發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于細(xì)菌類毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，包括步驟：a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞用多核苷酸轉(zhuǎn)化，并且其中所述多核苷酸編碼細(xì)菌類毒素和周質(zhì)信號(hào)序列；或提供革蘭氏陰性宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞用多核苷酸轉(zhuǎn)化，并且其中所述多核苷酸編碼細(xì)菌類毒素和周質(zhì)信號(hào)序列并且其中所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞包括在周質(zhì)中表達(dá)的細(xì)菌類毒素；a(i))誘導(dǎo)所述細(xì)菌類毒素的表達(dá)；b)使所述宿主細(xì)胞成熟，其中所述成熟步驟包括：I)使宿主細(xì)胞接受pH休克；II)無補(bǔ)料添加孵育所述宿主細(xì)胞；和/或III)使宿主細(xì)胞接受低于-20℃的溫度；和c)從所述宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。
【專利說明】發(fā)酵方法
[0001]背景
本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生重組蛋白的方法，具體是包括培養(yǎng)表達(dá)重組蛋白的宿主細(xì)胞和使宿主細(xì)胞成熟的步驟的用于產(chǎn)生重組蛋白的方法。本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法可獲得的重組蛋白，和包括所述重組蛋白的免疫原性組合物或疫苗。
[0002]某些毒素的表達(dá)已知是有挑戰(zhàn)性的，例如白喉毒素。DT可以通過純化來自白喉?xiàng)U菌{Corynebacterium diphtheriae)的培養(yǎng)物的毒素，隨后通過化學(xué)解毒產(chǎn)生,或者可以通過純化毒素的重組或遺傳解毒的類似物制成(例如CRM197，或US4，709, 107、US5.846.711、US5, 601，827和US5, 917，017中描述的其它突變體)。
[0003]由于低蛋白豐度，用于疫苗中的白喉毒素例如CRM197的大量的產(chǎn)生已被阻礙。此問題先前已通過在大腸桿菌中表達(dá)CRM197 (Bishai等J.Bacteriol.169:5140-5151)得以解決，Bishai等描述了包含白喉毒素(包括tox信號(hào)序列)的重組融合蛋白的表達(dá)，這導(dǎo)致降解的蛋白的產(chǎn)生。
[0004]包含tox信號(hào)序列的白喉片段的克隆和這些序列在大腸桿菌中的表達(dá)涉及某些困難。表達(dá)的蛋白分泌到周質(zhì)間隙并且此分泌伴隨宿主細(xì)胞的活力降低(O’Keefe等Proc.Natl, Acad.Sc1.86:343-346)和重組蛋白的蛋白水解增加(Bishai等JBacteriol.169:5140-5151)。由于這些原因，已經(jīng)暗示去除tox信號(hào)序列使得表達(dá)不再是在周質(zhì)，這可以增加白喉類毒素的表達(dá)(Bishai等)。
[0005]PCT/EP2010/065047 (W0 2011/042516)首次公開了成功的 CRM197 的周質(zhì)表達(dá)。這增加了 CRM197的產(chǎn)量，但是即使如此，仍然可以進(jìn)行對(duì)提取方法的改善以增加產(chǎn)量。Rathore公開了滲透壓程序的優(yōu)化,用于在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白產(chǎn)物的分離(Rathore等Biotechnol.Prog.2003, 19, 15`41-1546)。Bochner 等還公開了用于從宿主細(xì)胞回收周質(zhì)蛋白的方法(US4680262)。
[0006]從而本發(fā)明提供了改善的用于產(chǎn)生重組多肽的方法，其包括使宿主細(xì)胞成熟的步驟，其中此步驟可以包括下列的任一或更多:
(1)使宿主細(xì)胞接受pH休克；
(2)孵育宿主細(xì)胞；或
(3)冷凍宿主細(xì)胞。
[0007]此使宿主細(xì)胞成熟的步驟具有實(shí)質(zhì)上增加蛋白提取效率的令人驚訝的結(jié)果。
[0008]簡(jiǎn)要概述
在第一實(shí)施方案，提供了用于細(xì)菌類毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，包括步驟:
a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞用多核苷酸轉(zhuǎn)化，并且其中所述多核苷酸編碼細(xì)菌類毒素和周質(zhì)信號(hào)序列。
[0009]a(i))誘導(dǎo)所述細(xì)菌類毒素的表達(dá)；
b)使所述宿主細(xì)胞成熟，其中所述成熟步驟包括:
I)使宿主細(xì)胞接受PH休克；
II)無補(bǔ)料添加孵育所述宿主細(xì)胞；和/或III)使宿主細(xì)胞接受低于-20°C的溫度；和
c)從所述宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。
[0010]在第二實(shí)施方案，提供了用于細(xì)菌類毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，包括步驟:
a)提供包括在周質(zhì)中表達(dá)的細(xì)菌類毒素的革蘭氏陰性宿主細(xì)胞；
b)使所述宿主細(xì)胞成熟，其中所述成熟步驟包括:
I)使宿主細(xì)胞接受PH休克；
II)無補(bǔ)料添加孵育所述宿主細(xì)胞；和/或
III)使宿主細(xì)胞接受低于_20°C的溫度；和
c)從所述宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。
[0011]在第三實(shí)施方案中，提供了通過本發(fā)明方法可獲得或通過本發(fā)明方法獲得的細(xì)菌
類毒素。
[0012]在第四實(shí)施方案，提供包括本發(fā)明細(xì)菌類毒素和藥學(xué)可接受賦形劑的免疫原性組合物。
[0013]在第五實(shí)施方案，提供包括本發(fā)明免疫原性組合物的疫苗。
[0014]在第六實(shí)施方案，提供本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗在用于疾病的預(yù)防或治療的藥物的制造中的用途。
[0015]在第七實(shí)施方案，提供了預(yù)防或治療疾病的方法，包括向患者施用本發(fā)明的免疫原性組合物或疫苗。
[0016]附圖簡(jiǎn)述
圖1-發(fā)酵概況的描述，在20升規(guī)模補(bǔ)料發(fā)酵期間監(jiān)測(cè)發(fā)酵參數(shù)。線I描述添加的基質(zhì)的量(克)，線2描述pH，線3描述攪拌速率(rpm)，線4描述p02 (%)，線5描述溫度(V )并且線6描述添加的堿的量(克)。
[0017]圖2-對(duì)于在pH6.8下進(jìn)行的生長(zhǎng)，作為補(bǔ)料速率和誘導(dǎo)期間pH的函數(shù)的CRM197在周質(zhì)中的產(chǎn)生和細(xì)胞締合級(jí)分的描述。左邊小圖顯示周質(zhì)CRM197的產(chǎn)生。右邊小圖顯示細(xì)胞締合的CRM197的產(chǎn)生。
[0018]圖3-發(fā)酵概況的描述，在20升規(guī)模補(bǔ)料分批發(fā)酵和成熟期間監(jiān)測(cè)方法參數(shù)。線I描述添加的基質(zhì)的量(克)，線2描述pH，線3描述攪拌速率(rpm)，線4描述p02 (%)，線5描述溫度(V )并且線6描述添加的堿的量(克)。箭頭指示成熟步驟的開始。成熟步驟在右邊小圖中放大。
[0019]圖4-本發(fā)明多核苷酸和多肽的序列表。
[0020]發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了用于細(xì)菌類毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，包括步驟:
a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞用多核苷酸轉(zhuǎn)化，并且其中所述多核苷酸編碼細(xì)菌類毒素和周質(zhì)信號(hào)序列。
[0021]a(i))誘導(dǎo)所述細(xì)菌類毒素的表達(dá)；
b)使所述宿主細(xì)胞成熟，其中所述成熟步驟包括:
I)使宿主細(xì)胞接受PH休克；
II)無補(bǔ)料添加孵育所述宿主細(xì)胞；和/或 III)使宿主細(xì)胞接受 低于_20°C的溫度；和c)從所述宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。
[0022]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了用于細(xì)菌類毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，包括步驟:
a)提供包括在周質(zhì)中表達(dá)的細(xì)菌類毒素的革蘭氏陰性宿主細(xì)胞；
b)使所述宿主細(xì)胞成熟，其中所述成熟步驟包括:
I)使宿主細(xì)胞接受PH休克；
II)無補(bǔ)料添加孵育所述宿主細(xì)胞；和/或
III)使宿主細(xì)胞接受低于_20°C的溫度；和
c)從所述宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。
[0023]周質(zhì)是革蘭氏陰性細(xì)菌中細(xì)胞質(zhì)膜和外膜之間的間隙。術(shù)語“周質(zhì)表達(dá)”指在宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白(例如細(xì)菌類毒素)的表達(dá)/產(chǎn)生和其分泌進(jìn)入宿主細(xì)胞的周質(zhì)間隙。周質(zhì)表達(dá)適合通過使用信號(hào)序列實(shí)現(xiàn)，所述信號(hào)序列能引導(dǎo)表達(dá)的蛋白到周質(zhì)。當(dāng)在革蘭氏陰性細(xì)菌中與周質(zhì)信號(hào)序列一起表達(dá)時(shí)，典型地，至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%的目的多肽導(dǎo)向周質(zhì)。
[0024]“重組”核酸是一種具有非天然發(fā)生的序列或具有通過人工組合兩種另外分開的序列區(qū)段制成的序列的核酸。人工組合可以是通過化學(xué)合成，或更常規(guī)地，通過分離的核酸區(qū)段的人工操作，例如通過遺傳改造技術(shù)實(shí)現(xiàn)?！爸亟M”蛋白是一種由異源(例如，重組)核酸編碼的蛋白，所述核酸已被導(dǎo)入宿主細(xì)胞，例如細(xì)菌或真核細(xì)胞。所述核酸可以被導(dǎo)入到具有能夠表達(dá)由所述導(dǎo)入的核酸編碼的蛋白的信號(hào)的表`達(dá)載體上，或所述核酸可以被整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體。
[0025]術(shù)語“使宿主細(xì)胞成熟”指一種方法，其在步驟c)之前進(jìn)行，并且增加重組多肽例如細(xì)菌類毒素從宿主細(xì)胞或周質(zhì)釋放的效率。重組多肽從周質(zhì)釋放的效率可以以多種方法確定。例如通過測(cè)量在滲透壓休克后從周質(zhì)釋放的重組多肽的量，和在滲透壓休克后仍保持與細(xì)胞締合的重組多肽的量，這可以用于計(jì)算所產(chǎn)生的目的多肽的總量(細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì))。在滲透壓休克后保持細(xì)胞締合的多肽的量可以通過使用弗氏壓碎器破碎細(xì)胞后測(cè)量蛋白水平來確定。為了計(jì)算重組多肽從周質(zhì)釋放的效率是否已經(jīng)增加，可以在進(jìn)行具有或不具有成熟步驟的方法后測(cè)量從周質(zhì)釋放的目的多肽的百分比，并且比較百分比。
[0026]提供了能夠使宿主細(xì)胞成熟的步驟的實(shí)例并包括:
(1)使宿主細(xì)胞接受PH休克；
(2)孵育宿主細(xì)胞，任選無補(bǔ)料添加，在高于0°C，高于10°C，高于20°C或高于23°C至少5分鐘，至少10分鐘，至少30分鐘，至少I小時(shí)或至少2小時(shí)。
[0027](3)使宿主細(xì)胞接受低于O °C的溫度至少I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、
I天、2天或5天。
[0028]用于細(xì)菌類毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法的步驟b)可以包括這些步驟的任意一個(gè)，或這些步驟的兩個(gè)或三個(gè)的組合。
[0029]短語“從宿主細(xì)胞提取重組蛋白”指能夠從宿主細(xì)胞釋放重組蛋白(例如細(xì)菌類毒素)的任何方法，典型地，重組蛋白存在于周質(zhì)。短語“從宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類毒素”指能夠從宿主細(xì)胞釋放細(xì)菌類毒素的任何方法，典型地，細(xì)菌類毒素存在于周質(zhì)。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且包括例如滲透壓休克或酶學(xué)方法。任選地，酶學(xué)方法包括使用溶菌酶、消解酶或溶葡球菌酶消化。[0030]短語“周質(zhì)信號(hào)序列”指能夠引導(dǎo)表達(dá)的蛋白(例如細(xì)菌類毒素)到周質(zhì)的信號(hào)序列，這可以在翻譯期間(共翻譯信號(hào)序列)或翻譯后(翻譯后信號(hào)序列)發(fā)生。在革蘭氏陰性細(xì)菌中多肽翻譯期間或之后，如果當(dāng)其附著到目的多肽時(shí)，信號(hào)序列能夠引導(dǎo)表達(dá)的蛋白到周質(zhì)，比不存在信號(hào)序列的情況下，在革蘭氏陰性細(xì)菌的周質(zhì)中發(fā)現(xiàn)更多的所述多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在革蘭氏陰性細(xì)菌例如大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，至少50、60、70、80、90或100%的目的多肽導(dǎo)向周質(zhì)。可以使用報(bào)告蛋白進(jìn)行測(cè)定以測(cè)試是否信號(hào)序列能夠引導(dǎo)周質(zhì)表達(dá)。例如周質(zhì)信號(hào)序列可以插入到編碼綠色熒光蛋白的基因上游，此蛋白可以在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中表達(dá)?？梢允褂蔑@微鏡判斷綠色熒光蛋白在細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)中比較的水平。在一些實(shí)施方案中，所述重組蛋白可以被分泌。
[0031]編碼周質(zhì)信號(hào)序列的多核苷酸可操作地連接編碼重組蛋白(例如細(xì)菌類毒素)的序列。[0032]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括誘導(dǎo)重組蛋白(例如細(xì)菌類毒素)表達(dá)的步驟a(i))。術(shù)語“蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)”指向培養(yǎng)物添加誘導(dǎo)劑例如IPTG(異丙基硫代-β -D-半乳糖苷)，或改變培養(yǎng)物的溫度導(dǎo)致多肽以增加的速率表達(dá)的方法。術(shù)語“蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)”進(jìn)一步涵蓋在合適的條件下孵育培養(yǎng)物以允許在方法的下一步驟之前誘導(dǎo)發(fā)生一定時(shí)期。起始表達(dá)(通過添加誘導(dǎo)劑或改變溫度)和允許表達(dá)發(fā)生(在合適的條件下孵育)花費(fèi)的整個(gè)時(shí)期在本文中稱為“誘導(dǎo)期”。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，誘導(dǎo)期可以持續(xù)5分鐘到 72小時(shí)，從30分鐘到 48小時(shí)，從I到36小時(shí)，從6到26小時(shí)或12到24小時(shí),例如約6、12、18、24、26、36、48或72小時(shí)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的步驟a (i))在步驟a)之后和步驟b)之前發(fā)生，并且在下文稱作步驟a (i))。
[0033]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)包括使宿主細(xì)胞接受pH休克。出于本發(fā)明的目的，短語“使宿主細(xì)胞接受PH休克”指升高或降低發(fā)酵培養(yǎng)基的pH。pH休克可以在發(fā)酵罐中對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行，或者PH休克可以對(duì)已濃縮的(例如通過離心)宿主細(xì)胞進(jìn)行。pH休克可以通過向宿主細(xì)胞在其中懸浮的溶液添加酸或堿進(jìn)行。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，pH休克包括將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH改變多于0.2個(gè)pH單位，多于0.3個(gè)pH單位，多于0.4個(gè)pH單位，多于0.5個(gè)pH單位，或多于0.6個(gè)pH單位。通常，“改變發(fā)酵培養(yǎng)基的pH”包括升高或降低發(fā)酵培養(yǎng)基的pH，并且這可以通過向發(fā)酵培養(yǎng)基添加組分進(jìn)行，例如向發(fā)酵培養(yǎng)基添加酸或堿。
[0035]在一個(gè)實(shí)施方案中，pH休克包括將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH升高多于0.2個(gè)pH單位，多于0.3個(gè)pH單位，多于0.4個(gè)pH單位，多于0.5個(gè)pH單位,或多于0.6個(gè)pH單位。這可以例如通過向發(fā)酵培養(yǎng)基添加堿化劑(例如堿)進(jìn)行。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方案中，pH休克包括將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH降低多于0.2個(gè)pH單位，多于0.3個(gè)pH單位，多于0.4個(gè)pH單位，多于0.5個(gè)pH單位,或多于0.6個(gè)pH單位。這可以例如通過向發(fā)酵培養(yǎng)基添加酸化劑(例如酸)進(jìn)行。
[0037]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述pH休克包括將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH改變0.1-2.0個(gè)pH單位，0.1-2.0個(gè)pH單位，0.1-1.5個(gè)pH單位，0.2-2.0個(gè)pH單位，0.2-1.5個(gè)pH單位，0.2-1.0 個(gè) pH 單位，0.5-2.0 個(gè) pH 單位，0.5-1.5 個(gè) pH 單位，0.5-2.0 個(gè) pH 單位或 0.7-1.5個(gè)pH單位。
[0038]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述pH休克包括將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH升高0.1-2.0個(gè)pH單位，0.1-2.0個(gè)pH單位，0.1-1.5個(gè)pH單位，0.2-2.0個(gè)pH單位，0.2-1.5個(gè)pH單位，0.2-1.0 個(gè) pH 單位，0.5-2.0 個(gè) pH 單位，0.5-1.5 個(gè) pH 單位，0.5-2.0 個(gè) pH 單位或 0.7-1.5個(gè)pH單位。
[0039]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述pH休克包括將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH降低0.1-2.0個(gè)pH單位，0.1-2.0個(gè)pH單位，0.1-1.5個(gè)pH單位，0.2-2.0個(gè)pH單位，0.2-1.5個(gè)pH單位，0.2-1.0 個(gè) pH 單位，0.5-2.0 個(gè) pH 單位，0.5-1.5 個(gè) pH 單位，0.5-2.0 個(gè) pH 單位或 0.7-1.5個(gè)pH單位。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述pH休克通過添加堿實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述堿選自氫氧化鈉、氫氧化銨、碳酸鈉、磷酸鈉和碳酸氫鈉。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述堿是氫氧化銨(NH4OH)或氫氧化鈉(NaOH)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述堿是氫氧化銨。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述堿是氫氧化鈉。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述pH休克通過添加酸實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酸選自鹽酸、硫酸、碳酸、磷酸、醋酸和乳酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述酸是磷酸(H3PO4)tj
[0042]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)包括孵育步驟，其中所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞至少5分鐘，至少10分鐘，至少30分鐘，至少I小時(shí)或至少2小時(shí)，在高于O V、高于5 °C、高于10°C、高于15°C、高于20°C或高于23°C的溫度下。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述孵育步驟包括在 1(TC -50°C>15°C -45°C>20°C -40°C>22°C -38°C>15°C -50°C>15°C -40°C>20°C -38°C>20 °C -50 °C、22 °C -50 °C、22 °C -45 °C 22 °C -40 °C、23 °C -50 °C、23 °C -45 °C、23 °C -40 °C、23 °C -38 °C >23 °C -30 °C >25 °C -50 °C >25 °C -45 V、25 V -40 °C >25 °C -38 °C >25 °C -30 V 的溫度孵育宿主細(xì)胞。
[0043]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述孵育步驟包括在23°C左右或37°C左右的溫度孵育宿主細(xì)胞。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞至少5分鐘，至少7分鐘，至少10分鐘，至少15分鐘，至少30分鐘，至少I小時(shí)，至少90分鐘，至少2小時(shí)，至少3小時(shí)，至少5小時(shí)，至少24小時(shí)或至少2天。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞5分鐘-2年，5分鐘-1年，5分鐘-6個(gè)月，5分鐘-3個(gè)月，5分鐘-1個(gè)月，5分鐘-2周，5分鐘-1周，5分鐘-24小時(shí)，5分鐘-12小時(shí)，5分鐘-6小時(shí)，5分鐘-3小時(shí)，5分鐘-2小時(shí)，5分鐘-1小時(shí)，5分鐘-30分鐘5分鐘-15分鐘，10分鐘-1年，10分鐘-6個(gè)月，10分鐘-3個(gè)月，10分鐘-1個(gè)月，10分鐘-2周，10分鐘-1周，10分鐘-24小時(shí)，10分鐘-12小時(shí)，10分鐘-6小時(shí)，10分鐘-3小時(shí)，10分鐘-2小時(shí)，10分鐘-1小時(shí)，10分鐘-30分鐘，10分鐘-15分鐘，30分鐘-1年，30分鐘-6個(gè)月，30分鐘-3個(gè)月，30分鐘-1個(gè)月，30分鐘-2周，30分鐘-1周，30分鐘-24小時(shí)，30分鐘-12小時(shí)，30分鐘-6小時(shí)，30分鐘-3小時(shí)，30分鐘-2小時(shí)，30分鐘-1小時(shí)，I小時(shí)-1年，I小時(shí)-6個(gè)月，I小時(shí)-3個(gè)月，I小時(shí)-1個(gè)月，I小時(shí)-2周，I小時(shí)-1周，I小時(shí)-24小時(shí)，I小時(shí)-12小時(shí)，I小時(shí)-6小時(shí)，I小時(shí)-3小時(shí)或I小時(shí)-2小時(shí)。
[0045]在一個(gè)實(shí)施方案中，孵育步驟的補(bǔ)料速率低于步驟a)的補(bǔ)料速率。補(bǔ)料速率(或基質(zhì)供應(yīng)速率)是基質(zhì)添加的速率(ml min—1)，其中基質(zhì)包括用于培養(yǎng)的宿主細(xì)胞的食物來源。在一個(gè)實(shí)施方案中，孵育步驟期間的補(bǔ)料速率是低于步驟a)中使用的補(bǔ)料速率的75%、50%、35%、25%、15%、10%、5%、4%、3%、2%或1%。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在孵育步驟期間沒有補(bǔ)料添加，通常這意味著在孵育步驟期間沒有添加基質(zhì)。
[0046]在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)基的pH在孵育步驟期間允許波動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH改變0.1個(gè)單位左右。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在孵育步驟期間沒有pH控制。這意味著，在孵育步驟期間沒有進(jìn)一步的添加酸或堿，以維持恒定pH。
[0047]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟b)包括使宿主細(xì)胞接受低于O °C的溫度至少30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、I天、3天、4天、5天、15天、I個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、I年或2年。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主接受低于(TC、-5 °C、-10°C、-20°C、-40°C、-60°C、-70°C 或-80°C。在進(jìn)一步的實(shí)施方案，所述宿主細(xì)胞接受 0—100O、0—80O、0—20O、0—18O、-5—80O、-10—80°C> -20—80O或-25-80O的溫度，例如約 0°C、-5°C、-10°C、-15°C、-18°C、-22°C、-25°C、-30°C、-40°C、-50°C、-60°C、 -70°C或_80°C的溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞接受低于0°C的溫度5分鐘-10年、15分鐘-10年、40分鐘-10年、I小時(shí)-10年、15分鐘-5年、30分鐘-5年、I小時(shí)-5年、15分鐘-3年、30分鐘-3年、I小時(shí)-3年、15分鐘-2年、30分鐘-2年、I小時(shí)-2年、15分鐘-1年、30分鐘-1年、I小時(shí)-1年、I小時(shí)-15天、2小時(shí)-10天、12小時(shí)-7天或2_5天、例如約30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、I天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、15天、I個(gè)月、6個(gè)月或12個(gè)月。
[0048]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟b)包括冷凍宿主細(xì)胞至少30分鐘、I小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、I小時(shí)、2天、5天、15天、I個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、I年、2年、5年或10年。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟b)包括冷凍宿主細(xì)胞5分鐘-10年、5分鐘-5年、5分鐘-2年、30分鐘-10年、30分鐘-5年、30分鐘-2年、I小時(shí)-10年、I小時(shí)-5年或I小時(shí)-2年。術(shù)語“冷凍”指使宿主細(xì)胞暴露到低于0°C的溫度。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟 c)包括在低于 0°C、-5°C、-1O0C、-200C、-300C、-40°C、-50°C、_70°C或-80°C 的溫度下冷凍宿主細(xì)胞。冷凍宿主細(xì)胞可以導(dǎo)致產(chǎn)生冰晶，但是將宿主細(xì)胞的溫度降低到低于(TC而不導(dǎo)致冰晶的產(chǎn)生也被認(rèn)為是“冷凍宿主細(xì)胞”。
[0049]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)進(jìn)一步包括融化所述細(xì)胞。術(shù)語“融化所述細(xì)胞”指升高宿主細(xì)胞的溫度到高于0°C、10°C或20°C。通常，“融化所述細(xì)胞”將在細(xì)胞已被冷凍之后但在步驟c)之前發(fā)生。
[0050]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b)包括使宿主細(xì)胞接受pH休克隨后孵育步驟，其中所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞至少5分鐘，至少10分鐘，至少30分鐘，至少I小時(shí)或至少2小時(shí)，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的溫度下。
[0051]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟b)包括孵育步驟，其中所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞至少5分鐘，至少10分鐘，至少30分鐘，至少I小時(shí)或至少2小時(shí)，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的溫度下，隨后使宿主細(xì)胞接受pH休克。
[0052]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟b)包括孵育步驟，其中所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞至少5分鐘，至少10分鐘，至少30分鐘，至少I小時(shí)或至少2小時(shí)，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的溫度下，隨后冷凍宿主細(xì)胞至少I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、I天、2天或4天。
[0053]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟b)包括使宿主細(xì)胞接受pH休克隨后冷凍宿主細(xì)胞至少I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、I天、2天或4天。[0054]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟b)包括使宿主細(xì)胞接受pH休克隨后是孵育步驟，其中所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞至少5分鐘，至少10分鐘，至少30分鐘，至少I小時(shí)或至少2小時(shí)，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的溫度下，隨后冷凍宿主細(xì)胞至少I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、I天、2天或4天。
[0055]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟b)包括孵育步驟，其中所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞至少5分鐘，至少10分鐘，至少30分鐘，至少I小時(shí)或至少2小時(shí)，在高于0°C、高于10°C或高于20°C的溫度下，隨后使宿主細(xì)胞接受pH休克再隨后冷凍宿主細(xì)胞至少I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、I天、2天或4天。
[0056]步驟b)可以是在全液體培養(yǎng)基內(nèi)(步驟a)的產(chǎn)物)直接對(duì)細(xì)胞進(jìn)行，和/或步驟a) (i))，可選地細(xì)胞可以在步驟b)之前從發(fā)酵罐移出，在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在步驟
b)之前，細(xì)胞從發(fā)酵罐移出并濃縮，例如使用離心。
[0057]在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性宿主細(xì)胞，例如革蘭氏陰性細(xì)菌。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞選自大腸桿菌，不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter),放線桿菌屬(Actinobacillus),博代氏桿菌屬{Bordetella)、布氏桿菌屬(Brucella)，彎曲菌屬{Campylobacter),藍(lán)細(xì)菌{Cyanobacteria)，腸桿菌屬(Bnterobacter),歐文氏菌屬(Brwinia),弗朗西斯氏菌屬(Franciscella),螺桿菌屬Q(mào)lelicobacter'),嗜血桿菌(Hemophilus)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella),軍團(tuán)菌屬{Legionella),莫拉氏菌屬(Moraxella),奈瑟氏菌屬(Neisseria、,巴氏桿菌屬(Pasteurella),假單胞菌屬iPsoudomorms'),變形桿菌屬(Proteus),沙門氏菌屬(5^7^9/7(9773),沙雷氏菌屬(5krraiia),志賀氏菌屬(免2><977<3),螺旋體屬(Jreponema),弧菌屬(Κ/^rio),和耶爾森氏菌屬{Yersinia)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中,所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞選自大腸桿 菌、假單胞菌屬和莫拉氏菌屬。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
[0058]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟c)包括滲透壓休克。
[0059]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在步驟b)之前不被殺死。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，步驟b)在活的宿主細(xì)胞上進(jìn)行。如果宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物內(nèi)大部分細(xì)胞能夠復(fù)制這認(rèn)為宿主細(xì)胞是“活的”。已知“殺死”細(xì)胞的方法的實(shí)例包括將宿主細(xì)胞暴露于乙醇或高溫。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在步驟b)之前不接受高于40°C、高于50°C或高于60°C的溫度。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在步驟b)之前不向宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物中添加乙醇。
[0060]術(shù)語“在步驟b)期間是活的”指宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物內(nèi)大部分細(xì)胞在整個(gè)成熟步驟
b)期間或其基本上部分是活的。
[0061]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組蛋白是細(xì)菌、病毒或癌癥抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組蛋白是原核蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組蛋白不是生長(zhǎng)激素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組蛋白不是人生長(zhǎng)激素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組蛋白不是CRM197。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組蛋白不是CRM197,并且所述周質(zhì)信號(hào)序列不是flgl。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組蛋白是可溶蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述重組蛋白是表面締合蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述重組蛋白是類毒素，例如細(xì)菌類毒素。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述重組蛋白是衍生自白喉?xiàng)U菌{C.diphtheriae)、肺炎鏈球菌(5:pneumoniae),流感嗜血桿菌(/Z influenzae),莫拉氏菌屬，腦膜炎奈瑟氏菌(N.meningi tidis),金黃色葡萄球菌CS aureus),糞腸球菌(B.faecalius),屎腸球菌(萬.faecium),沙門氏菌屬，沙眼衣原體(C iracAoffiaiis),或表皮葡萄球菌〈S.epidermidis)的蛋白。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述重組蛋白是CRM197。
[0062]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述周質(zhì)信號(hào)序列是異源信號(hào)序列。
[0063]術(shù)語“異源”指來自兩種不同來源的兩種組分，例如多肽或多核苷酸序列。 例如，異源蛋白是一種由衍生自不同來源的多核苷酸或核酸編碼的蛋白，包括來自不同來源的多核苷酸或核酸序列的人工組合，或是一種對(duì)其從中表達(dá)的細(xì)胞類型不天然的蛋白。例如，這指正常不與重組蛋白締合的信號(hào)序列，例如在其天然狀態(tài)下引導(dǎo)不同蛋白到周質(zhì)的信號(hào)序列。例如flgl在其天然狀態(tài)下引導(dǎo)flgl蛋白到周質(zhì)，從而如果其引導(dǎo)flgl之外的蛋白到周質(zhì)，則可以被認(rèn)為是異源信號(hào)序列。
[0064]在一個(gè)實(shí)施方案中，周質(zhì)信號(hào)序列包括
a)任一SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 ;
b)SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 包含 1、2 或 3 個(gè)點(diǎn)突變、插入或缺失的變體；或
c)SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 的至少 10 個(gè)氨基酸的片段。
[0065]任選地，所述 周質(zhì)信號(hào)序列包括任一 SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26，或任一SEQ ID NO:2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26，或任一SEQ ID N0:2、
4、10、12、14、16、18、20、22 或 24，或 SEQ ID NO: 24 或任一 SEQ ID NO: 2、4 或 24，或任一 SEQID NO: 2、10 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、14 或 24，或任一 SEQID NO: 4、10 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、16 或 24，或任一 SEQID NO: 4、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、22 或 24，或任一 SEQID NO: 10、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、16 或 24，或任一SEQ ID NO: 10、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、18 或 24，或任一 SEQ ID N0:12、20 或24 或任一 SEQ ID N0:12、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、22 或 24，或任一 SEQ IDNO: 16、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、22 或 24，或任一 SEQID N0:18、20 或 24，或任一 SEQ ID NO 18、22 或 24。
[0066]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述周質(zhì)信號(hào)序列包括(變體包含)如下序列的1、2或3 個(gè)點(diǎn)突變、插入或缺失:任一 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26，或任一 SEQ ID N0:2、4、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26，或任一 SEQ ID NO: 2、4、10、12、14、16、18、20、22 或 24，或 SEQ ID NO: 24 或任一 SEQ ID NO: 2、4 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、10 或24，或任一 SEQ ID NO: 2、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、10 或24，或任一 SEQ ID NO: 4、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、18或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、16 或 24，或任一 SEQ IDNO: 10、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、14 或 24，或任一 SEQID NO: 12、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、20 或 24，或任一SEQ ID N0:12、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、18 或 24，或任一 SEQ ID N0:14、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、18 或24，或任一 SEQ ID N0:16、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 18、
20或 24，或任一 SEQ ID NO 18,22 或 24。
[0067]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述周質(zhì)信號(hào)序列包括如下序列的至少10、12、15，18或 20 個(gè)氨基酸的片段:任一 SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 或 26，或任一SEQ ID N0:2、4、10、12、14、16、18、20、22、24或26，或任一SEQ ID NO:2、4、10、12、14、16、18、20、22 或 24，或 SEQ ID NO: 24，或任一 SEQ ID NO: 2、4 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、10 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 2、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、10 或24，或任一 SEQ ID NO: 4、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、18或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 4、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、12 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、14 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、16 或 24，或任一 SEQ IDNO: 10、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 10、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、14 或 24，或任一 SEQID NO: 12、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、18 或 24，或任一 SEQ ID NO: 12、20 或 24，或任一SEQ ID N0:12、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、16 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、18 或 24，或任一 SEQ ID N0:14、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 14、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、18 或24，或任一 SEQ ID N0:16、20 或 24，或任一 SEQ ID NO: 16、22 或 24，或任一 SEQ ID NO: 18,20或24，或任一 SEQ ID NO 18、22或24，其能夠引導(dǎo)蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)菌周質(zhì)。
[0068]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述信號(hào)序列包括SEQ ID N0:24。
[0069]在一個(gè)實(shí)施方案中所述周質(zhì)信號(hào)序列由任一下列序列編碼:SEQ ID N0:l、3、5、7、
9、11、13、15、17、19、21或23。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中所述周質(zhì)信號(hào)序列由SEQ ID NO:23編碼。
[0070]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸包括可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。
`[0071]在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟b`)包括通過離心濃縮宿主細(xì)胞的步驟。任選地，這涉及在5000xg-8000xg、6000xg-7000xg或6500xg左右離心細(xì)胞。任選地，細(xì)胞離心30分鐘-2小時(shí),任選地,細(xì)胞離心I小時(shí)左右。
[0072]在一個(gè)實(shí)施方案中步驟a)在 ρΗ4.5-8.5、5.0-8.0、5.5-7.5、5.0-7.0、4.5-6.5 或
6.0-7.0，或約pH 6.0下進(jìn)行。
[0073]在一個(gè)實(shí)施方案中步驟a)在20°〇-401:、251:-351:、271:-321:或281:左右的溫度下進(jìn)行。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方案中對(duì)于步驟a)的大部分，培養(yǎng)物內(nèi)溶氧水平是5%_40%、10%_30%、15%-25% 或 20% 左右。
[0075]在一個(gè)實(shí)施方案中步驟a)在10-1000 IT1的Kla下進(jìn)行。KLa是對(duì)進(jìn)入培養(yǎng)物的氧氣量的度量。KLa越高，則引入培養(yǎng)物的氧氣速率越高。
[0076]可以如下測(cè)量KLa。該方法涉及設(shè)定測(cè)量KLa采用的發(fā)酵罐的培養(yǎng)基體積、溫度、壓力、攪動(dòng)和通氣條件，其通過用氮?dú)馊〈諝鈦泶党鰵怏w，通過恢復(fù)通入空氣來吹進(jìn)氣體，并測(cè)量P02回到其穩(wěn)態(tài)水平時(shí)的速率。
【權(quán)利要求】
1.用于細(xì)菌類毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，其包括步驟: a)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)革蘭氏陰性宿主細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述宿主細(xì)胞用多核苷酸轉(zhuǎn)化，并且其中所述多核苷酸編碼細(xì)菌類毒素和周質(zhì)信號(hào)序列； a(i))誘導(dǎo)所述細(xì)菌類毒素的表達(dá)； b)使所述宿主細(xì)胞成熟，其中所述成熟步驟包括: I)使宿主細(xì)胞接受PH休克； II)無補(bǔ)料添加孵育所述宿主細(xì)胞；和/或 III)使宿主細(xì)胞接受低于_20°C的溫度；和 c)從所述宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。
2.用于細(xì)菌類毒素的周質(zhì)表達(dá)的方法，其包括步驟: a)提供革蘭氏陰性宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞用多核苷酸轉(zhuǎn)化，并且其中所述多核苷酸編碼細(xì)菌類毒素和周質(zhì)信號(hào)序列并且其中所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞包括在周質(zhì)中表達(dá)的細(xì)菌類毒素； b)使所述宿主細(xì)胞成熟，其中所述成熟步驟包括: I)使宿主細(xì)胞接受PH休克； II)無補(bǔ)料添加孵育所述宿主細(xì)胞；和/或 III)使宿主細(xì)胞接受低于_20°C的溫度；和 c)從所述宿主細(xì)胞提取細(xì)菌類毒素，其中所述提取方法包括滲透壓休克。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述pH休克包括使發(fā)酵培養(yǎng)基的pH升高或降低多于0.2個(gè)pH單位或多于0.5個(gè)pH單位或0.1-2.0個(gè)pH單位或0.2-1.0個(gè)pH單位。
4.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述孵育步驟包括孵育宿主細(xì)胞10分鐘-1年、10分鐘-6個(gè)月、10分鐘-12小時(shí)、10分鐘-6小時(shí)或10分鐘-2小時(shí)，任選地在20°C -40°C的溫度，例如23°C左右的溫度下。
5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)包括使宿主細(xì)胞接受低于-20 V、-40 V、-60 V、-70 V或-80 V的溫度至少I小時(shí)、2小時(shí)、5小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、I天、2天或5天。
6.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)包括通過冷凍并然后融化宿主細(xì)胞的步驟。
7.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)包括: -使宿主細(xì)胞接受PH休克，隨后在無補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞； -在無補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞，隨后使宿主細(xì)胞接受PH休克； -在無補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞，隨后使宿主細(xì)胞接受低于_20°C的溫度； -使宿主細(xì)胞接受PH休克，隨后使宿主細(xì)胞接受低于-20°C的溫度； -使宿主細(xì)胞接受PH休克，隨后在無補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞，隨后使宿主細(xì)胞接受低于_20°C的溫度；或 -在無補(bǔ)料添加的條件下孵育宿主細(xì)胞，隨后使宿主細(xì)胞接受PH休克，隨后使宿主細(xì)胞接受低于_20°C的溫度。
8.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞選自大腸桿菌 co7i)、假單胞菌屬 iPseudomonas')和莫拉氏菌屬(MoraxelIa)。
9.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述革蘭氏陰性宿主細(xì)胞在步驟b)期間是活的。
10.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中細(xì)菌類毒素是白喉類毒素，例如CRM197。
11.權(quán)利要求1任一的方法，其中所述周質(zhì)信號(hào)序列是:
a)任一SEQ ID N0:2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 ； b)SEQID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 包含 1、2 或 3 個(gè)點(diǎn)突變、插入或缺失的變體；或 c)SEQID NO: 2、4、6、8、10、12、14、18、20、22、24 或 26 的至少 10 個(gè)氨基酸的片段。
12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括純化細(xì)菌類毒素的步驟d)。
13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包含將細(xì)菌類毒素綴合糖的步驟e)，例如源自肺炎鏈球菌Cs pneumoniae),流感嗜血桿菌(/Z influenzae),腦膜炎奈瑟氏菌(JV.meningi tidis),金黃色葡萄球菌(51 aureus),糞腸球菌(/?.faecalius),屎腸球菌(β.faecium),沙門氏菌屬{Salmonella、,或表皮葡萄球菌(51 epidermidis),例如選自1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 33F 的肺炎鏈球菌莢膜糖或B型流感嗜血桿菌(Hib)多糖或寡糖。
14.前述權(quán)利要求 任一項(xiàng)的方法，其中所述方法在發(fā)酵罐中進(jìn)行。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將細(xì)菌類毒素與進(jìn)一步的抗原混合的步驟f)。
16.通過前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法可獲得的或者獲得的細(xì)菌類毒素。
17.免疫原性組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求16的細(xì)菌類毒素和藥學(xué)可接受賦形劑和/或佐劑。
18.疫苗，其包括權(quán)利要求17的免疫原性組合物。
19.權(quán)利要求17的免疫原性組合物或權(quán)利要求18的疫苗，用于疾病的預(yù)防或治療。
20.權(quán)利要求17的免疫原性組合物或權(quán)利要求18的疫苗在用于疾病的預(yù)防或治療的藥物的制造中的用途。
21.預(yù)防或治療疾病的方法，其包括向患者施用權(quán)利要求15的免疫原性組合物或權(quán)利要求17的疫苗。
【文檔編號(hào)】C12P21/00GK103620050SQ201280028718
【公開日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年4月12日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月13日
【發(fā)明者】P.M.H.德霍泰, P.戈芬 申請(qǐng)人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司