個實施方案中，飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0322]在一個實施方案中，B-細(xì)胞是人B-細(xì)胞并且飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是幼倉鼠腎細(xì)胞。
[0323]如本文報道的一個方面是包含表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞、IL_2以及IL-21的試劑盒。
[0324]如本文報道的一個方面是包含表達(dá)人CD40L的BHK細(xì)胞和IL-2或IL-21或IL-6或其組合的試劑盒。
[0325]本文報道的一個方面是用于培養(yǎng)分泌特異性結(jié)合T-細(xì)胞表面抗原并且介導(dǎo)陰性刺激物至T-細(xì)胞的抗體的B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2或IL-21或兩者的情況下共培養(yǎng)B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
[0326]如果分泌T-細(xì)胞抑制性化合物的B-細(xì)胞必須從單個或集合的B-細(xì)胞開始擴增，并且由于分泌的T-細(xì)胞抑制性化合物會降低或消除飼養(yǎng)細(xì)胞的作用而不能使用來自T-細(xì)胞(例如胸腺瘤細(xì)胞)的飼養(yǎng)細(xì)胞，則該共培養(yǎng)系統(tǒng)是有用的。
[0327]本文報道的表達(dá)⑶40L的CHO細(xì)胞可以用于產(chǎn)生T-細(xì)胞特異性抗體。使用由T-細(xì)胞組成的或包含T-細(xì)胞抗原的飼養(yǎng)系統(tǒng)(如胸腺瘤細(xì)胞系EL4-B5)并不合適，因為B-細(xì)胞產(chǎn)生的T-細(xì)胞特異性抗體會干擾培養(yǎng)系統(tǒng)。對了 T-細(xì)胞特異性抗體分泌(B-)細(xì)胞的培養(yǎng)，人造的T-細(xì)胞獨立系統(tǒng)將是理想的，如本文報道的系統(tǒng)。
[0328]在一個實施方案中，抗原不是⑶40L。
[0329]在一個實施方案中，T-細(xì)胞抑制性化合物是特異性結(jié)合T-細(xì)胞表面抗原的抗體。
[0330]在一個實施方案中，B-細(xì)胞是兔B-細(xì)胞并且飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
[0331]在一個實施方案中，向共培養(yǎng)中加入IL-2和IL-21。
[0332]在一個實施方案中，B-細(xì)胞是人B-細(xì)胞并且飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是幼倉鼠腎細(xì)胞。
[0333]在一個實施方案中，向共培養(yǎng)中加入IL-2和/或IL-21和/或IL_6。
[0334]如本文報道的一個方面是用于培養(yǎng)分泌抗體的B-細(xì)胞的方法，其以以下順序包括
[0335]i)在存在促有絲分裂刺激劑的情況下B-細(xì)胞與表達(dá)CD40L的哺乳動物細(xì)胞的第
一次共培養(yǎng)，和
[0336]ii)在存在抗體產(chǎn)生刺激劑的情況下B-細(xì)胞與表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞的隨后
第二次共培養(yǎng)。
[0337]在首先在存在促有絲分裂刺激劑，然后在存在抗體產(chǎn)生刺激劑的情況下的B-細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)時，B-細(xì)胞的共培養(yǎng)在擴增B-細(xì)胞的第一期和誘導(dǎo)抗體分泌的第二期是分開的。
[0338]在一個實施方案中，所述第一次和第二次共培養(yǎng)在相同的培養(yǎng)容器中進(jìn)行。
[0339]在一個實施方案中，用于培養(yǎng)分泌抗體的B-細(xì)胞的方法包括共培養(yǎng)B-細(xì)胞與表達(dá)CD40L的哺乳動物細(xì)胞，由此向培養(yǎng)中加入第一種促有絲分裂刺激劑，然后向所述培養(yǎng)中加入抗體產(chǎn)生刺激劑。
[0340]在一個實施方案中，在加入促有絲分裂刺激劑后至少一小時加入抗體產(chǎn)生刺激劑。在一個實施方案中，在向培養(yǎng)中加入促有絲分裂刺激劑后一至三天加入抗體產(chǎn)生刺激劑。
[0341]在一個實施方案中，所述促有絲分裂刺激劑選自⑶40-和⑶40L相互作用的化合物、ICOS-和 ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白細(xì)胞介素-1 ( α / β )、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素_3、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素_5、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-14、白細(xì)胞介素-21、SAP (信號傳遞淋巴細(xì)胞激活分子[SLAM]相關(guān)蛋白質(zhì))、葡萄球菌A菌株Cowanl顆粒(SAC ;熱殺死的、福爾馬林固定的)、TLR配體如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、腫瘤壞死因子(TNF) α、I型 干擾素(例如IFN α / β )、II型干擾素(例如IFN Y )、交聯(lián)抗IgG抗體、交聯(lián)抗CD20抗體和交聯(lián)抗CD27抗體。
[0342]在一個實施方案中，所述抗體產(chǎn)生刺激劑選自⑶40-和⑶40L相互作用的化合物、ICOS-和 ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF, CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCLl3,CXCL16、Flt-3L、白細(xì)胞介素-1 ( α / β )、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素_5、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素_9、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-13、白細(xì)胞介素-21、白細(xì)胞介素-33、SAP(信號傳遞淋巴細(xì)胞激活分子[SLAM]相關(guān)蛋白質(zhì))、葡萄球菌A菌株Cowanl顆粒(SAC ;熱殺死的、福爾馬林固定的)、TLR配體如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、腫瘤壞死因子(TNF) α、I型干擾素(例如IFNa / β )、II型干擾素(例如IFN Y )、交聯(lián)抗IgG抗體、交聯(lián)抗CD20抗體和交聯(lián)抗CD27抗體。在一個實施方案中，在第一次共培養(yǎng)開始時加入促有絲分裂刺激劑。
[0343]在一個實施方案中，在第一次共培養(yǎng)開始后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或
14天加入所述促有絲分裂刺激劑。
[0344]在一個實施方案中，在加入促有絲分裂刺激劑后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13或14天加入抗體產(chǎn)生刺激劑。
[0345]在一個實施方案中,共培養(yǎng)的每一次進(jìn)行5-14天。
[0346]在一個實施方案中，培養(yǎng)5-21天的總時長。在一個實施方案中，培養(yǎng)6-14天的總時長。
[0347]在一個實施方案中，在第二次共培養(yǎng)開始前去除促有絲分裂刺激劑。在一個實施方案中，通過交換培養(yǎng)上清液和或用中性培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞進(jìn)行去除。
[0348]如本文報道的一個方面是用于產(chǎn)生特異性地結(jié)合抗原的抗體的方法，其包括以下步驟:
[0349]a)共培養(yǎng)分泌抗體的單個放置的B-細(xì)胞或B-細(xì)胞集合與表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞，
[0350]b)培養(yǎng)包含在一個或多個表達(dá)盒內(nèi)含有編碼步驟a)中共培養(yǎng)的B-細(xì)胞分泌的抗體可變區(qū)或其變體的核酸的細(xì)胞，
[0351]d)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
[0352]在一個實施方案中，共培養(yǎng)是在存在促有絲分裂刺激劑和/或抗體產(chǎn)生刺激劑的情況下。
[0353]在一個實施方案中，所述第一次和/或第二次共培養(yǎng)是在存在IL-2和IL-21的情況下。
[0354]在一個實施方案中，IL-2是人IL-2。在一個實施方案中，IL_2是鼠類IL_2。
[0355]在一個實施方案中，IL-21是人IL-21。在一個實施方案中，IL-21是鼠類IL-21。
[0356]在一個實施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是鼠類IL-21。
[0357]在一個實施方案中，IL-2是鼠類IL-2并且IL-21是鼠類IL-21。
[0358]在一個實施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0359]在一個實施方案中，IL-2是鼠類IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0360]在一個實施方案中，培養(yǎng)是在缺少IL-4的情況下。在一個實施方案中，培養(yǎng)基不含 IL-4。
[0361] 在一個實施方案中包括共培養(yǎng)[0362]i)在存在促有絲分裂刺激劑的情況下B-細(xì)胞與表達(dá)CD40L的哺乳動物細(xì)胞的第
一次共培養(yǎng)，和
[0363]ii)在存在抗體產(chǎn)生刺激劑的情況下B-細(xì)胞與表達(dá)CD40L的哺乳動物細(xì)胞的隨后
第二次共培養(yǎng)。
[0364]在一個實施方案中方法包括以下步驟
[0365]ab)分離編碼特異性結(jié)合抗原的抗體 可變輕鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的核酸并分離編碼所述抗體的可變重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的核酸，
[0366]在一個實施方案中，所述方法包括以下步驟:
[0367]a)提供分泌抗體的(成熟的)B-細(xì)胞群體，
[0368]b)用至少一種熒光染料染色B-細(xì)胞群體的細(xì)胞，
[0369]c)在單獨的容器中放置B-細(xì)胞染色群體的單個細(xì)胞，
[0370]d)在存在表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞以及IL-2和IL-21的情況下培養(yǎng)放置的各B-細(xì)胞，
[0371]e)測定在各B-細(xì)胞的培養(yǎng)中分泌的抗體的結(jié)合特異性，
[0372]f)通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測序測定特異性結(jié)合的抗體的可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并由此獲得單克隆抗體可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的編碼核酸，
[0373]g)在表達(dá)盒中引入單克隆抗體輕鏈和重鏈可變域的編碼核酸用于表達(dá)抗體，
[0374]h)在細(xì)胞中引入核酸，
[0375]i)培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
[0376]在一個實施方案中，從動物或人的血液中獲得B-細(xì)胞。
[0377]在一個實施方案中，用1-3種，或2-3種熒光染料進(jìn)行染色。
[0378]在一個實施方案中，所述容器是多孔板的孔。
[0379]在一個實施方案中，所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。在一個實施方案中，所述哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞，或BHK細(xì)胞，或NSO細(xì)胞，或Sp2/0細(xì)胞。
[0380]如本文報道的一個方法是表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞、IL-2和IL-21在共培養(yǎng)分泌抗體的兔B-細(xì)胞中的用途。
[0381]在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
[0382]在一個實施方案中，IL-2是人IL-2。在一個實施方案中，IL_2是鼠類IL_2。
[0383]在一個實施方案中，IL-21是人IL-21。在一個實施方案中，IL-21是鼠類IL-21。
[0384]在一個實施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是鼠類IL-21。
[0385]在一個實施方案中，IL-2是鼠類IL-2并且IL-21是鼠類IL-21。
[0386]在一個實施方案中，IL-2是人IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0387]在一個實施方案中，IL-2是鼠類IL-2并且IL-21是人IL-21。
[0388]在一個實施方案中，培養(yǎng)是在缺少IL-4的情況下。在一個實施方案中，培養(yǎng)基不含 IL-4。
[0389]在一個實施方案中，所述兔⑶40L具有SEQ ID N0:01的氨基酸序列。
[0390]如本文報道的一個方面是表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞與IL-2和/或IL-21和/或IL-6 —起在共培養(yǎng)分泌抗體的人B-細(xì)胞中的用途。[0391]在一個實施方案中，哺乳動物細(xì)胞是BHK細(xì)胞。
[0392]在一個實施方案中，所述人⑶40L具有SEQ ID NO:02的氨基酸序列。
[0393]如本文報道的一個方法是SAC在共培養(yǎng)分泌抗體的B-細(xì)胞中的用途。
[0394]在一個實施方案中，共培養(yǎng)是與表達(dá)CD40L的哺乳動物細(xì)胞和/或IL_2的共培養(yǎng)。
[0395]提供以下實施例、圖和序列，以幫助理解本發(fā)明，其真正范圍在所附權(quán)利要求中得以顯示。應(yīng)理解，可以在所示方法中進(jìn)行修飾，但不背離本發(fā)明的精神。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0396]圖12，500個純化的兔B-細(xì)胞與5，000個Y -照射的表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞或EL4-B5細(xì)胞共培養(yǎng)7天后B-細(xì)胞的增殖。
[0397]圖2在存在或缺失不同刺激物的情況下共培養(yǎng)6天后B-細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)的顯微圖像:a)EL4-B5細(xì)胞與Zubler混合物，b)表達(dá)rbCD40L的CHO細(xì)胞與人IL-21，
c)表達(dá)rbCD40L的CHO細(xì)胞與人IL-2，d)wt_CH0細(xì)胞與人IL-21以及人IL_2，e)表達(dá)rbCD40L的CHO細(xì)胞與人IL-21以及人IL_2，f)表達(dá)rbCD40L的CHO細(xì)胞與人IL-21以及人 IL-2 和 SAC。
[0398]圖3每孔750個 分選的人IgG+記憶B-細(xì)胞與5，000個Y -照射的表達(dá)⑶40L的BHK細(xì)胞以及所示飼養(yǎng)混合物共培養(yǎng)。顯示了 8天后分離的人記憶B-細(xì)胞的增殖。
[0399]圖4未觸及(untouched)的分離的人B-細(xì)胞的增殖。從PBMC分離后，每孔90，000個集合的人B-細(xì)胞與Y -照射的表達(dá)⑶40L的BHK細(xì)胞以及所示飼養(yǎng)混合物共培養(yǎng)。顯示了 7天后的增殖(絕對細(xì)胞數(shù)量)。
[0400]圖5顯示通過FACS分析的作為增殖程度的CFSE稀釋的點狀圖。顯示了門控CD19+B-細(xì)胞(Y-軸)的CFSE染色(X-軸)。
[0401]圖6溫育3天后的B-細(xì)胞簇(在沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的)。單獨(a)或在存在人IL-2 (b)或IL-2和SAC(c)的情況下培養(yǎng)三天的人B-細(xì)的顯微圖像。
[0402]圖7每孔500個分選的兔IgG+B-細(xì)胞與10，000個Y -照射的表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞以及不同來源的IL-2和IL-21及其組合共培養(yǎng)。顯示了 7天后培養(yǎng)上清液的抗體滴度(中位數(shù))；l:mu IL-2, 2:hu IL-2, 3:mu IL-21, 4:hu IL-21, 5:hu IL-2 和 hu IL-21, 6:huIL-2 和mu IL-21, 7:mu IL-2 和 hu IL-21, 8:mu IL-2 和 mu IL-21 ;y-軸:rb IgG[μg/ml]。
[0403]圖8圖7的共培養(yǎng)的CTG生存力測定的結(jié)果。
[0404]圖9每孔500個融化的分選兔IgG+B-細(xì)胞與10，000個Y -照射的CHO-Kl細(xì)胞(低于檢測極限)或10，000個Y-照射的表達(dá)兔CD40L的CHO細(xì)胞以及不同來源的IL-2和IL-21及其組合共培養(yǎng)。顯示了 7天后培養(yǎng)上清液的抗體滴度(中位數(shù))；l:mu IL_2，2:huIL-2, 3:mu IL-21, 4:hu IL-21, 5:hu IL-2和hu IL-21, 6:hu IL-2 和 mu IL-21, 7:mu IL-2和 hu IL-21, 8:mu IL-2 和 mu IL_21;y_ 軸:rb IgG[μg/ml]。
[0405]圖10圖9的共培養(yǎng)的CTG生存力測定的結(jié)果。
[0406]圖11每孔500個分選的兔IgG+B-細(xì)胞與10，000個Y -照射的CHO-Kl細(xì)胞(右邊的條；由于低于檢測極限而不可見)或10，000個Y-照射的表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞(左邊的條)以及不同來源的IL-2和IL-21及其組合共培養(yǎng)。顯示了 7天后培養(yǎng)上清液的抗體滴度(中位數(shù))。
[0407]圖12圖11的共培養(yǎng)的CTG生存力測定的結(jié)果。
[0408]圖13實施例14中低B-細(xì)胞密度(500個B-細(xì)胞)的B-細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)的顯微圖像。
[0409]圖14每孔2500個分選的兔IgG+B-細(xì)胞與10，000個Y -照射的CHO-Kl細(xì)胞(右邊的條)或10，000個Y -照射的表達(dá)兔⑶40L的CHO細(xì)胞(左邊的條)以及不同來源的IL-2和IL-21及其組合共培養(yǎng)。顯示了 7天后培養(yǎng)上清液的抗體滴度(中位數(shù))。
[0410]序列描述
[0411]SEQ ID NO:01 兔CD40L的氨基酸序列
[0412]SEQ ID NO:02 人CD40L的氨基酸序列 [0413]SEQ ID NO:03 小鼠CD40L的氨基酸序列
實施例
[0414]材料和方法
[0415]重鉬DNA摶術(shù)
[0416]使用如Sambrook, J.，等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法操作DNA。根據(jù)制造商的說明書使用分子生物學(xué)試劑。
[0417]DNA序列測定
[0418]通過在SequiServe GmbH(Vaterstetten, Germany)上進(jìn)行的雙鏈測序測定 DNA 序列。
[0419]DNA和蛋白質(zhì)序列分析和序列數(shù)據(jù)管理
[0420]GCG，s (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin)軟件包版本 10.2 和Infomax’s Vector NTI Advance套件版本8.0用于序列創(chuàng)建、基因定位、分析、注釋和闡明。
[0421]基因合成
[0422]通過Geneart GmbH (Regensburg, Germany)制備編碼兔⑶40L的期望基因區(qū)段的cDNA。所述基因區(qū)段的側(cè)翼是單個的限制性核酸內(nèi)切酶切割位點，以利于如下所述克隆表達(dá)構(gòu)建體。通過DNA測序驗證亞克隆的基因片段的DNA序列。
[0423]細(xì)朐因子
[0424]Zubler 混合物:2ng/ml 小鼠 IL-1 β、50ng/ml 小鼠 IL_2、10ng/ml 小鼠 IL-10 和2ng/ml小鼠TNFa (終濃度)
[0425]測試用于建立確定的細(xì)胞因子混合物的細(xì)胞因子(如果沒有另行說明，以終濃度給出):
【權(quán)利要求】
1.用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情況下共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞的步驟。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述B-細(xì)胞是非成熟的B-細(xì)胞。
3.前述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述IL-2是人IL-2并且所述IL-21是鼠類 IL-21。
4.前述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述B-細(xì)胞是單個放置的B-細(xì)胞。
5.前述權(quán)利要求任一項的方法，其特征在于所述B-細(xì)胞是IgG陽性的B-細(xì)胞(IgG+B-細(xì)胞)。
6.1L-2和/或IL-21用于共培養(yǎng)兔B-細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞的用途。
7.權(quán)利要求6的用途，其特征在于所述飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞。
8.用于培養(yǎng)分泌特異性結(jié)合T-細(xì)胞表面抗原并且介導(dǎo)陰性刺激物至T-細(xì)胞的抗體的兔B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2和IL-21的情況下共培養(yǎng)B-細(xì)胞和表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
9.用于培養(yǎng)分泌抗體的兔B-細(xì)胞的方法，其以以下順序包括 i)在存在促有絲分裂 刺激劑的情況下兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞的第一次共培養(yǎng)，和 ?)在存在抗體產(chǎn)生刺激劑的情況下兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞的隨后第二次共培養(yǎng)。
10.權(quán)利要求9的方法，其特征在于所述促有絲分裂刺激劑選自CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF、CR2、CXCL9、CXCLl2 (SDF-1)、CXCLl3, CXCL16, Flt_3L、白細(xì)胞介素-1 ( α / β )、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素_3、白細(xì)胞介素_4、白細(xì)胞介素-5、白細(xì)胞介素-7、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-14、白細(xì)胞介素-21、SAP (信號傳遞淋巴細(xì)胞激活分子[SLAM]相關(guān)蛋白質(zhì))、葡萄球菌A菌株Cowanl顆粒(SAC ;熱殺死的、福爾馬林固定的)、TLR配體如LPS、不同的CpG ODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、腫瘤壞死因子(TNF) α、I型干擾素(例如IFN α / β )，和II型干擾素(例如 IFN Y ) ο
11.權(quán)利要求9或10任一項的方法，其特征在于所述抗體產(chǎn)生刺激劑選自CD40-和CD40L相互作用的化合物、ICOS-和ICOS-L-相互作用的化合物、APRIL、BAFF, CR2、CXCL9、CXCL12 (SDF-1)、CXCL13、CXCL16、Flt-3L、白細(xì)胞介素-1 ( α / β )、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素_3、白細(xì)胞介素_4、白細(xì)胞介素_5、白細(xì)胞介素_6、白細(xì)胞介素_9、白細(xì)胞介素-10、白細(xì)胞介素-13、白細(xì)胞介素-21、白細(xì)胞介素-33、SAP (信號傳遞淋巴細(xì)胞激活分子[SLAM]相關(guān)蛋白質(zhì))、葡萄球菌A菌株Cowanl顆粒(SAC ;熱殺死的、福爾馬林固定的)、TLR配體如LPS、不同的CpGODN或瑞喹莫德(R-848)、TSLP、腫瘤壞死因子(TNF) α、I型干擾素(例如IFN α / β )，和II型干擾素(例如IFN Y ) ο
12.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗原的抗體的方法，其包括以下步驟: a)在存在IL-2和IL-21的情況下共培養(yǎng)分泌抗體的兔B-細(xì)胞的集合或單個分泌抗體的兔B-細(xì)胞與表達(dá)兔CD40L的哺乳動物細(xì)胞， b)培養(yǎng)包含在一個或多個表達(dá)盒內(nèi)含有編碼步驟a)中共培養(yǎng)的兔B-細(xì)胞分泌的抗體可變區(qū)或其人源化變體的核酸的細(xì)胞，c)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: a)提供分泌抗體的(成熟的)兔B-細(xì)胞群體(其獲得自實驗動物或人的血液)， b)用至少一種熒光染料(在一個實施方案中用1-3，或2-3種熒光染料)染色兔B-細(xì)胞群體的細(xì)胞， c)將B-細(xì)胞染色群體的單個細(xì)胞放置在單獨的容器中(在一個實施方案中是這樣的容器，其為多孔平板的一個孔)， d)在存在表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞以及IL-2和IL21的情況下培養(yǎng)放置的各兔B-細(xì)胞， e)測定在各兔B-細(xì)胞的培養(yǎng)中分泌的抗體的結(jié)合特異性， f)通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測序測定特異性結(jié)合的抗體的可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并由此獲得單克隆抗體可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的編碼核酸， g)在表達(dá)盒中引入單克隆抗體輕鏈和重鏈可變域的編碼核酸或其編碼輕鏈和/或重鏈可變域的人源化形式的變體用于表達(dá)抗體， h)在細(xì)胞中引入核酸， i)培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
14.表達(dá)兔⑶40L的哺乳動物細(xì)胞、IL-2和IL-21在共培養(yǎng)分泌抗體的兔B-細(xì)胞中的用途。
15.SAC在共培養(yǎng)分泌抗體的B-細(xì)胞中的用途，任選地與表達(dá)⑶40L的哺乳動物細(xì)胞和/或IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培養(yǎng)分泌抗體的B-細(xì)胞中的用途。
16.用于產(chǎn)生抗體的方法，其包括在存在IL-2或IL-21或IL-6或其組合的情況下共培養(yǎng)人B-細(xì)胞與表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞的步驟。
17.權(quán)利要求16的方法，其特征在于所述B-細(xì)胞是非成熟的B-細(xì)胞。
18.權(quán)利要求16-17任一項的方法，其特征在于共培養(yǎng)是在存在IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21和IL-6的情況下。
19.權(quán)利要求16-18任一項的方法，其特征在于所述B-細(xì)胞是單個放置的B-細(xì)胞。
20.權(quán)利要求16-19任一項的方法，其特征在于所述B-細(xì)胞是IgG陽性的B-細(xì)胞(IgG+B-細(xì)胞)。
21.1L-2和/或IL-21和/或IL-6用于共培養(yǎng)人B-細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞的用途。
22.權(quán)利要求21的用途，其特征在于所述飼養(yǎng)細(xì)胞是表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞。
23.權(quán)利要求21-22任一項的用途，其特征在于使用IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21 和 IL-6。
24.用于培養(yǎng)分泌特異性結(jié)合T-細(xì)胞表面抗原并且介導(dǎo)陰性刺激物至T-細(xì)胞的抗體的人B-細(xì)胞的方法，其包括在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情況下共培養(yǎng)人B-細(xì)胞和表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞。
25.用于產(chǎn)生特異性結(jié)合抗原的抗體的方法，其包括以下步驟: a)在存在IL-2和/或IL-21和/或IL-6的情況下共培養(yǎng)分泌抗體的人B-細(xì)胞的集合或單個分泌抗體的人B-細(xì)胞與表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞，b)培養(yǎng)包含在一個或多個表達(dá)盒內(nèi)含有編碼步驟a)中共培養(yǎng)的人B-細(xì)胞分泌的抗體可變區(qū)或其變體的核酸的細(xì)胞， c)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
26.權(quán)利要求25的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: a)提供分泌抗體的(成熟的)人B-細(xì)胞群體， b)用至少一種熒光染料(在一個實施方案中用1-3，或2-3種熒光染料)染色人B-細(xì)胞群體的細(xì)胞， c)將B-細(xì)胞染色群體的單個細(xì)胞放置在單獨的容器中(在一個實施方案中是這樣的容器，其為多孔平板的一個孔)， d)在存在表達(dá)人CD40L的哺乳動物細(xì)胞和IL-2和/或IL21和/或IL-6的情況下培養(yǎng)放置的各人B-細(xì)胞， e)測定在各人B-細(xì)胞的培養(yǎng)中分泌的抗體的結(jié)合特異性， f)通過逆轉(zhuǎn)錄酶PCR和核苷酸測序測定特異性結(jié)合的抗體的可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并由此獲得單克隆抗體可變輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域的編碼核酸， g)在表達(dá)盒中引入單克隆抗體輕鏈和重鏈可變域編碼核酸用于表達(dá)抗體， h)在細(xì)胞中引入核酸， i)培養(yǎng)細(xì)胞并從細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中回收抗體，并由此產(chǎn)生抗體，其特異性結(jié)合抗原。
27.權(quán)利要求25-26任一項的方法，其特征在于共培養(yǎng)是在存在IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21和IL-6的情況下。
28.表達(dá)人⑶40L的哺乳動物細(xì)胞、IL-2和/或IL-21和/或IL-6在共培養(yǎng)分泌抗體的人B-細(xì)胞中的用途。
29.權(quán)利要求28的用途，其特征在于使用IL-2、或IL-2和IL-21、或IL-2和IL-21和IL-6。
【文檔編號】C12N5/0781GK103946236SQ201280057401
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月23日
【發(fā)明者】J·恩德爾, J·菲舍爾, P·科恩, S·奧夫納, J·普拉策爾, S·西伯爾 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司