用于制備幾丁質衍生物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開的是包括下述的方法：(1)形成包含微生物組合物和固體幾丁質的水性混合物，其中所述微生物組合物包含產生幾丁質消化酶的一種或多種微生物；和(2)使混合物發(fā)酵足以酶促消化所述幾丁質的全部或部分的時間，以形成包含脫乙酰幾丁質和葡糖胺的經發(fā)酵的混合物。在一些實施例中，幾丁質源自含幾丁質海洋節(jié)肢動物的生物降解。在其他實施例中，幾丁質得自經由化學過程提取的含幾丁質真菌、絲狀真菌和酵母。在另外一個實施例中，幾丁質通過含幾丁質真菌、絲狀真菌、酵母和/或昆蟲的生物降解獲得，優(yōu)選使用HQE用于消化。在一些實施例中，該方法用已含有脫乙酰幾丁質和/或葡糖胺的溶液例如HYTb執(zhí)行，所述HYTb是得自含幾丁質生物體的生物降解的水性級分。
【專利說明】用于制備幾丁質衍生物的方法
【背景技術】
[0001]幾丁質，聚(β (1-4)-N-乙?；?D-葡糖胺)是具有主要重要性的天然多糖。這種生物聚合物由大量活生物體包括甲殼類、昆蟲、真菌、絲狀真菌和酵母合成。考慮全世界每年產生的幾丁質的量，它是在纖維素后的最豐富的聚合物。
[0002]幾丁質的主要商業(yè)來源已經是蟹和蝦殼。在工業(yè)處理中，通過酸處理以溶解碳酸鈣，隨后為堿提取以溶解蛋白質，從甲殼類中提取幾丁質。最重要的幾丁質衍生物是脫乙酰幾丁質，其通過在堿性條件(濃NaOH)下以固態(tài)的幾丁質的(部分)脫乙酰基或通過在幾丁質脫乙?；傅拇嬖谙碌拿复偎猥@得。在控制條件下，幾丁質和脫乙酰幾丁質可聚合，以分別獲得水溶性衍生物例如幾丁質-寡糖(ChOS)和脫乙酰幾丁質-寡糖(COS)。
[0003]這些寡聚物因其生物活性而識別；所述生物活性包括抗腫瘤、殺菌和殺真菌活性，引發(fā)幾丁質酶且調節(jié)植物生長。幾丁質涉及針對細菌侵入的宿主防御，已用于制備親和色譜柱，并且廣泛用于固定酶和全細胞。
[0004]由于其生物可降解性、無毒、生理學惰性、抗菌性、親水性、凝膠形成性質和對蛋白質的親和力，幾丁質已用在除食物外的許多領域例如生物傳感器中?；趲锥≠|的材料也用于工業(yè)污染物的處理。幾丁質可以薄膜和纖維的形式處理。再生的幾丁質衍生物纖維用作造紙過程中的粘合劑，纖維改善紙張的斷裂強度。然而，幾丁質薄膜和纖維的主要發(fā)展是在醫(yī)學和藥物應用中作為創(chuàng)傷敷料材料。
[0005]當幾丁質的脫乙酰基程度達到約50%時，它在含水酸性培養(yǎng)基中變得可溶并且被稱為脫乙酰幾丁質。脫乙酰幾丁質是唯一的假天然陽離子聚合物，并且因此，它用于許多應用中。由于在水性溶液中是可溶的，它在不同應用中主要作為溶液、凝膠或薄膜和纖維使用。脫乙酰幾丁質的主要研究集中于其具有不同分子量和脫乙酰基的制備、其溶液性質對脫乙?；囊蕾?、衍生物的制備和應用。
·[0006]脫乙酰幾丁質比幾丁質更易于處理，但由于其更多親水特征且尤其是pH敏感性，脫乙酰幾丁質材料的穩(wěn)定性一般更低。脫乙酰幾丁質及其衍生物具有已使得它能夠用于許多領域中的多種功能性質，所述領域包括食物、化妝品、生物醫(yī)學、農業(yè)、環(huán)境保護和廢水管理。其中必須認識到脫乙酰幾丁質的特異性的最重要領域是化妝品、藥物和生物醫(yī)學應用。藥物遞送應用包括經口、鼻、腸胃外和經皮施用、植入劑和基因遞送。
[0007]另一要注意的點是與農業(yè)有關的生物活性，因為脫乙酰幾丁質顯示出抗病毒和抗噬菌體活性。它抑制細菌生長和細菌感染，并且刺激植物中的天然防御。還用于種子包被、霜凍保護、肥料和營養(yǎng)素延時釋放到土壤內。
[0008]即使脫乙酰幾丁質已知具有重要的功能活性，但高分子量和高粘度可將用途限制在一些專門領域特別是醫(yī)學和食品工業(yè)中，因為大多數(shù)動物腸，尤其是人胃腸道，不具有加工酶例如幾丁質酶和脫乙酰幾丁質酶，所述酶直接降解幾丁質和脫乙酰幾丁質中的糖苷鍵。與脫乙酰幾丁質不同，它的水解產物和脫乙酰幾丁質寡糖(COS)由于其更短的鏈長和在D-葡糖胺單元中的游離氨基而在水中容易溶解。COS在中性pH下的低粘度和大溶解度已吸引許多研究者的興趣，以利用以其寡糖形式的脫乙酰幾丁質。尤其地，在食物和營養(yǎng)領域中已著重于其改善食物和質量和人健康進展的能力。
[0009]化學和酶促方法廣泛用于COS生產，并且在其中化學水解在工業(yè)規(guī)模生產中更常使用。然而，由于毒性化合物的發(fā)展、與環(huán)境污染相關的更高危險和更低的生產得率，化學水解具有商業(yè)化的一些缺點。酶促過程一般在浴槽中執(zhí)行，并且比化學方法優(yōu)選。這是由于在酶促水解過程中產物的不利化學修飾降到最低。
[0010]由幾丁質生成的其他產物是葡糖胺，它可用于農業(yè)中，已顯示葡糖胺在土壤組合物中的存在引起毛狀體吸收劑的增加，這在增加的植物活力中體現(xiàn)。可觀察到的第一反應是采取墨綠色的根尖的強化，具有輕微卷曲的葉的邊界。這是因為在土壤中應用葡糖胺時，植物誘導的應答類似于植物嘗試防御自身不受真菌、線蟲或昆蟲攻擊(這些實際并不存在)時將產生的的應答。
[0011]在醫(yī)學領域中，葡糖胺已用于治療關節(jié)炎，促進軟骨組織的發(fā)育，用于軟骨的重構中。葡糖胺涉及指甲、腱、皮膚、眼、骨、韌帶和心臟瓣膜的形成，也牽涉膠原和蛋白聚糖的生產。
【發(fā)明內容】

[0012]本發(fā)明公開的是用于增加HYTb中的脫乙酰幾丁質和/或葡糖胺的方法。該方法包括(I)形成包含HYTb、微生物組合物和固體幾丁質的混合物，其中所述微生物組合物包含產生幾丁質消化酶的一種或多種微生物；和(2)使混合物發(fā)酵足以酶促消化所述幾丁質的全部或部分的時間，以形成經發(fā)酵的混合物。在經發(fā)酵的混合物中脫乙酰幾丁質和葡糖胺中的至少一種的量大于在所述HYTb中。
[0013]在可替代實施例中，將混合物稀釋以形成稀釋的混合物，其發(fā)酵以消化所述幾丁質的全部或部分，以形成經發(fā)酵的混合物。在經發(fā)酵的混合物中幾丁質和葡糖胺(考慮到稀釋步驟)中的至少一種的絕對量大于在HYTb中的絕對量。
[0014]在一些實施例中，HYTc是所述幾丁質的來源。一般地，將HYTc微?；孕纬晌⒘；瘞锥≠|和殘留幾丁質。在該方法中使用的幾丁質可以是微?；瘞锥≠|。然而，因為這種形式的幾丁質具有其他商業(yè)用途，所以優(yōu)選殘留幾丁質用于該方法中。
[0015]取決于幾丁質消化程度和方法產物的最終用途，固體可通過離心或過濾方便地從經發(fā)酵的混合物中分離。如果期望微生物組合物中的微生物被保留，則過濾是優(yōu)選的，盡管可使用低g離心。
[0016]幾丁質的來源無需來自于HYTc。例如，可使用源自絲狀真菌和/或酵母的幾丁質。參見例如，公開了從真菌包括絲狀真菌和來自下述的酵母中提取幾丁質的化學方法的美國專利7, 556, 946:接合菌亞綱(Zygomycetes)、擔子菌綱(Basiomycetes)、子囊菌綱(Ascomycetes)和半知菌綱(Deuteromycetes)。例子包括曲霉菌屬(Aspergillum)、青霉屬(Penicillium)、木霉屬(Trichoderma)、酵母屬(Saccaromyces)和裂殖酵母屬(Schizosacaromyces)物種和食用菌例如傘菌屬(Agaricus)、側耳屬(Pleurotus)、牛肝菌屬(Boletus)和香燕屬(Lentinula)物種。
[0017]在優(yōu)選實施例中，微生物組合物包含HQE。
[0018]在另一個實施例中，該方法包括(I)使海洋動物或海洋動物副產品與第一微生物組合物混合，以形成第一混合物，其中所述第一微生物組合物含有一種或多種微生物，其產生將海洋動物或副產品消化成固體級分、水性級分和脂質級分的酶，其中所述固體級分包含幾丁質，并且所述水相包含氨基酸、脫乙酰幾丁質和葡糖胺；(2)使第一混合物發(fā)酵；(3)將第一混合物分離成固體級分、水性級分和脂質級分，其中所述固體級分包含幾丁質，并且所述水相包含脫乙酰幾丁質和葡糖胺；(4)形成包含水性級分、幾丁質和第二微生物組合物的第二混合物，其中所述第二微生物組合物包含產生幾丁質消化酶的一種或多種微生物；(5)使第二混合物發(fā)酵，以形成經發(fā)酵的第二混合物；和(6)任選地，將經發(fā)酵的第二混合物分離成第二水性級分和第二固體級分，其中與第一水性級分相比較，所述第二水性級分具有更高含量的脫乙酰幾丁質和葡糖胺中的至少一種。
[0019]與較早描述的實施例一樣，可將第二混合物稀釋，以形成稀釋的第二混合物，其隨后發(fā)酵以消化幾丁質中的全部或部分，以形成第二經發(fā)酵的混合物。在第二經發(fā)酵的混合物中幾丁質和葡糖胺中的至少一種的絕對量大于在所述第一水性級分中的絕對量。
[0020]HYTc是優(yōu)選的幾丁質來源。它可以是微粒化幾丁質或殘留幾丁質。
[0021]在這個多相發(fā)酵方法中，第一和第二微生物組合物優(yōu)選包含HQE。
[0022]在另外一個實施例中，該方法包括(I)形成包含微生物組合物和固體幾丁質的混合物，其中所述微生物組合物包含產生幾丁質消化酶的一種或多種微生物；和(2)使混合物發(fā)酵足以酶促消化幾丁質的全部或部分的時間，以形成經發(fā)酵的混合物。幾丁質的來源可以是HYTc。作為另外一種選擇，幾丁質可通過非酶促過程源自真菌包括絲狀真菌和/或酵母。參見例如，美國專利7，556，946。
[0023]再進一步地，幾丁質和其他有用的產物可得自含幾丁質生物來源的生物降解，所述含幾丁質生物來源例如上文鑒定的真菌包括絲狀真菌、酵母和昆蟲。該方法包括:(I)使含幾丁質生物來源例如真菌包括絲狀真菌、酵母和/或昆蟲與第一微生物組合物混合，以形成第一混合物，其中所述第一微生物組合物含有一種或多種微生物，其產生將含幾丁質生物來源消化成固體級分、水性級分和任選的脂質級分的酶，其中所述固體級分包含幾丁質，并且所述水相包 含氨基酸、脫乙酰幾丁質和葡糖胺；(2)使第一混合物發(fā)酵；(3)將第一混合物分離成固體級分、水性級分和任選的脂質級分，其中所述固體級分包含幾丁質，并且所述水相包含脫乙酰幾丁質和葡糖胺。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是顯示甲殼類消化以形成HYTb和HYTc的流程圖。HYTc和HYTb隨后用HQE處理以形成HYTd，與HYTb相比較，所述HYTd是具有相對大量的脫乙酰幾丁質和葡糖胺的溶液。
[0025]圖2描述與HYTb相比較，根據(jù)時間的葡糖胺形成。
[0026]圖3是顯示真菌包括絲狀真菌、酵母和/或昆蟲消化以形成HYTb和HYTc的流程圖。HYTc和HYTb任選還用HQE處理以形成HYTd，與HYTb相比較，所述HYTd是具有相對大量的脫乙酰幾丁質和葡糖胺的溶液。
[0027]圖4描述用于制備HYTd的過程。
【具體實施方式】
[0028]本發(fā)明公開的是包括下述的方法:(I)形成包含微生物組合物和固體幾丁質的水性混合物，其中所述微生物組合物包含產生幾丁質消化酶的一種或多種微生物；和(2)使混合物發(fā)酵足以酶促消化幾丁質的全部或部分的時間，以形成包含脫乙酰幾丁質和葡糖胺的經發(fā)酵的混合物。
[0029]在一些實施例中，幾丁質源自含幾丁質海洋節(jié)肢動物的生物降解。在其他實施例中，幾丁質得自經由化學過程提取的含幾丁質真菌、絲狀真菌和酵母。參見例如，美國專利7，556，946。在另外一個實施例中，如本文公開的，幾丁質通過含幾丁質的真菌包括絲狀真菌、酵母和/或昆蟲的生物降解獲得。
[0030]在一些實施例中，該方法用已經含有脫乙酰幾丁質和/或葡糖胺的溶液執(zhí)行。在該方法中固體幾丁質的降解產生更多的脫乙酰幾丁質和/或葡糖胺，使得最終溶液含有更大量的這些組分。在優(yōu)選實施例中，含脫乙酰幾丁質和/或葡糖胺的起始溶液是HYTb。在發(fā)酵后獲得的溶液被稱為HYTd。在一些實施例中，HYTd基本上是具有更高濃度的脫乙酰幾丁質和/或葡糖胺的HYTb。如果例如HYTb含有1.2重量％脫乙酰幾丁質和I重量％葡糖胺，則所得的HYTd將含有更高濃度的這些組分中的一種或兩種，優(yōu)選組分中的兩種。
[0031]幾丁質的來源
[0032]1.含幾丁質節(jié)肢動物的降解
[0033]圖1是顯示甲殼類消化以形成HYTb和HYTc的流程圖，所述HYTb含有脫乙酰幾丁質和葡糖胺，并且所述HYTc含有固體幾丁質。該圖還顯示HYTc和HYTb用微生物組合物HQE后續(xù)處理以形成HYTd，與HYTb相比較，所述HYTd是具有相對大量的脫乙酰幾丁質和葡糖胺的溶液。
[0034]簡言之，在節(jié)肢動物生物降解過程中，微生物組合物用于降解節(jié)肢動物或節(jié)肢動物的廢物組分。它是乳酸發(fā)酵過程。微生物組合物含有產生酶的微生物，所述酶可將含幾丁質的節(jié)肢動物組分降解為幾·丁質、脫乙酰幾丁質、N-乙酰葡糖胺和葡糖胺。它還含有產生酶的微生物，所述酶可降解蛋白質和脂肪，以產生氨基酸和脂質。用于節(jié)肢動物降解的優(yōu)選微生物組合物被稱為HQE。HQE于2010年4月27日保藏于美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)Manassas, VA, USA,并且給予專利保藏指名PTA-10861。
[0035]在優(yōu)選實施例中，海洋節(jié)肢動物是甲殼類，并且優(yōu)選的甲殼類是蝦。蝦副產品包含蝦頭胸部和/或外骨骼。
[0036]在生物降解過程中，優(yōu)選發(fā)酵是兼性需氧發(fā)酵。還優(yōu)選發(fā)酵在約30°C -40°C的溫度下執(zhí)行。PH優(yōu)選小于約6、更優(yōu)選小于約5.5。然而，pH應維持超過約4.3。發(fā)酵執(zhí)行約24-96小時。在一些實施例中，發(fā)酵執(zhí)行約24-48小時且更優(yōu)選24-36小時。這些發(fā)酵時間比實現(xiàn)基本上相同消化量(盡管沒有可檢測的脫乙酰幾丁質和葡糖胺形成)的10-15天的一般現(xiàn)有技術發(fā)酵時間短得多。
[0037]混合物的分離優(yōu)選通過離心(例如約920g)。還可使用重力分離，但由于實現(xiàn)分離所需的時間而不是優(yōu)選的。
[0038]將混合物分離成三個級分:固體級分、水性級分和脂質級分。水性級分包含蛋白質水解物、氨基酸、脫乙酰幾丁質，并且脂質級分包含類固醇、維生素A和E以及類胡蘿卜素色素例如蝦青素。
[0039]如本文使用的，術語“HYTb”指水性級分，并且“HYTc”指得自上述生物降解過程的固體級分。該過程在名稱為“Biodegradation of Crustacean By-products”于 2009 年 12月23日提交的美國專利申請系列號61/289，706、名稱為“Biodegradation Process andMicrobial Composition”于2010年I月29日提交的美國專利申請系列號61/299，869、和名稱為 “Biodegradation Process and Composition” 于 2010 年 6 月 16 日提交的美國專利申請系列號61/355，365中描述，所述專利各自通過引用全文并入本文。HYTb含有氨基酸(約12重量％)、脫乙酰幾丁質(約0.5-1.5重量％)、葡糖胺(約0.5-1.5重量％)和微量元素(約6重量％)，所述微量元素包括鈣、鎂、鋅、銅、鐵和錳。它還含有酶例如尤其是乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、幾丁質酶，乳酸，多肽及其他碳水化合物。
[0040]除了上文對于脫乙酰幾丁質和葡糖胺描述的用途外，單獨或與HYTc和微生物組合物HYTa組合的HYTb可用于處理土壤、種子、幼苗和葉子，如名稱為Microbial Processand Composition for Agricultural Use于2010年6月16日提交的美國專利申請系列號 61/355，447 和名稱為 Microbial Process and Composition 于 2011 年 6 月 14 日提交的美國專利申請系列號13/160，333中公開的，所述專利各自通過引用全文并入本文。
[0041]如本文所述得自幾丁質的微生物消化的HYTd和脫乙酰幾丁質/葡糖胺溶液是類似有用的。參見名稱為Agricultural Uses of HYTd于2011年6月23日提交的美國專利申請?zhí)?61/500，543。
[0042]優(yōu)選HQE用于生物降解過程中。在其他實施例中，優(yōu)選先前制備的HYTb加入HQE或發(fā)酵肉湯中。如上文所述，HYTb含有氨基酸、脫乙酰幾丁質、葡糖胺和微量元素，所述微量元素包括鈣、鎂、鋅、銅、鐵和錳。HYTb還含有酶例如尤其是乳酸酶、蛋白酶、脂肪酶、幾丁質酶，乳酸，多肽及其他碳水化合物。HYTb還可含有來自先前生物降解過程的休眠微生物。此類微生物可變得再活化，并且與如本文另外描述的單獨使用HQE時相比較，與HQE組合促成更強的生物降解過程。
[0043]更具體而言，該過程包括下述步驟: [0044]a.微生物細胞在糖基液中的活化，以增強其生長和生物量形成。
[0045]b.蝦副產品(頭胸部和外骨骼)的研磨，以制備均勻糊劑。
[0046]c.蝦副產品糊劑與至少10%的活化接種物的均勻混合。
[0047]d.使用檸檬酸溶液將混合物中的pH值調整至小于6.0,以抑制微生物的生長且促進構成接種物的微生物細胞的發(fā)展。
[0048]e.混合物在非連續(xù)攪拌系統(tǒng)中在30 - 40°C范圍內的溫度下發(fā)酵至少96小時，pH維持在小于5.0下。定期監(jiān)控pH。如果pH升高超過5.0，則檸檬酸緩沖液以維持pH低于
5.0的量加入。
[0049]f.發(fā)酵物的離心，以分離三個主要級分:幾丁質、液體水解物和有色糊劑。
[0050]g.粗幾丁質的沖洗和沖洗水的再收集，以回收微細固體或礦物質。
[0051]h.幾丁質的干燥和貯存。
[0052]1.液體水解物的干燥和貯存。
[0053]j.將有色糊劑(液體級分)貯存在閉合容器中用于保存。
[0054]該過程和操作原理參考下述詳述得到更佳理解。
[0055]微生物細胞的活化
[0056]如本文公開的微生物組合物用作接種物。HQE的接種物具有約2.5-3.0%(w/v)的微生物濃度。HQE通過在蔗糖溶液(3.75%最終蔗糖濃度)中稀釋至5%進行活化，并且在37°C下溫育5天。優(yōu)選加入HYTb (IOml/升培養(yǎng)物)，以提供礦物質和源自天然的氨基酸的來源。微生物的細胞生長通過在540nm下測量的光密度進行評估?；罨诩s1.7的光密度下完成?；罨蟮奈⑸餄舛仁羌s1.9-3.0%(w/v)。
[0057]樣品制備
[0058]蝦副產品樣品得自蝦加工廠。將輕微解凍和切碎的殘渣(1500g分批)與99克蔗糖(最終濃度6.6%重量％)和85.5ml活化HQE5%(v/w)(細胞光密度=1.7)混合。隨后使用2M檸檬酸將pH調整至5.5。
[0059]發(fā)酵控制
[0060]使混合物在36°C下溫育，伴隨96小時的非連續(xù)攪拌。在發(fā)酵過程期間，通過使用電位計監(jiān)控pH，并且通過用0.1N NaOH滴定直至獲得pH8.5來測定總可滴定酸度(TTA，%)。將TTA表示為乳酸百分比。
[0061]分離條件
[0062]由于蝦青素存在，發(fā)酵產物是具有強烈橙色的粘稠青貯飼料。青貯飼料以1250rpm(930g)離心(5°C)15分鐘，以獲得幾丁質、液體水解物和有色糊劑。手動分離上相(有色糊劑)。通過傾析分離液體水解物，并且用蒸餾水洗滌構成原始幾丁質的沉積物，以分離微細固體。將所得的液體收集且干燥。原始幾丁質、液體水解物和微細固體在60°C下干燥。所有級分都避光貯存。
[0063]2.含幾丁質絲狀真菌、酵母和昆蟲的生物降解
[0064]相同過程用于酶促降解含幾丁質絲狀真菌、酵母和/或昆蟲。圖3是顯示絲狀真菌、酵母和/或昆蟲消化以形·成HYTb和HYTc的流程圖。HYTc和HYTb任選還用HQE處理以形成HYTd，與HYTb相比較，所述HYTd是具有相對大量的脫乙酰幾丁質和葡糖胺的溶液。
[0065]真菌包括絲狀真菌和來自下述的酵母可用于生物降解過程中:接合菌亞綱、擔子菌綱、子囊菌綱和半知菌綱。例子包括曲霉菌屬、青霉屬、木霉屬、酵母屬和裂殖酵母屬物種和食用菌例如傘菌屬、側耳屬、牛肝菌屬和香菇屬物種。
[0066]優(yōu)選的消化真菌包括絲狀真菌、酵母和昆蟲的微生物組合物是HQE。
[0067]3.來自真菌和/或酵母的化學提取
[0068]幾丁質的來源無需來自于HYTc。例如，可使用源自真菌包括絲狀真菌和/或酵母的幾丁質。例如，美國專利7，556，946公開了從真菌包括絲狀真菌和來自下述的酵母中提取幾丁質的化學過程:接合菌亞綱、擔子菌綱、子囊菌綱和半知菌綱。例子包括曲霉菌屬、青霉屬、木霉屬、酵母屬和裂殖酵母屬物種和食用菌例如傘菌屬、側耳屬、牛肝菌屬和香菇屬物種。
[0069]幾丁質消化微生物組合物
[0070]1.HQE 聚牛體
[0071]HQE于2010年4月27日保藏于ATCC，并且給予專利保藏指名PTA-10861。
[0072]HQE部分開發(fā)用于含幾丁質海洋節(jié)肢動物例如甲殼類的生物降解。然而，已測定HQE還可用于將固體幾丁質酶促轉換成脫乙酰幾丁質和葡糖胺。認為如本文公開的其他微生物組合物可用于本文公開的方法中。
[0073]下述是認為涉及生物降解過程的HQE中的微生物及其已知性質。在一些情況下，菌株鑒定為“Bioderpac, 2008”。當物種不是已知的時，物種和菌株鑒定為“Bioderpac，2008”。
[0074]枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) ( SILoSif BS)是革蘭氏陽性菌，其是嗜溫
的并且在25 - 35°C的最適溫度下生長。它是需氧的，并且可在缺氧條件下生長，并且利用廣泛多樣的碳源。它含有兩種硝酸鹽還原酶，其中之一用于氮同化作用。它能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、支鏈淀粉酶、幾丁質酶、木聚糖酶(xilanase)和脂肪酶。
[0075]蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)(菌株HD-1 和HD_73 (SILoSil? BT))
是以周生鞭毛形式的革蘭氏陽性厭氧兼性菌。菌株HD-1和HD-73在芽孢期過程中合成具有不同幾何形式的蛋白質和殺昆蟲劑活性的晶體。菌株HD-1和HD-73在含幾丁質培養(yǎng)基中時分泌外幾丁質酶(exochitanase)，并且可用于在殼寡糖生產過程中降解甲殼類殘渣。
[0076]臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) (Bioderpac, 2008)是革蘭氏陽性和產芽孢的需氧兼性菌。它是嗜溫的并且在20 - 40°C的最適溫度下生長。它產生抗生素雙效菌素A和卡那霉素。
[0077]地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis) (Bioderpac, 2008)是革蘭氏陽性、能動、產芽孢和兼性厭氧菌。它產生桿菌肽、α淀粉酶、內酰胺酶、蛋白酶和堿性磷酸酶。這是與植物或植物材料相關的非致病微生物。
[0078]巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) (Bioderpac, 2008)是革蘭氏陽性好氧菌。它被視為腐生菌。它產生葡萄糖脫氫酶、青霉素淀粉酶、酰胺酶和中性蛋白酶。
[0079]嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) (Bioderpac, 2008)是乳酸菌的八個物種之一的成員。它 是革蘭氏陽性、不形成孢子的，并且在利用乳糖作為主要碳源以產生能量的發(fā)酵過程中產生乳酸。它連同或不連同氧的存在在酸性培養(yǎng)基(PH4-5)中生長。它產生命名為萵苣苦素B的細菌素(bactereocin)、有機酸、二乙酰和過氧化氫。
[0080]干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei) (Bioderpac, 2008)是嗜溫的、兼性厭氧的，其為革蘭氏陽性和非產芽孢的。它具有適應冷溫的能力。其生長的最適PH是5.5。它發(fā)酵半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇和乙酰葡糖胺。這個物種可經過廣泛范圍的pH和溫度生長。它產生淀粉酶。它通過經由下述的產生降低PH來抑制致病菌例如幽門螺桿菌(H.pylori)的生長:(I)有機酸例如乙酸、丙酸或乳酸,或(2)過氧化氫。這種微生物分泌細菌素。
[0081]突光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens) (Bioderpac, 2008)是具有多重鞭毛、被迫需氧的細菌，并且它的最適生長溫度是25 - 35°C。它產生耐熱脂肪酶和蛋白酶。它是針對大量土壤真菌菌株的拮抗劑。它產生次級代謝產物例如抗生素、鐵螯合物和氰化物。它在具有不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中產生內幾丁質酶(endochitanase)和纖維素酶。
[0082]哈茨木霉(Trichoderma harzianum) (TRICH0SIL)是腐生真菌。它顯不出抗菌作用和生物競爭，并且為此具有生物控制性質。它產生降解細胞壁或此類活性組合的酶。當它與一些致病性真菌例如鐮刀菌屬(Fusarium)相互作用時，它產生葡聚糖酶、幾丁質酶、脂肪酶和細胞外蛋白酶。
[0083]大豆根瘤菌(Rhizobium japonicum) (Bioderpac, 2008)是固氮菌。它合成參與氫再循環(huán)的氫化酶系統(tǒng)，以避免它在固氮過程中的喪失。
[0084]掠色固氮菌(Azotobactervinelandii) (Bioderpac, 2008)是需氧菌。它產生固氮酶且能夠固氮。
[0085]巴斯德梭菌(Clostridiumpasteurianum) (Bioderpac, 2008)是專性厭氧的革蘭氏陽性菌。它產生充當?shù)鞍阻F還原中的直接電子供體的鐵三嗪(feirozine)(電子傳遞蛋白質)。
[0086]普通變形桿菌(Proteus vulgaris) (Bioderpac, 2008)是在接近于23°C的溫度下生長的厭氧、兼性革蘭氏陽性菌。它通過它產生的酶將蛋白質蛋白水解降解為游離氨基酸。
[0087]鏈霉菌屬物種(Streptomyces sp.) (Bioderpac, 2008)是革蘭氏陽性土壤菌。它產生代謝不同營養(yǎng)素的多重酶。它可經得住溫度、濕度和營養(yǎng)素來源中的顯著變化。由這些細菌產生的細胞外酶在4.5-6.5的pH下和在60°C下利用幾丁質和脫乙酰幾丁質作為底物。這些是在生物降解過程中的乳酸發(fā)酵開始和終末階段時生成的條件。
[0088]硝化桿菌屬物種(Nitrobacter sp.) (Bioderpac, 2008)是需氧革蘭氏陰性菌,其將亞硝酸鹽轉換成硝酸鹽。它在6 - 9的pH下和在10 - 34°C的溫度下生長。細菌將有機聚合物例如幾丁質降解成由其他生物體利用的化合物，所述其他生物體例如熒光假單胞菌和大豆根瘤菌(Bioderpac2008)。
[0089]微球菌屬物種(Micrococcus sp.) (Bioderpac, 2008)是球形革蘭氏陽性菌。與鏈霉菌屬物種O相關的這種微生物能夠降解膠體幾丁質衍生物。
[0090]HQE可用于酶促消化幾丁質。然而，在這些微生物中，認為下述中的一種、兩種、三種、四種或更多種可從HQE中分離，并且用于將幾丁質降解成脫乙酰幾丁質和葡糖胺:枯草芽孢桿菌((SILoSil? BS)、蘇云金芽孢桿菌(菌株HD-1和HD-73 ( SILoSil? BT)、熒光假單胞菌(Bioderpac, 2008)、哈茨木霉(TRICH0SIL)、鏈霉素屬物種(Bioderpac, 2008)和微球菌屬物種(Bioderpac, 2008)。在優(yōu)選實施例中，微生物組合物含有下述中的至少一
種、至少兩種且優(yōu)選每一種 :枯草芽孢桿菌(SILoSiP BS)、蘇云金芽孢桿菌(菌株HD-1和
HD-73( SILoSil" BT)和哈茨木霉(TRICH0SIL)。在另外一個優(yōu)選實施例中，微生物組合物
包含哈茨木霉(TRICH0SIL)。
[0091 ] 2.HQE中的微牛物纟目和酶促活件
[0092]含幾丁質節(jié)肢動物、真菌、絲狀真菌、酵母和/或昆蟲的組分的生物降解需要水解酶例如蛋白酶、脂肪酶和幾丁質酶。下述組和組的組合也可用于將幾丁質消化成脫乙酰幾丁質和葡糖胺。
[0093]HQE中的主要微生物組包含嗜酸乳桿菌(Biod印ac2008)、枯草芽孢桿菌
(SILoSil" BS)、熒光假單胞菌(BiOcbpac2008)、地衣芽孢桿菌(Biod印ac2008)和哈茨木
霉(TRICHOSIL)。這些微生物能夠生物降解節(jié)肢動物或節(jié)肢動物副產品。當與來自HQE的其他微生物組合時，這個主要組的成員中的一種或多種也具有協(xié)同作用。
[0094]第一組微生物包括由于有機酸和過氧化氫的生產而引起pH降低且穩(wěn)定發(fā)酵的微生物。這個組包括嗜酸乳桿菌(Biod印ac2008)和干酪乳桿菌(Biod印ac2008)。它們的活性在發(fā)酵開始時和在發(fā)酵的最終階段過程中是重要的，以產生用于水解酶的最適pH。它們的活性還產生阻止不需要的微生物生長且有利于幾丁質殘渣去礦化的培養(yǎng)環(huán)境。嗜酸乳桿菌(Biodepac2008)是主要組的成員。[0095]第二組微生物包括產生細胞外酶的微生物。這個第二組包括枯草芽孢桿菌(SILoSHk BS)、蠟狀芽孢桿菌(Biod印ac2008)、哈茨木霉(TRICHOSIL)、大豆根瘤菌(Biodepac2008)和棕色固氮菌(Biodepac2008)。節(jié)肢動物或節(jié)肢動物副產品中的幾丁質鏈與蛋白質分子相關。此類聚合物的分離需要得自由這些微生物產生的幾丁質分解酶和蛋白分解酶的水解作用。兩類酶都破壞聚合物的內部部分上的鏈，以產生不同大小的寡聚物。當達到合適PH條件時，來自這些酶的作用以相繼方式在發(fā)酵過程的中間和最后時期內發(fā)生。在這個組上的微生物和它們產生的環(huán)境條件促進色素和附著至這些殘渣的脂質級分的
釋放。枯草芽孢桿菌(SILoSHk BS)和哈茨木霉(TRICHOSIL)是主要組的成員。
[0096]第三組微生物包括微生物地衣芽孢桿菌(Biod印ac2008)、熒光假單胞菌(Biocbpac2008)、鏈霉菌屬(Biod印ac2008)和梭菌屬(Biod印ac2008)。這些微生物水解寡聚物(殼寡糖和肽)，以產生殼二糖、葡糖胺和游離氨基酸。地衣芽孢桿菌(Biod印ac2008)和熒光假單胞菌(Biod印ac2008)是主要組的成員。
[0097]在優(yōu)選實施例中，可組合第一、第二和第三組微生物中的一種或兩種。作為另外一種選擇，可組合第一、第二和第三組的全部。
[0098]第四組微生物包括蘇云金芽孢桿菌(菌株HD-1和/或HD-73 )、鏈霉菌屬(Bioderpac, 2008)、微球菌屬(Bioderpac, 2008)、硝化桿菌屬(Bioderpac, 2008)和普通變形桿菌(Bioderpac，2008)。第四組微生物可與下述組合:(I)主要組微生物，(2)第一、第二和第三組微生物中的任意種，(3)第一、第二和第三組微生物中的一種或兩種的組合，或
(4)第一、第二和第三組中的全部的組合。這個第四組的添加導致增強生物降解過程的協(xié)同作用。
[0099]這些組包括主要組中的每一種是分別有用的，并且可與現(xiàn)有技術微生物組合物組合，以增強其性能。在這點上，第四組是特別優(yōu)選的。
`[0100]表1闡述上述組合中的一些。第I列是認為在生物降解過程中有活性的HQE中的已知微生物列表。第2列列出來自第I列的微生物，不含第四組微生物中的微生物。第3列顯示主要微生物的組合，而第4、5和6列鑒定來自第一、第二和第三組的微生物的組合。第4列是組I和2的組合；第5
[0101]列具有組I和3,并且第6列具有組2和3。其他有用的組合在第7-10列中
[0102]闡述。
[0103]M I
[0104]培養(yǎng)物組成
[0105]
【權利要求】
1.一種用于增加HYTb中的脫乙酰幾丁質和/或葡糖胺的方法，所述方法包括: 形成包含HYTb、微生物組合物和固體幾丁質的混合物,其中所述微生物組合物包含產生幾丁質消化酶的一種或多種微生物；和 使所述混合物發(fā)酵足以酶促消化所述幾丁質的全部或部分的時間，以形成經發(fā)酵的混合物，其中在所述經發(fā)酵的混合物中脫乙酰幾丁質和葡糖胺中的至少一種的量大于在所述HYTb 中。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中將所述混合物稀釋以形成稀釋的混合物，并且使所述稀釋的混合物發(fā)酵以消化所述幾丁質的全部或部分，以形成經發(fā)酵的混合物，其中在所述經發(fā)酵的混合物中幾丁質和葡糖胺中的至少一種的絕對量大于在所述HYTb中的絕對量。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中HYTc是所述幾丁質的來源。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中將所述HYTc微粒化，以形成微?；瘞锥≠|和殘留幾丁質，并且所述幾丁質包含所述殘留幾丁質。
5.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，所述方法還包括從所述經發(fā)酵的混合物中分離固體以及任選的微生物和細胞。
6.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述微生物組合物包含HQE。
7.一種包含根據(jù)權利要求1到6中任一項所述制備的經發(fā)酵的混合物或溶液的組合物。
8.—種包括下述的方法·: 使海洋動物或海洋動物副產品與第一微生物組合物混合，以形成混合物，其中所述第一微生物組合物含有一種或多種微生物，所述一種或多種微生物產生將所述海洋動物或副產品消化成固體級分、水性級分和脂質級分的酶，其中所述固體級分包含幾丁質，并且所述水相包含氨基酸、脫乙酰幾丁質和葡糖胺； 使所述混合物發(fā)酵； 將所述混合物分離成固體級分、水性級分和脂質級分，其中所述固體級分包含幾丁質，并且所述水相包含脫乙酰幾丁質和葡糖胺； 形成包含所述水性級分、幾丁質和第二微生物組合物的第二混合物，其中所述微生物組合物包含產生幾丁質消化酶的一種或多種微生物； 使所述第二混合物發(fā)酵，以形成經發(fā)酵的第二混合物；和 任選地，將所述經發(fā)酵的第二混合物分離成第二水性級分和第二固體級分，其中與所述第一水性級分相比較，所述第二水性級分具有更高含量的脫乙酰幾丁質和葡糖胺中的至少一種。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中將所述第二混合物稀釋，以形成稀釋的第二混合物，并且使所述稀釋的第二混合物發(fā)酵以消化所述幾丁質的全部或部分，以形成第二經發(fā)酵的混合物，其中在所述第二經發(fā)酵的混合物中幾丁質和葡糖胺中的至少一種的絕對量大于在所述第一水性級分中的絕對量。
10.根據(jù)權利要求8或9所述的方法，其中HYTc是所述幾丁質的來源。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中將所述HYTc微粒化，以形成微粒化幾丁質和殘留幾丁質，并且所述幾丁質包含所述殘留幾丁質。
12.根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，所述方法還包括從所述經發(fā)酵的混合物中分離固體以及任選的微生物和細胞。
13.根據(jù)權利要求8到12中任一項所述的方法，其中所述第二微生物組合物包含HQE。
14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述第一微生物組合物包含HQE。
15.一種包含根據(jù)權利要求8-14中任一項所述制備的第二經發(fā)酵的混合物或第二水性級分的組合物。
16.一種包括下述的方法: 形成包含微生物組合物和幾丁質的混合物，其中所述微生物組合物包含產生幾丁質消化酶的一種或多種微生物；和 使所述混合物發(fā)酵足以酶促消化所述幾丁質的全部或部分的時間，以形成包含脫乙酰幾丁質和葡糖胺的經發(fā)酵的混合物。
17.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述幾丁質源自選自真菌、絲狀真菌、酵母和昆蟲的含幾丁質來源。
18.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中所述微生物組合物包含HQE。
19.一種包括下述的生物降解方法: 使含幾丁質生物來源與微生物組合物混合，以形成混合物，其中所述第一微生物組合物含有一種或多種微生物，所述一種或多種微生物產生消化所述含幾丁質生物來源的酶； 使所述混合物發(fā)酵；和 將所述混合物分離成固體級分、水性級分和脂質級分，其中所述固體級分包含幾丁質，并且所述水相包含脫乙酰幾丁質和葡糖胺。
20.根據(jù)權利要求19所述的生物降解方法，其中所述含幾丁質生物來源選自真菌、絲狀真菌、酵母和昆蟲。
21.根據(jù)權利要求19所述的生物降解方法，其中所述微生物組合物包含HQE。
22.—種包含HYTd的組合物。
【文檔編號】C12P19/04GK103857799SQ201280030890
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年6月25日 優(yōu)先權日:2011年6月23日
【發(fā)明者】J.洛佩茲-塞萬提斯 申請人:阿坤納斯公司