通過離子型表面活性劑選擇性裂解細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明披露了用于選擇性裂解在包含微生物（如細菌或單細胞真菌）的樣品中的真核細胞的方法、成套試劑盒以及裝置。該選擇性裂解是通過在堿性條件下在離子型表面活性劑中孵育該樣品而獲得的。
【專利說明】通過離子型表面活性劑選擇性裂解細胞
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及真核細胞的裂解，具體地說涉及動物細胞(如血細胞)的裂解。本發(fā)明進一步涉及在含有大量其他細胞的樣品中的少量微生物(如細菌或真菌)的檢測。
[0002]發(fā)明背景
[0003]分子診斷學旨在快速檢測在樣品(如血液)中微量的病原體(典型地是細菌)。然而，血液是一種復雜的基質，并且包含用于適應性免疫系統(tǒng)的白細胞(白血球)、用于氧輸送的紅細胞(紅血球)、以及用于傷口愈合的血小板(凝血細胞)。這種組成使得在含有大量細胞物質的樣品(如全血)中直接檢測病原體變得復雜。
[0004]經典的檢測方法包括在選擇性介質和/或含有指示劑的介質上使細菌生長。在可以進行細菌鑒定之前，這樣的分析典型地需要至少I天或2天的培養(yǎng)步驟。
[0005]對基于PCR的方法而言，在新鮮血樣中的細菌量在理論上高到足以在沒有進一步培養(yǎng)存在于這樣的樣品之內的細菌的情況下被檢測到。然而，為了允許及早檢測到微量的細菌，需要較大體積的血液。特別是在白細胞中的大量DNA顯著增加了基于DNA的檢測方法中的背景。來自血紅蛋白中的血紅素的存在也強烈降低了 DNA聚合酶的活性。一微升人全血含有大約4，000到11，000個白細胞和大約150,000到400，000個血小板。DNA在血液中的濃度在30 μ g/ml與60 μ g/ml之間。在體積為IOml的全血中檢測大約10到100，000個的細菌種類的存在是極其挑戰(zhàn)性的。
[0006]大量的白細胞DNA可能產生不相關的PCR產物，或者可能清除為檢測細菌DNA所設計的引物。這使得在可以通過PCR或其他方法檢測細菌DNA之前的真核DNA的徹底DNA純化和分離成為必需。
[0007]除干擾PCR反應本身之外，哺乳動物DNA的量增加了樣品的粘度。另夕卜，來自于裂解的哺乳動物細胞的蛋白質和膜形成妨礙樣品過濾的復合物。這對小型化裝置而言尤其是個問題。進一步稀釋較大樣品體積導致不可接受的較長操作步驟。
[0008]針對以上原因，相應地需要從血樣中去除人類DNA的方法。
[0009]在哺乳動物DNA存在下明確分析細菌DNA的方法是已知的。來自于SIRS實驗室公司(company SIRSLab)的Looxters?使用一種方法來富集來自樣品的甲基化DNA。由于細菌DNA被強烈甲基化，這種方法導致細菌DNA的富集。來自Molzym公司的Molysis?使用離液劑和洗滌劑來選擇性裂解哺乳動物細胞。在這個裂解步驟之后用不受這種離液劑/洗漆劑影響的DNA酶消化。替代途徑(如由羅氏(Roche)商業(yè)化的Septifast?)依賴于特別設計為防止與人類DNA的非特異性結合和人類DNA的擴增的PCR引物對。
[0010]US 6，803，208描述了一種方法，其中在37°C下使摻雜有細菌的血小板的高度稀釋懸浮液裂解15分鐘，隨后可能在0.4 μ m過濾器上過濾少量的裂解樣品，以用于目視檢查保留在過濾器上的細菌。然而這種方法不允許在環(huán)境溫度下處理較大體積的樣品。
[0011]皇家菲利浦電子有限公司(Koninkli jke Philips Electronics N.V.)的未出版國際專利申請PCT/IB2010/055628披露了一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品中的真核細胞的方法，其中向包含真核細胞的樣品中添加非離子型洗滌劑(如Triton X-1OO (聚乙二醇p-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基醚)和緩沖劑以獲得具有至少9.5的PH值的溶液，并且孵育所述溶液持續(xù)充分長到足以裂解真核細胞的時間段。通過裂解在樣品中的白細胞和紅細胞，在保持病原性微生物完整的同時使血細胞DNA降解，這種方法允許處理具有5ml的體積的血樣，并且可以隨后通過離心或過濾進行富集。
[0012]在H.Heerklotz的論文“表面活性劑與脂質膜的相互作用(Interactions ofsurfactants with lipid membranes)，，(生物物理學季評(Quarterly Reviews ofBiophysics)41 (2008)，第205-264頁)中，其論述了選擇性裂解哺乳動物細胞的假設分子機制，并且假設所述選擇性裂解依賴于不同的步驟。首先，表面活性劑確保白細胞和紅細胞的裂解。為了實現這個目的，表面活性劑需要被插入細胞膜的外層中。在第二個步驟中，表面活性劑將進行所謂的翻轉(flip-flop)，并且被轉移到細胞膜的內層中。一旦在內細胞膜和外細胞膜中存在足量的表面活性劑，細胞將被裂解。發(fā)現非離子型表面活性劑(如TritonX-100)良好地適合用于細胞裂解，因為它們在數百毫秒的時間范圍內進行上述步驟。相比之下，SDS需要10到30秒才能插入PC囊泡中。另外，如SDS在室溫下所顯示的，據報道具有更大的或帶電的頭基的表面活性劑穿過膜可能需要數小時或數天。
[0013]如已經在科學文獻中所描述的(參見Heerklotz, H.)，這個假設可以解釋為何離子型表面活性劑不適合于獲得哺乳動物細胞的快速裂解。包含大的、龐大的或帶電的親水基團的表面活性劑(如Tween?)、具有長PEG鏈的離子型表面活性劑和Triton的翻轉運動(flip-flop movement)緩慢，并且因此不適合于獲得快速細胞裂解。另外，具有極疏水性質的表面活性劑(如B1 35或Triton X_45)在其初始插入細胞膜中將遇到困難。離子型表面活性劑被視為不適合用于獲得哺乳動物細胞的快速裂解，這是因為，由于必須穿過親脂性膜的帶電親水基團的存在，這些離子型表面活性劑的帶電親水基團不能容易地進行翻轉轉移。
[0014]與科學知識相反，意外地發(fā)現當離子型表面活性劑與高pH值組合使用時，所述離子型表面活性劑可以在保持微生物病原體完整的同時用于選擇性裂解白細胞和紅細胞。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞的方法。在第二方面，本發(fā)明提供了一種用于進行選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞的方法的成套部件。在一個另外的方面，本發(fā)明提供了 一種用于檢測在含有真核細胞的樣品中的微生物的裝置。
[0015]發(fā)明概述
[0016]本發(fā)明的特定和優(yōu)選方面陳述于附隨的獨立和從屬權利要求中。在適當情況下，來自從屬權利要求的特征可以與獨立權利要求的特征和其他從屬權利要求的特征組合，而不是僅僅如在權利要求所明確陳述的。
[0017]本發(fā)明的一個方面涉及一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞(尤其是動物細胞)的方法。這種方法包括以下步驟:提供含有或者疑似含有微生物的具有真核細胞(尤其是動物細胞)的樣品；向樣品添加具有大約9.0或更大pH值(優(yōu)選大約9.5或更大pH值)的緩沖劑和離子型表面活性劑，以獲得具有大約9.0或更大pH值(優(yōu)選大約9.5或更大pH值)的溶液；以及孵育該溶液充分長到足以裂解真核細胞(尤其是動物細胞)的時間段。
[0018]在具體實施例中，該樣品是血樣，例如像全血。優(yōu)選地，該樣品是脊椎動物樣品，更優(yōu)選哺乳動物樣品，尤其是家養(yǎng)動物、役用動物或農場動物樣品，并且最優(yōu)選地是人類樣
品O
[0019]在其他具體實施例中，這些微生物是細菌和/或單細胞真菌。本發(fā)明的方法也可以適合于檢測單細胞真核病原體，如有鞭毛的原生動物(flagellated protozoan)或頂復門寄生蟲(apicomplexan parasite)。
[0020]根據具體實施例，添加的表面活性劑和添加的緩沖劑的體積與樣品體積之間的比率是在2/1與1/10之間。
[0021]在具體實施例中，如在此所使用的堿性緩沖劑具有高于9的pKa值。在本文中的實例是硼酸鹽、碳酸鹽、CAPS (N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸)、CAPSO (3_(環(huán)己氨基)_2_羥基-1-丙磺酸)、CHES (2-(N-環(huán)己氨基)乙磺酸)、焦磷酸鹽以及乙醇胺。一個具體實例是碳酸鈉。
[0022]在具體實施例中，該方法進一步包括以下步驟:在具有將微生物保留在過濾器上的孔徑的過濾器(如具有小于0.5 μ m的孔徑的過濾器)上過濾所孵育的溶液。
[0023]在具體實施例中，該方法進一步包括以下步驟:在選擇性裂解之后添加酸或酸性緩沖劑以獲得在裂解溶液中的在大約7和8之間的pH值，為“中和步驟”。
[0024]在具體實施例中，在如以上所描述的方法之后繼之為裂解存在于或疑似存在于樣品中的微生物。
[0025]本發(fā)明的另一方面涉及用于進行在此處上文中所描述的方法的成套試劑盒。該試劑盒至少包括堿性緩沖劑和離子型表面活性劑。在優(yōu)選實施例中，該試劑盒包括處于固定比率的堿性緩沖劑和離子型表面活性劑的混合物。在替代實施例中，該試劑盒包括用于具有大約9.0或更大pH值(優(yōu)選大約9.5或更大pH值)的堿性緩沖劑、以及用于離子型表面活性劑的單獨小瓶，使得使用者可以按所希望的比率組合所述堿性緩沖劑與所述離子型表面活性劑。
[0026]在一個具體實施例中，該成套試劑盒可以進一步包括酸或酸性緩沖劑，以用于在堿性裂解在樣品內的真核細胞之后將溶液的pH調節(jié)到在大約7與8之間的值。在又另一個或另外的實施例中，該試劑盒可以包括用于在已經微生物富集之后裂解微生物的并且用于釋放微生物DNA的裂解緩沖劑。
[0027]在具體實施例中，該成套試劑盒包括至少一個用于獲得、處理和/或儲存樣品或在處理樣品期間所產生或獲得的任何溶液的工具。
[0028]在另一個或另外的實施例中，成套試劑盒包括至少一個用于過濾所孵育溶液的工具。所述工具可以是例如具有將微生物保留在過濾器上的孔徑的過濾器。過濾器可以具有小于0.5 μ m的孔徑。過濾器可以呈濾筒形式或呈套筒的一部分的形式。
[0029]本發(fā)明的另一方面涉及一種用于檢測在樣品中的微生物的裝置(1)，該裝置包括:一個用于接受體積在Iml與20ml之間的樣品流體的裂解室(2);—個連接到該裂解室的包含具有大約9.0或更大的pH (優(yōu)選具有大約9.5或更大的pH)的堿性緩沖劑、并且包含離子型表面活性劑的貯器(3)，或者連接到該裂解室的具有大約9.0或更大的pH(優(yōu)選具有大約9.5或更大的pH)的堿性緩沖劑的貯器(31)、一個包含離子型表面活性劑的貯器(32)；一個連接到該裂解室的用于在裂解之后過濾樣品的過濾器(4)，該過濾器具有將細菌保留在該過濾器上的孔徑；以及一個用于分析DNA的存在的檢測室(5)。[0030]此處的堿性緩沖劑典型地具有高于9.0的pKa，并且該離子型表面活性劑典型地是十二烷基硫酸納。
[0031]根據本發(fā)明的方法可以在保持細菌和真菌完整(死的或活的)的同時選擇性裂解在樣品中的白細胞和紅細胞。
[0032]根據本發(fā)明的方法可能在無需實質上稀釋一種樣品的情況下處理這個樣品，并且因此允許處理更大體積的樣品。另外，不需要通過例如DNA酶使DNA酶促降解，使得這種方法相比于現有技術中的已知方法更不復雜。
[0033]如在本發(fā)明中所描述的方法導致具有低粘度和最少聚集物的裂解樣品，這使得可能在保留細菌的過濾器上過濾該裂解樣品。在這樣的過濾器上進一步處理細菌可以用大約100-500 μ I之間的體積進行，這使得可能為了隨后程序而處理較大樣品體積，并且可以在一體化套筒中全自動地進行所需要的操作，如中和與洗滌。
[0034]根據以下詳細說明，結合通過舉例說明本發(fā)明的原理的附圖，本發(fā)明的以上和其他特性、特征和優(yōu)點將變得明顯。所給出的本說明是為了舉例，而不限制本發(fā)明的范圍。以下引用的參考圖是指附圖。
[0035]附圖簡要說明
[0036]圖1顯示了一個用于進行如在本發(fā)明的實施例中所描述的選擇性裂解的裝置的實施例的示意性概觀。
[0037]圖2顯示了一個包括如在本發(fā)明實施例中所描述的選擇性裂解單元的一體化裝置的實例。
[0038]圖3顯示了從全血樣品中富集的銅綠假單胞菌(P.aeroginosa)的定量RT-PCR結果O
[0039]圖4顯示了從全血樣品中富集的白色念珠菌(C.albicans)的定量RT-PCR結果。
[0040]將根據具體實施例并參考某些附圖描述本發(fā)明，但本發(fā)明并不因此限制于此，而是僅由權利要求書限制。權利要求書中的任何參考符號均不應當被視為限制該范圍。所描述的附圖僅是示意性的，并且是非限制性的。在附圖中，出于說明性目的可能夸大一些要素的尺寸，并且不按比例尺繪制。在本發(fā)明的說明書和權利要求書中使用術語“包含/包括(comprising)”的情況下，并不排除其他要素或步驟。在使用不定冠詞或定冠詞的情況下，當參考單數名詞(例如“一個/ 一種(a/an)”或“該(the)”)時，除非特別陳述其他情況，這包括多個名詞。
[0041]此外，在說明書和權利要求書中的術語第一(first)、第二(second)、第三(third)等等用于區(qū)別類似要素，而不必用于描述順序或時間次序。應當理解的是，如此使用的術語在適當情況下可以互換，并且在此所描述的本發(fā)明的實施例能夠以在此所描述或說明的順序之外的其他順序運行。
[0042]以下術語或定義僅僅是為了輔助理解本發(fā)明而提供的。這些定義的范圍不應當被視為具有小于本領域的普通技術人員所理解的范圍。
[0043]實施例的詳細說明
[0044]在本發(fā)明上下文中的“血細胞”涉及在血液中存在的哺乳動物細胞，并且包括紅細胞(紅血球)、 白細胞(白血球)和血小板(凝血細胞)。
[0045]在本發(fā)明上下文中的“全血”涉及包含血漿和細胞的未處理血液，可能用抗凝劑處理。
[0046]“樣品”涉及包含細胞物質的水性懸浮液，并且包含體液(如淋巴)、腦脊髓液、血液(全血和血漿)、唾液，并且還包含例如經均質化的懸浮液的水性成分，例如像肌肉、大腦、肝臟、或者其他組織。
[0047]本發(fā)明中的“真核”涉及任何類型的真核生物，如動物，尤其是含有血液的動物,并且包括無脊椎動物，如甲殼動物和脊椎動物。脊椎動物包括冷血動物(魚類、爬行動物、兩棲動物)和溫血動物(鳥類和哺乳動物)兩者。哺乳動物尤其包括靈長類動物，并且更明確地說人類。本發(fā)明中的術語“真核”不包括真核單細胞生物，如病原性或機會性單細胞真菌和原生動物。
[0048]當在樣品(如血液)中保持完整的微生物細胞(如細菌細胞)在這個樣品中的百分比顯著高于保持完整的來自在從其中收集該樣品的生物的真核細胞的百分比(例如2、5、
10、20、50、100、250、500或1，000倍)時，獲得了如在本發(fā)明中使用的“選擇性裂解”。
[0049]如在本發(fā)明中所使用的“微生物”涉及存在于已經從其中收集樣品的生物中的細菌(革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌、以及細菌芽孢)和單細胞真菌(如酵母和霉菌)，典型地是病原體。
[0050]本發(fā)明的第一方面涉及一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物(如細菌)的樣品內的真核細胞(尤其動物細胞)的方法。該方法的目標是增加用于檢測在樣品中的微量微生物(即，每毫升樣品中的微生物少于10，000、1,000、100或甚至更少)的試驗的敏感性。如在發(fā)明背景中所解釋的，在樣品中的來自真核細胞(尤其來自動物細胞)的DNA干擾基于PCR的檢測方法，并且這種DNA與蛋白質和膜一起形成聚集物，這些聚集物在裂解之后增加粘度并且對裂解樣品的過濾具有顯著影響。為了解決這個問題，選擇性裂解真核細胞(尤其是動物細胞)，由此這些微生物的大部分(即，超過20%、40%、60%、80%、90%或甚至超過95%)保持有活性，或者在如果通過處理殺死時仍然在細胞壁內包含細菌DNA。在如本發(fā)明中所描述的方法中著手解決了上述問題。
[0051]如在本發(fā)明中所描述的方法適用于其中來自微生物(尤其是來自細菌)的DNA的檢測被包含DNA的其他細胞(尤其來自其中微生物以病原體形式存在的宿主的細胞)的存在削弱的任何類型的樣品。
[0052]現在針對其中研究哺乳動物血樣中的微量細菌或真菌細胞的存在的實施例來進一步說明如在本發(fā)明中所描述的方法。
[0053]血樣可以被儲存為全血或者經過處理的成分(如血漿或血小板制劑)。典型地，如在本發(fā)明中所描述的方法是針對新鮮分離的全血進行的。通常用例如肝素、EDTA或檸檬酸鹽處理這樣的樣品以避免凝固。
[0054]作為替代方案，該方法是通過從血管(如動脈或靜脈)將血液直接收集在具有洗滌劑和緩沖劑的試管中而針對新鮮血液進行的。
[0055]相應地，新鮮血樣或保存的樣品中補充有緩沖劑和離子型表面活性劑。緩沖劑的選擇以及其濃度被選擇為了補償所提供血樣的緩沖能力，并且獲得大約9.0或更大的pH值，優(yōu)選地獲得大約9.5或更大的pH值，其中高于11.5的pH值尤其適合于革蘭氏陽性細菌和真菌。在一個具體實施例中，緩沖劑具有9.0或更大的pH。在一個優(yōu)選實施例中，緩沖劑具有在大約9.5與大約11.5之間，優(yōu)選地在大約9.5與大約10.5之間的pH。在一個具體實施例中，在獲得包含樣品的溶液中的pH值在大約9.5與大約11.5之間，甚至更具體在大約9.5與大約10.5之間。同樣，緩沖劑是充分濃縮的，使得至多具有樣品體積的200%、150%、100%、50%、20%或者10%的體積的緩沖劑被添加到樣品中，以獲得所希望的在pH值方面的變化。
[0056]在本發(fā)明上下文中的適合的緩沖劑典型地具有高于9、高于9.5或甚至高于10的pKa，并且包括硼酸鹽、碳酸鹽、CAPS、CAPSO, CHES、焦磷酸鹽、乙醇胺以及具有在上述pH值范圍內的最優(yōu)緩沖能力的其他常用緩沖劑。
[0057]適合的表面活性劑是離子型表面活性劑,其一方面僅對真核細胞(尤其是動物細胞)具有裂解作用，并且另一方面對DNA和蛋白質具有增溶作用。該離子型表面活性劑可以是陰離子型表面活性劑或者陽離子型表面活性劑(即，具有陽離子基團的表面活性劑分子)。
[0058]陰離子型表面活性劑具有陰離子基團，基于永久性陰離子(如硫酸鹽、磺酸鹽或磷酸鹽)或基于PH值依賴性陰離子(如羧酸鹽)。陰離子型表面活性劑選自下組，該組由以下各項組成:烷基硫酸鹽、烷基醚硫酸鹽、多庫酯鹽、磺酸鹽氟表面活性劑(sulfonatefluorosurfactant)、燒基苯磺酸鹽、燒基芳基醚磷酸鹽、燒基醚磷酸鹽、燒基羧酸鹽以及羧酸鹽氟表面活性劑。陰離子型表面活性劑的實例是十二烷基硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉、正十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基醚硫酸鈉(SLES)、肉豆蘧醇聚醚硫酸鈉(sodium myreth sulfate)、琥拍酸二異辛酯磺酸鈉、全氟辛燒磺酸鹽(PF0S)、全氟丁燒磺酸鹽、硬脂酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉、全氟壬酸鹽、以及全氟辛酸鹽(PF0A或PF0)。
[0059]陽離子型表面活性劑包含陽離子基團，并且pH值依賴性陽離子型表面活性劑是基于伯胺、仲胺或叔胺，而永久性帶電陽離子型表面活性劑是基于季銨陽離子。陽離子型表面活性劑的實例是十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、牛油胺聚氧乙烯醚(Ρ0ΕΑ)、苯扎氯銨(BAC)、芐索氯銨(BZT)、5-溴-5-硝基-1，3- 二噁烷、雙十八烷基二甲基氯化銨以及雙十八烷基二甲基溴化銨(DODAB)0
[0060]表面活性劑的最有效濃度取決于不同的表面活性劑而變化,但典型地在0.1%與5%之間，更具體地說在0.1%與1%之間的范圍內。取決于洗滌劑(固體或液體)，％分別是指w/V% 或 v/V%o
[0061]在緩沖劑和洗滌劑的存在下的血樣的孵育是在10分鐘內，優(yōu)選地在30秒與10分鐘之間，且更優(yōu)選地在大約I到3分鐘之間，在大約I到5分鐘之間，在大約I到8分鐘之間、或在大約I到10分鐘之間，在10°C與30°C之間的溫度下進行的。根據本發(fā)明的方法具有的優(yōu)點在于在0.5到3分鐘內在低于30°C的溫度下獲得選擇性裂解。相應地，這些方法通?？梢栽诃h(huán)境溫度下進行，而不需要加熱樣品。
[0062]任選地，在裂解之后，通過添加酸或者酸性緩沖劑將裂解樣品的pH值調到中性值(即，在7與8之間)。發(fā)現處于中性pH的裂解樣品可以被儲存持續(xù)延長的時間(長達1、2、
6、12或甚至24小時)，而不發(fā)生細菌細胞的進一步裂解，并且在裂解樣品的流體特性方面沒有顯著變化。
[0063]在本發(fā)明的方法中研究的另一個參數是在裂解之后的血樣的流體特性的評估。這可以通過驗證可以通過具有2.5cm直徑的0.22 μ m過濾器過濾的裂解血液的體積而進行測定。根據本發(fā)明的方法允許過濾至少2、5、7.5或甚至IOmL的通過向I體積樣品添加I體積緩沖劑/洗滌劑溶液而稀釋的全血。
[0064]通常，根據本發(fā)明的方法包含其中從樣品中分離完整微生物的步驟，典型地通過離心或過濾而進行。在具體實施例中，通過使裂解樣品穿過孔徑在I μ m以下的保留微生物(典型地具有在0.5 μ m與10 μ m之間大小)的過濾器(如具有0.4 μ m或0.22 μ m孔徑的可商購的過濾器)而從該樣品中分離完整微生物。為了過濾樣品，存在多種多樣可商購的裝置，如適合于安裝在針筒上的過濾器，使得在針筒內裂解之后，可以通過對針筒的柱塞手動施壓使流體穿過過濾器。這些裝置可以是本發(fā)明的成套試劑盒的一部分。
[0065]此后可以研究微生物在過濾器上的存在。在具體實施例中，通過PCR研究微生物的存在。為了這個目的，可以將微生物從過濾器上洗掉，并且進一步處理用于PCR擴增。作為替代方案，用裂解緩沖劑沖洗過濾器以便使DNA從微生物釋放，該DNA進一步用于PCR反應。
[0066]可以在一個裝置內進行樣品的裂解、微生物的過濾和檢測(示意性地描繪于圖1中)。相應地，本發(fā)明的一個方面涉及一種裝置(I)，包括用于接受具有體積在Iml與IOml之間的樣品流體的裂解室(2);包含具有如上文所描述的表面活性劑的堿性緩沖劑的貯器(3)，或者包含如上文所描述的堿性緩沖劑的貯器(31)和包含如上文所描述的表面活性劑的貯器(32)，這些貯器連接到裂解室(2)。在該裝置內，該裂解室連接到過濾器(4)，該過濾器用于在裂解之后過濾樣品由此將微生物保留在該過濾器上。該裝置進一步包括從過濾器中去除微生物并且將它們在分離室中裂解的通道。作為替代方案，該裝置進一步包括用于裂解在過濾器上的微生物的工具、以及將來自裂解細菌或真菌細胞的DNA從過濾器轉移到分離室中的通道。該裝置可以進一步包含用于分析DNA的存在的DNA純化和檢測室(5)。檢測室通常是PCR模塊。
[0067]一種其中進行選擇性裂解以及隨后的DNA純化和鑒定的裝置的實例描繪于圖2中。
[0068]體現本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的其他安排對于本領域的技術人員而言將是顯而易見的。
[0069]應當理解的是，雖然針對根據本發(fā)明的裝置在此已經論述了優(yōu)選的實施例、特定構造和配置、以及材料，可以在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下做出在形式和細節(jié)方面的各種變化或修改。
[0070]實例I
[0071]從血樣回收微生物
[0072]在每5mL人類全血樣品中摻入大約1，000菌落形成單位(cfu)的銅綠假單胞菌或白色念珠菌。添加相等體積的裂解緩沖劑(500mM碳酸鈉(pH 10.0)和1.0%Triton X-100(終濃度)或1%十二烷基硫酸鈉(終濃度)，并且在室溫(大約23 °C )下將混合物孵育3分鐘。
[0073]在孵育之后，用IM Tris溶液中和裂解樣品以恢復pH值。將樣品離心，并且用ImL磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌。此后，通過添加預加熱的200mM NaOH、1%SDS將這些微生物裂解，并且使用標準硅離心柱(silica spin column)在用IM檸檬酸中和洗脫液之后將它們的DNA純化。
[0074]實例2[0075]微生物DNA的檢測
[0076]為了從過濾器中洗脫并為了堿性裂解微生物，將微生物細胞再懸浮于100μ I的含有50mM NaOH和0.25%SDS的裂解溶液中。隨后將樣品在70°C孵育10分鐘，快速冷卻到室溫，并且通過添加30μ 1500mM Tris-HCl (pH7.0)進行中和(產生150mM Tris的終濃度，即NaOH濃度的3倍)。
[0077]為了粗裂解物的PCR，通過離心(5分鐘，14，OOOg)從樣品去除未裂解的細胞和碎片。將1μ I上清液添加到25μ I的PCR反應物中。經由PCR的檢測是基于靶向rRNA基因的Taqman PCR分析(阿波羅(Apollo))。使用500nM正向引物和300nM反向引物以及FAM-BHQl標記探針(所有寡核苷酸由Biolegio BV定制合成)，在Taqman通用預混液(Taqman Universal mastermix)(應用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems))中進行 PCR反應。在伯樂(Biorad)CFX實時PCR系統(tǒng)中進行PCR反應。在95°C 10分鐘的初始加熱步驟以活化熱啟動聚合酶之后，使用50個在95°C 15秒接著在60°C I分鐘的循環(huán)以用于擴增。在60°C步驟期間的每一次循環(huán)中檢測熒光信號。用伯樂CFX軟件進行數據分析。
[0078]Ct (循環(huán)閾值)被定義為使熒光信號越過閾值(即，超出背景水平)所需要的循環(huán)數。Ct水平與在樣品中的目標核酸的量成反比(即Ct水平越低，在樣品中的目標核酸的量越高)。Ct值〈29是強陽性反應，指示在樣品中的豐富目標核酸。30-37的Ct值是陽性反應，指示中等量的目標核酸。38-40的Ct值是弱反應，指示最低量的目標核酸(可能代表環(huán)境污染)。
[0079]圖3和4展示了來自全血的微生物的差異裂解和富集的Taqman PCR分析的結果。圖3顯示了在最初來自5ml血液中的1，000 cfu的銅綠假單胞菌DNA的PCR擴增期間所獲得的相對熒光，其中用Triton X-100或十二烷基硫酸鈉進行白細胞和紅細胞的裂解。圖4顯示了在最初來自5ml血液中的1，000 cfu的白色念珠菌DNA的PCR擴增期間所獲得的相對熒光，其中用Triton X-100或十二烷基硫酸鈉進行白細胞和紅細胞的裂解。圖3和圖4兩者顯示了導致類似的熒光產率(fluorescence yield)的非離子型表面活性劑和離子型表面活性劑。因此，可以得出結論，離子型表面活性劑在裂解血細胞和去除PCR抑制化合物中與非離子型表面活性劑是一樣有效的。因此，離子型表面活性劑適合于血細胞的選擇性裂解，并且可以與高PH值組合用于差異裂解血細胞，同時使存在于血樣中的微生物保持完整。此外，銅綠假單胞菌是革蘭氏陰性細菌，并且很容易受到洗滌劑損害。它仍然在血細胞的裂解后存活。白色念珠菌是單細胞真菌，并且因其堅硬的細胞壁和難以裂解而熟知。然而，本發(fā)明的方法允許檢測在通常從患者獲得的標準體積的血樣(用于基于常規(guī)培養(yǎng)的診斷學)之內的少量白色念珠菌細胞。此外，該方法可以在環(huán)境溫度下(如室溫)進行，并且不需要添加任何用于降解和去除真核細胞的核酸和蛋白質的酶。
【權利要求】
1.一種用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞的方法，所述方法包括以下步驟: _a)提供一種含有或疑似含有微生物的具有真核細胞的樣品， -b)向所述樣品添加一種離子型表面活性劑和一種緩沖劑，以獲得具有大約9.0或更高的PH的溶液， -c)孵育所述溶液持續(xù)充分長到足以裂解這些真核細胞的時間段。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述樣品是一種哺乳動物血樣。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述血樣是全血。
4.根據權利要求1到3中任一項所述的方法，其中所述微生物選自下組，該組由以下各項組成:細菌和真菌。
5.根據權利要求1到4中任一項所述的方法，其中所述孵育步驟c)進行30秒到10分鐘。
6.根據權利要求1到5中任一項所述的方法，其中所添加洗滌劑和所添加緩沖劑的體積與樣品體積之間的比率在2/1與1/10之間。
7.根據權利要求1到6中任一項所述的方法，其中該離子洗滌劑是是以0.1%到5%(w/v%或v/v%)濃度在溶液中存在。
8.根據權利`要求1到7中任一項所述的方法，其中該離子型表面活性劑選自下組，該組由以下各項組成:陰離子型表面活性劑和陽離子型表面活性劑，該陰離子型表面活性劑優(yōu)選地選自下組，該組由以下各項組成:烷基硫酸鹽、烷基醚硫酸鹽、多庫酯鹽、磺酸鹽氟表面活性劑、烷基苯磺酸鹽、烷基芳基醚磷酸鹽、烷基醚磷酸鹽、烷基羧酸鹽以及羧酸鹽氟表面活性劑，更優(yōu)選地選自下組，該組由以下各項組成:十二烷基硫酸銨、十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉、正十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基醚硫酸鈉(SLES)、肉豆蘧醇聚醚硫酸鈉、琥珀酸二異辛酯磺酸鈉、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)、全氟丁烷磺酸鹽、硬脂酸鈉、月桂酰肌氨酸鈉、全氟壬酸鹽以及全氟辛酸鹽(PFOA或PFO)，并且該陽離子型表面活性劑優(yōu)選地選自下組，該組由以下各項組成:十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、牛油胺聚氧乙烯醚(POEA)、苯扎氯銨(BAC)、芐索氯銨(BZT)、5-溴-5-硝基-1，3- 二噁烷、雙十八烷基二甲基氯化銨以及雙十八烷基二甲基溴化銨(DODAB)。
9.根據權利要求8所述的方法，其中該離子型表面活性劑是十二烷基硫酸鈉(SDS)。
10.根據權利要求1到9中任一項所述的方法，進一步包括離心所述孵育溶液和分離所述微生物的步驟。
11.根據權利要求1到9中任一項所述的方法，進一步包括在過濾器上過濾所述孵育溶液的步驟，該過濾器具有將微生物保留在所述過濾器上的孔徑。
12.根據權利要求1到11中任一項所述的方法，進一步包括裂解所述微生物的步驟。
13.根據權利要求1到12中任一項所述的方法，進一步包括基于核酸的分子檢測。
14.一種包含用于選擇性裂解在含有或疑似含有微生物的樣品內的真核細胞并檢測所述微生物的成套試劑盒，該成套試劑盒至少包含堿性緩沖劑和離子型表面活性劑。
15.一種用于檢測在樣品中的微生物的裝置(1)，包括: -一個用于接受具有在Iml與20ml之間的體積的樣品流體的裂解室(2)，-一個包含具有大約9.0或更高的pH的堿性緩沖劑并且包含離子型表面活性劑的貯器(3)，或者一個包含具有大約9.0或更高的pH的堿性緩沖劑的貯器(31)和一個包含離子型表面活性劑的貯器(32 )，所述貯器連接到裂解室(2 )， -一個連接到裂解室(2)以用于在裂解之后過濾該樣品的過濾器(4)，所述過濾器(4)具有將細菌保留在該過濾器上的孔徑，以及-一個用于分析DNA的存在的檢測室(5)。
16.根據權利要求15所述的裝置，其中該堿性緩沖劑具有高于9.0的pKa且/或該離子型表面活性劑是十二烷基硫酸鈉。`
【文檔編號】C12N5/00GK103518132SQ201280021127
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年4月30日 優(yōu)先權日:2011年6月6日
【發(fā)明者】伊雷妮·多伯拉爾, 西格林德·尼爾肯, 保羅·凡德維爾, 巴特·凡米爾伯根, 羅埃爾·彼得曼 申請人:比奧卡爾齊什股份有限公司