用于細(xì)胞免疫治療的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了諸如在腫瘤特異性、亞群特異性遺傳修飾的CD4+T細(xì)胞存在下，通過過繼轉(zhuǎn)移遺傳修飾的腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞，賦予和/或增強(qiáng)細(xì)胞免疫治療介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法和組合物，其中所述CD4+T細(xì)胞賦予和/或增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞維持抗腫瘤反應(yīng)性的能力，且增加和/或最大化感興趣的腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的腫瘤特異性增殖。還公開了通過所述方法制備的藥物制劑及其使用方法。
【專利說明】用于細(xì)胞免疫治療的方法和組合物
[0001]本申請作為PCT國際專利申請于2012年3月23日提交，以美國國立公司弗雷德哈欽森癌癥研究中心(Fred Hutchinson Cancer Research Center)作為除美國以外的所有指定國家的 申請人:，僅作為指定美國的 申請人:為加拿大公民Stanley R.Riddell和德國公民Michael Hudecek ;本申請要求于2011年3月23日提交的美國專利申請N0.61/466，552的優(yōu)先權(quán)，該美國專利申請的公開內(nèi)容以引用的方式全部并入本文中。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是用于癌癥治療的方法。具體地，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法和組合物。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究的聲明
[0004]本發(fā)明是在政府扶持下完成的，其扶持形式為來自美國衛(wèi)生和公共服務(wù)部、國立衛(wèi)生研究院以及白血病和淋巴瘤協(xié)會SCORE資助的R01CA18029資助金。美國政府享有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
[0005]發(fā)明背景
[0006]對嚙齒動物的研究表明，用抗原特異性T細(xì)胞對癌癥和感染進(jìn)行過繼性免疫治療是有效的，并且有證據(jù)表明該療法對人類有治療效果1A對于臨床應(yīng)用，需要分離具有所需抗原特異性的T細(xì)胞，或?qū)細(xì)胞進(jìn)行改造以表達(dá)靶向感染的或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的受體，然后在培養(yǎng)中擴(kuò)增這些細(xì)胞9_14。T細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)移前景誘人，因?yàn)槠涫沟媚軌驅(qū)μ禺愋院凸δ苓M(jìn)行控制，且便于進(jìn)行體內(nèi)持久性、毒性和功效的評估。此外，在同種異體的干細(xì)胞移植環(huán)境中，將源自供體的靶向病原體或惡性細(xì)胞的T細(xì)胞克隆施用于接受者，可避免因注入未經(jīng)選擇的供體T細(xì)胞而發(fā)生的移植物抗宿主病3，4，15。然而，臨床研究明顯顯示培養(yǎng)的T細(xì)胞，尤其是克隆的CD8+T細(xì)胞的功效，由于其無法在過繼轉(zhuǎn)移后持續(xù)存在而頻頻受限lfU7。
[0007]用于過繼性免疫治療的T細(xì)胞所源自的淋巴細(xì)胞庫(pool)包含初始的和長壽的、抗原刺激過的記憶T細(xì)胞(TM)。Tm可進(jìn)一步分為表型、歸巢性(homing properties)和功能不同的中心記憶(Tcm)和效應(yīng)記憶(Tem)細(xì)胞亞群18。⑶8+TCM在細(xì)胞表面表達(dá)⑶62L和CCR7，其促進(jìn)遷移至淋巴結(jié)，且如果再次暴露于抗原就會快速增殖。⑶8+TEM缺乏細(xì)胞表面⑶62L且優(yōu)選遷移至周圍組織，并表現(xiàn)出直接的效應(yīng)功能19。針對抗原刺激的應(yīng)答，⑶8+Tcm和Tem都分化為表達(dá)高水平顆粒酶和穿孔素的溶細(xì)胞效應(yīng)T細(xì)胞(Te)，但其為短壽細(xì)胞2°。因而，臨床免疫治療試驗(yàn)中T細(xì)胞存活力差可能僅源于其在體外培養(yǎng)中分化為注定要死亡的TE17，21，22。需要確定提高過繼轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞體內(nèi)存活力的細(xì)胞群和方法。
[0008]發(fā)明概沭
[0009]在一個方面中，本發(fā)明涉及，諸如通過過繼轉(zhuǎn)移腫瘤特異性、亞群特異性遺傳修飾的CD4+T細(xì)胞，賦予和/或增強(qiáng)細(xì)胞免疫治療介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法和組合物，其中所述CD4+T細(xì)胞賦予和/或增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞維持抗腫瘤反應(yīng)性的能力，且增加和/或最大化腫瘤特異性增殖。
[0010]在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以下方法:通過將提供細(xì)胞免疫應(yīng)答的遺傳修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑和遺傳修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑施用于個體，在患有疾病或病癥的所述個體中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法，其中所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體具有對與所述疾病或病癥相關(guān)的抗原有特異性的胞外抗體可變域和T細(xì)胞或其它受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域，如共刺激域；以及所述遺傳修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑表現(xiàn)出明顯的Thl表型并產(chǎn)生其它細(xì)胞因子，引發(fā)直接腫瘤識別并增強(qiáng)所述遺傳修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，其中所述輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞,所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。可對上述方法進(jìn)行各種修改。例如，修飾所述CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的嵌合抗原受體可以相同或不同。在可選的實(shí)施方案中，可以用重組T細(xì)胞受體(TCR)修飾所述T細(xì)胞。TCR可以對任何抗原、病原體或腫瘤具有特異性。在黑素瘤(例如，MART1、gplOO)、白血病(例如，WT1、次要組織相容性抗原)、乳腺癌(例如，her2、NY-BRl)中存在針對許多腫瘤抗原的TCR。
[0011]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其具有引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的遺傳修飾的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑，以及遺傳修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑，其中所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體具有對疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外可變域抗體以及T細(xì)胞或其它受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域，如共刺激域；所述遺傳修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑誘導(dǎo)明顯的Thl表型并產(chǎn)生其它細(xì)胞因子，引發(fā)直接的腫瘤識別并增強(qiáng)遺傳修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，其中所述輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體具有對與所述疾病或病癥相關(guān)的抗原有特異性的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0012]在又一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其具有引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的嵌合抗原受體修 飾的腫瘤特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑，其中所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對與所述疾病或病癥相關(guān)的抗原具有特異性的胞外單鏈抗體和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域；和抗原反應(yīng)性嵌合抗原受體修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞，其源自CD45R0陰性、CD62L陽性⑶4陽性T細(xì)胞；以及藥學(xué)上可接受的載體。
[0013]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其具有包含源自患者的CD8+T細(xì)胞的引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑以及抗原反應(yīng)性嵌合抗原受體修飾的CD4+T輔助細(xì)胞，所述CD4+T輔助細(xì)胞引發(fā)Thl細(xì)胞因子應(yīng)答并增強(qiáng)對病原體的CD8+免疫應(yīng)答，其中所述輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體具有對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0014]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其包含抗原反應(yīng)性嵌合抗原受體修飾的CD4+T輔助細(xì)胞，所述CD4+T輔助細(xì)胞引發(fā)直接的腫瘤識別并增強(qiáng)對病原體的CD8+免疫應(yīng)答，其中所述輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對疾病或病癥相關(guān)抗原特異性胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。[0015]在另一個方面中，本發(fā)明提供了制備過繼性免疫治療組合物的方法，通過獲得引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的嵌合抗原受體修飾的腫瘤特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑和抗原反應(yīng)嵌合抗原受體，以及獲得引發(fā)Thl細(xì)胞因子應(yīng)答的修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞，其中所述修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體具有對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊(module);其中所述修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+細(xì)胞，所述嵌合抗原受體具有對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0016]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備過繼性細(xì)胞免疫治療組合物的方法，包括獲得引發(fā)Thl細(xì)胞因子應(yīng)答的修飾的初始CD4+輔助性T細(xì)胞，其中所述修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞,所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域；以及將所述修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞與具有嵌合抗原受體的抗原特異性中心記憶CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑組合，所述嵌合抗原受體具有對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域以及T細(xì)胞或其它受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0017]在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在患有疾病或病癥的個體中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法，包括將遺傳修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑施用于所述個體，其中所述修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊。
[0018]在隨附的說明書、說明書附圖和權(quán)利要求書中將進(jìn)一步描述本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1顯示了在用編碼慢病毒的RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的CAR中嵌合抗原受體(CAR)表達(dá)的表型和分析，未轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶8+T細(xì)胞系作為對照。所述RORl-CAR盒包含作為轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)記的截短型EGFR，并可以通過用抗-EGFR單克隆抗體染色來檢測。截短型Fc-RORl融合蛋白直接結(jié)合至RORl-CAR的抗原結(jié)合域，并選擇性地染色轉(zhuǎn)導(dǎo)的RORl-CAR而不染色未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照T細(xì)胞系。RORl-CAR在⑶8+T細(xì)胞的細(xì)胞表面上的表達(dá)通過結(jié)合至RORl-Fc融合蛋白來直接測量，以及通過在載體中的2A序列下游編碼的截短型EGFR的表達(dá)來間接測量。
[0020]圖2顯示了在51Cr釋放試驗(yàn)中，表達(dá)RORl-特異性嵌合抗原受體的⑶8+T細(xì)胞針對一組人RORl-陽性腫瘤細(xì)胞系(K562)、原代腫瘤細(xì)胞(B-CLL)和自體正常B-細(xì)胞的溶細(xì)胞活性。與RORl在惡性而非成熟的正常B細(xì)胞均一表達(dá)一致的是，遺傳修飾的⑶8+R0R1-CART細(xì)胞僅溶解RORl+腫瘤細(xì)胞而不溶解成熟的正常B細(xì)胞。⑶8+R0R1-CAR T細(xì)胞表現(xiàn)出針對包括原代CLL在內(nèi)的RORl-陽性腫瘤細(xì)胞的特異性溶細(xì)胞活性，但不針對正常的B細(xì)胞。
[0021]圖3顯示了 RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+T細(xì)胞系的表型和CAR表達(dá)，未轉(zhuǎn)染的⑶4+T細(xì)胞系作為對照。RORl-CAR在⑶4+T細(xì)胞的細(xì)胞表面上的表達(dá)是通過特異性結(jié)合至RORl-Fc融合蛋白來測量的。截短型FcRORl融合蛋白而非單獨(dú)的Fe蛋白直接結(jié)合至R0R1-CAR，并選擇性地染色RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的而不是未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照⑶4+T細(xì)胞系，證實(shí)了 RORl-CAR在細(xì)胞表面上的表達(dá)和結(jié)合至RORl-蛋白。RORl-CAR在⑶4+T細(xì)胞的細(xì)胞表面上的表達(dá)，通過特異性結(jié)合至RORl-Fc融合蛋白而不結(jié)合至對照Fe融合蛋白來測量。
[0022]圖4(即圖4A-4B —起)顯示了在51Cr釋放試驗(yàn)中，CD4+R0R1-CART細(xì)胞針對的弱但具有特異性的溶細(xì)胞活性，其針對一組RORl-陽性腫瘤細(xì)胞包括原代CLL、套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Jeko-1、用RORl (K562/R0R1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞，而非初始RORl-陰性K562細(xì)胞。⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞針對RORl-陽性腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出弱的但具有特異性的溶細(xì)胞活性。
[0023]圖5(即圖5A-5B—起)顯示了來自IFNyELISA(圖5A)和多重細(xì)胞因子檢測(圖5B)的結(jié)果。⑶4+和⑶8+R0R1-CAR T細(xì)胞系的細(xì)胞因子分泌。將⑶4+R0R1-CAR和CD8R0R1-CAR T細(xì)胞與RORl+腫瘤細(xì)胞共孵育，通過ELISA (5A)測量干擾素Y (IFNg)的水平，通過 Luminex 測定(5B)來測量 IFNg、TNFa、IL-2、IL-4、IL-10 和 IL-17。CD4+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞特異性地識別RORl-陽性腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系，并比⑶8+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞產(chǎn)生更大量的Thl細(xì)胞因子包括IFN-Y、TNF-a，尤其是IL-2。這些數(shù)據(jù)表明，通過RORl-CAR刺激后，⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞除了介導(dǎo)直接抗腫瘤反應(yīng)外還表現(xiàn)出輔助性效應(yīng)功能，也可用于增強(qiáng)⑶8+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。
[0024]圖6描述了增殖研究的結(jié)果，表明在用RORl-陽性腫瘤細(xì)胞系和原代腫瘤細(xì)胞刺激后，⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞被誘導(dǎo)進(jìn)行增殖(CFSE測定)，并且增殖細(xì)胞的百分比和增殖的亞群細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂的次數(shù)都比⑶8+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞明顯更高。用RORl-陽性腫瘤細(xì)胞(K562/R0R1、原代CLL和Jeko MCL)刺激后，CD4+R0R1-CAR T細(xì)胞的增殖比CD8+R0R1-CAR CTL 更旺盛。
[0025]圖7:，多克隆未選擇的CD4+R0R1CAR T細(xì)胞通過促進(jìn)CD8+R0R1-CAR CTL對腫瘤應(yīng)答進(jìn)行的增殖而對其有所幫助。⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞(源自大型(bulk)⑶4+T細(xì)胞)明顯提高了多克隆未選擇的CD8+ R0R1-CAR CTL的增殖(在單獨(dú)培養(yǎng)中為18% —與CD4+CAR T細(xì)胞共培養(yǎng)后為31.5%)。
[0026]圖8 (即圖8A-8D —起)顯示了由流式分選純化的⑶4+初始、中心記憶性和效應(yīng)記憶性亞群產(chǎn)生CD4+CAR T細(xì)胞系和T細(xì)胞功能分析。細(xì)胞因子譜和增殖能力表明，源自初始⑶4+T細(xì)胞的⑶4+R0R1-CART細(xì)胞可能最適合于為⑶8+CTL提供幫助。比較表達(dá)⑶19-特異性CAR的⑶4+CAR T-細(xì)胞系功能的實(shí)驗(yàn)中得到了類似的數(shù)據(jù)。圖8A顯示了基于⑶45RA、⑶45R0、⑶62L表達(dá)的初始、中心和效應(yīng)記憶性⑶4+T細(xì)胞的流式分選純化。圖8B顯示了將分選純化的初始、中心和效應(yīng)記憶⑶4+T細(xì)胞(CFSE測定)用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)衍生的RORl-CART細(xì)胞系的增殖分析。圖8C顯示了來自分選純化的初始、中心和效應(yīng)記憶性CD4+T細(xì)胞(Luminex測定)的RORl-CAR T細(xì)胞系的細(xì)胞因子分泌分析。圖8D顯示了來自分選純化的初始、中心和效應(yīng)記憶性⑶4+T細(xì)胞(Luminex測定)的⑶19-CAR T-細(xì)胞系的細(xì)胞因子分泌分析。通過多重細(xì)胞因子分析(圖8B)獲得的細(xì)胞因子譜和通過CFSE染色(圖SC)測得的增殖能力表明，源自初始亞群的CD4+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞產(chǎn)生的Thl細(xì)胞因子水平最高，且用RORl-陽性腫瘤細(xì)胞刺激后的增殖最旺盛，這提示它們可能最適合用于增強(qiáng)⑶8+R0R1-CAR CTL0來自分選純化的初始、中心和效應(yīng)記憶性⑶4+T細(xì)胞(Luminex測定)的⑶19-CAR T細(xì)胞系的細(xì)胞因子分泌分析表明，⑶4T細(xì)胞亞群的活性可推廣至許多CAR。
[0027]圖9顯示了⑶8+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞與⑶4+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞(而非未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照⑶4+T細(xì)胞)共培養(yǎng)。將⑶8+R0R1-CARCTL與來自初始、中心和效應(yīng)記憶性亞群細(xì)胞的⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞系共培養(yǎng)來確定⑶8+和⑶4+T細(xì)胞的最佳組合，以使得⑶8+R0R1-CAR CTL的增殖最大化。⑶4初始RORl-CAR T細(xì)胞提供了⑶8中心記憶性RORl-CAR CTL的最強(qiáng)增殖。共培養(yǎng)使得CD8+亞群的腫瘤特異性增殖增加，與源自初始⑶4+T細(xì)胞的⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞共培養(yǎng)后，觀察到⑶8+亞群的最大增殖，表明初始的
[0028]圖10顯示了，在用⑶19+套細(xì)胞淋巴瘤腫瘤系Jeko-1刺激的⑶8+⑶19-CAR CTL和⑶4+⑶19-CAR T-細(xì)胞系共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，源自初始亞群的⑶4+CAR T-細(xì)胞系在增強(qiáng)中心記憶性-衍生的⑶8+CAR CTL的腫瘤特異性增殖方面的優(yōu)異能力。在用⑶19+套細(xì)胞淋巴瘤腫瘤系Jeko-1刺激的⑶8+⑶19-CAR CTL和⑶4+⑶19-CAR T-細(xì)胞系共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)了源自初始亞群的⑶4+CAR T-細(xì)胞系在增強(qiáng)中心記憶性-衍生的⑶8+CAR CTL的腫瘤特異性增殖方面的優(yōu)異能力。
[0029]圖11顯示了，⑶8+CAR T細(xì)胞和⑶4+CAR T細(xì)胞獨(dú)立地在免疫缺陷型小鼠(N0D/SCID-Raji)的淋巴瘤模型中賦予了直接的抗腫瘤功效。通過尾靜脈注射給幾組小鼠(n=3)接種表達(dá)螢火蟲熒光素酶的Raji腫瘤細(xì)胞并用單劑量的10xl0~6個T細(xì)胞處理。小鼠接受⑶19-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的或?qū)φ漳M轉(zhuǎn)導(dǎo)的(mock-transduced)⑶8+中心記憶-衍生的(A),或者⑶19-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的或?qū)φ漳M轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+初始-衍生的T細(xì)胞(B)。使用連續(xù)生物發(fā)光成像進(jìn)行腫瘤負(fù)荷和分布的分析。
[0030]圖12顯示了，在全身性套細(xì)胞淋巴瘤(NSG/Jeko-1-ffLuc)的小鼠腫瘤模型中，⑶4+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞對⑶8+R0R1-CAR CTL的抗腫瘤功效的增強(qiáng)和協(xié)同作用。在全身侵襲性套細(xì)胞淋巴瘤(NSG/Jeko-1)的小鼠腫瘤模型中，RORl-CAR修飾的CD8+和CD4+T細(xì)胞的抗腫瘤功效。在過繼轉(zhuǎn)移CD8+R0R1-CAR CTL、CD4+R0R1-CAR T細(xì)胞或CD8+和⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞組合的T細(xì)胞以后，使用生物發(fā)光成像進(jìn)行腫瘤負(fù)荷分析。所有小鼠均接受相同總劑量的CAR T細(xì)胞。
[0031]圖13顯示了，在全身性淋巴瘤(NSG/Raji)的小鼠模型中，CD8+和CD4+CD19-CART細(xì)胞的協(xié)同作用。用螢火蟲熒光素酶轉(zhuǎn)導(dǎo)的Raji腫瘤細(xì)胞接種NSG小鼠。在腫瘤接種后(處理前)第6天通過生物發(fā)光成像證實(shí)了 Raji腫瘤的移植(處理方案如圖A中所示，通過生物發(fā)光的腫瘤如圖B所示)。然后將幾組小鼠(n=5)用⑶8+⑶19-CAR修飾的T細(xì)胞或包含⑶8+和⑶4+⑶19-CAR T細(xì)胞的組合T-細(xì)胞產(chǎn)物進(jìn)行處理。所有小鼠均接受相同總劑量的T細(xì)胞(10xl(T6)。在用⑶8+⑶19-CAR T細(xì)胞處理的同批次小鼠，以及在組合的⑶8+和⑶4+⑶19-CAR T-細(xì)胞產(chǎn)物(處理后中間的黑色和灰色條)圖B)處理的小鼠中，使用生物發(fā)光成像分析腫瘤負(fù)荷顯示，完全根除了所述Raji腫瘤。然后將所述小鼠第二次接種Raji腫瘤細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)(challenge)，并分析外周血中的CD4+和CD8+CAR T細(xì)胞頻數(shù)和腫瘤移植。在用組合的CD8+和CD4+CAR T-細(xì)胞產(chǎn)物處理的小鼠中，腫瘤激發(fā)后有明顯較高水平的⑶8+CAR T細(xì)胞(圖C的下部圖面)，且完全排斥該Raji接種(腫瘤激發(fā)后，右邊的灰色條，圖B)。相反，在僅接受⑶8+⑶19-CAR CTL的小鼠中，我們未檢測到腫瘤激發(fā)后的CAR T細(xì)胞增加(圖C)，該Raji腫瘤細(xì)胞能夠進(jìn)行移植(腫瘤激發(fā)后，右邊黑色條，圖面B)。
[0032]優(yōu)選實(shí)施方案詳述
[0033]如本文所用，“T細(xì)胞”或“T淋巴細(xì)胞”可源自任何哺乳動物，優(yōu)選靈長類物種，包括猴子、狗和人。在一些實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞與接受者個體為同種異體的(來自相同物種的不同供體)；在一些實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞為自體同源的(供體和接受者相同)；在一些實(shí)施方案中，所述T細(xì)胞為同基因的(供體和接受者不同，但為同卵雙胞胎)。
[0034]如本文所用，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)是指在其表面上表達(dá)⑶8的T淋巴細(xì)胞(即，CD8+T細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，這類細(xì)胞優(yōu)選為抗原刺激過的“記憶”性T細(xì)胞(Tm細(xì)胞)。
[0035]如本文所用，“中心記憶性”T細(xì)胞(或是指在其表面上表達(dá)⑶62L和⑶45R0的抗原刺激過的CTL，并且與初始細(xì)胞相比，其不表達(dá)⑶45RA或⑶45RA的表達(dá)降低。在實(shí)施方案中，中心記憶性細(xì)胞對于表達(dá)⑶62L、CCR7、⑶28、⑶127、⑶45R0和⑶95為陽性，并且與初始細(xì)胞相比，具有降低的⑶54RA表達(dá)。
[0036]如本文所用，“效應(yīng)記憶性”T細(xì)胞(或“TEM”)是指抗原刺激過的CTL，相比中心記憶性細(xì)胞，在其表面上不表達(dá)CD62L或具有降低的CD62L表達(dá)，并且，相比初始細(xì)胞，其不表達(dá)⑶45RA或具有降低的⑶45RA表達(dá)。在實(shí)施方案中，相比初始細(xì)胞或中心記憶性細(xì)胞，效應(yīng)記憶性細(xì)胞對于表達(dá)⑶62L、CCR7、⑶28、⑶45RA為陰性的，而對于表達(dá)⑶127為陽性的。
[0037]如本文所用，“初始”T細(xì)胞是指表達(dá)CD62L和⑶45RA的未經(jīng)抗原刺激過的T淋巴細(xì)胞，相比中心記憶性細(xì)胞，其不表達(dá)⑶45R0或具有降低的⑶45R0表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，初始⑶8+T淋巴細(xì)胞的特征在于，表達(dá)初始T細(xì)胞表型標(biāo)志物包括⑶62L、CCR7、⑶28、CD3、CD127 和 CD45RA。
[0038]如本文所用，“效應(yīng)” “TE” T細(xì)胞是指抗原刺激過的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，相比中心記憶細(xì)胞，其不表達(dá)⑶62L、CCR7、⑶28或⑶62L、CCR7、⑶28的表達(dá)降低，且對于顆粒酶B和穿孔素為陽性。
[0039]如本文所用，在混合物中描述細(xì)胞類型數(shù)量的“富集的”和“消減的”是指使所述細(xì)胞混合物經(jīng)歷導(dǎo)致所述“富集 的”類型數(shù)量增加以及所述“消減的”細(xì)胞數(shù)量減少的過程或步驟。因此，取決于經(jīng)歷富集過程的原始細(xì)胞群來源，混合物或組合物可以包含60%、70%、80%、90%、95%或99%或更多(數(shù)量或計數(shù))的“富集的”細(xì)胞以及40%、30%、20%、10%,5%或1%或更少(數(shù)量或計數(shù))的“消減的”細(xì)胞。
[0040]白介素-15為已知的并描述于例如，美國專利N0.6，344，192。
[0041]如本文所用，“CAR”是指嵌合抗原受體，其包含對疾病或病癥相關(guān)抗原特異的抗體的胞外可變域和T細(xì)胞或其它受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域如共刺激域。
【具體實(shí)施方式】
[0042]在體外培養(yǎng)的CD4+T淋巴細(xì)胞明顯增加了腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞在體外和體內(nèi)的增殖、持久性和抗腫瘤反應(yīng)性。在一些實(shí)施方案中，相比來自中心和效應(yīng)記憶或大型CD4+T細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞，初始CD4+T細(xì)胞具有使得其有優(yōu)異的輔助活性的內(nèi)在程序(intrinsicprogramming)。
[0043]在實(shí)施方案中，將腫瘤-反應(yīng)性⑶4+T細(xì)胞用對酪氨酸激酶孤兒受體RORl或⑶19分子具有特異性的單鏈抗體衍生的嵌合抗原受體(CAR)進(jìn)行修飾。RORl在慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)和套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)上均一地表達(dá)，并且，當(dāng)在⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)中表達(dá)時，來自抗-RORl單克隆抗體(mAb)的RORl-特異性CAR賦予其特異性識別惡性的而非正常的成熟B細(xì)胞。來自大型的CD4+T細(xì)胞以及流式分選純化的初始、中心和效應(yīng)記憶性⑶4+T細(xì)胞的RORl-CAR T細(xì)胞從健康的供體和CLL患者的外周血獲得。⑶4+CAR T細(xì)胞對RORl+腫瘤包括用RORl轉(zhuǎn)染的原代CLL、MCL系Jeko-1和Κ562細(xì)胞具有特異性但較弱的溶細(xì)胞活性。多重細(xì)胞因子分析檢測到高水平的Thl細(xì)胞因子產(chǎn)生，以及相比⑶8+CAR CTL明顯更高水平的IFN Y、TNFa，尤其是IL-2。CFSE染色顯示，相比CD8+CAR CTL，用RORl-陽性腫瘤細(xì)胞刺激后有顯著增加的增殖，且誘導(dǎo)后增殖的細(xì)胞百分比和增殖細(xì)胞亞群進(jìn)行的細(xì)胞分裂次數(shù)明顯更高。獲自健康供體和CLL患者的⑶4+T細(xì)胞，在用RORl-特異性CAR進(jìn)行遺傳修飾后，獲得了抗腫瘤反應(yīng)性。而且，在無外源細(xì)胞因子情況下增殖并產(chǎn)生高水平Thl細(xì)胞因子的能力表明，通過CAR刺激后⑶4+CAR T細(xì)胞表現(xiàn)出典型的輔助功能，這意味著其除了賦予直接抗腫瘤效應(yīng)，還可用于增強(qiáng)腫瘤特異性的CD8+CTL。
[0044]獲得了源自流式分選純化的⑶4+初始、中心和效應(yīng)記憶性細(xì)胞亞群的RORl-CART細(xì)胞的細(xì)胞因子譜和增殖能力。源自初始⑶45RA+⑶45R0-⑶62L+亞群的⑶4+CAR T細(xì)胞產(chǎn)生了最高水平的Thl細(xì)胞因子尤其是IL-2，并響應(yīng)RORl+腫瘤細(xì)胞而增殖。確實(shí)，在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，加入CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+T細(xì)胞而不是未轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+T細(xì)胞導(dǎo)致⑶8+CAR CTL的腫瘤特異性增殖明顯增加。在一些實(shí)施方案中，源自初始的而非中心和效應(yīng)記憶性細(xì)胞亞群或大型⑶4+T細(xì)胞的CAR-修飾的⑶4+T細(xì)胞導(dǎo)致⑶8+CAR CTL的增殖提高。
[0045]CD8+中心記憶性T細(xì)胞具有允許它們在施用后能長時間存留的內(nèi)在程序，這使得它們成為用于免疫治療的CD8+T細(xì)胞的優(yōu)選細(xì)胞亞群。在實(shí)施方案中，來自分選純化的⑶8+中心記憶T細(xì)胞和⑶4+初始CAR-修飾的T細(xì)胞的RORl-CAR或⑶19CAR修飾的CTL提高了 CD8+T細(xì)胞亞群的增殖。在實(shí)施方案中，腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞表現(xiàn)出抗腫瘤反應(yīng)性，并在體外和體內(nèi)對CD8+T細(xì)胞有所幫助。在一個具體的實(shí)施方案中，使用了來自初始亞群的腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞。
[0046]在另一個實(shí)施方案中，所述⑶8+和⑶4+T細(xì)胞可用T細(xì)胞受體(TCR)來修飾。所述TCR可以對任何抗原、病原體或腫瘤具有特異性(存在針對黑素瘤(例如，MART1、gplOO)、白血病(例如，WT1、次要組織相容性抗原)、乳腺癌(例如，her2、NY-BRl)中許多腫瘤抗原的 TCR。`
[0047]詳細(xì)描述
[0048]鉬合物
[0049]本公開本文提供包含遺傳修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，所述制劑增強(qiáng)了遺傳修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，其中所述輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體或其它受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0050]在一些實(shí)施方案中，過繼性細(xì)胞免疫治療組合物還包含引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的嵌合抗原受體修飾的腫瘤特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑，其中所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外單鏈抗體和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0051]在一些實(shí)施方案中，過繼性細(xì)胞免疫治療組合物包含引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的嵌合抗原受體修飾的腫瘤特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑，其中所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外單鏈抗體和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域；上述制劑與源自CD45R0陰性、CD62L陽性CD4陽性T細(xì)胞的抗原反應(yīng)性嵌合抗原受體修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體組合。
[0052]在其它實(shí)施方案中，過繼性細(xì)胞免疫治療組合物包含引發(fā)來自患者的細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑，并與增強(qiáng)CD8+免疫應(yīng)答的抗原反應(yīng)嵌合抗原受體修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞組合，其中所述輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0053]在又一個實(shí)施方案中，過繼性細(xì)胞免疫治療組合物包含增強(qiáng)CD8+免疫應(yīng)答的抗原反應(yīng)性嵌合抗原受體修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞，其中所述輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0054]在實(shí)施方案中，所述⑶4+輔助性T淋巴細(xì)胞選自初始⑶4+T細(xì)胞、中心記憶性⑶4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性⑶4+T細(xì)胞或大型⑶4+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，⑶4+輔助性淋巴細(xì)胞為初始CD4+T細(xì)胞，其中所述初始CD4+T細(xì)胞包括CD45R0-、CD45RA+、CD62L+CD4+T細(xì)胞。在實(shí)施方案中，⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞選自初始⑶8+T細(xì)胞、中心記憶性⑶8+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性⑶8+T細(xì)胞或大型⑶8+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞為中心記憶性T細(xì)胞，其中所述中心記憶性T細(xì)胞包括⑶45R0+、⑶62L+、⑶8+T細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，所述CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞為中心記憶性T細(xì)胞，且所述CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞為初始⑶4+T細(xì)胞。
[0055]在可選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞可以用重組T細(xì)胞受體進(jìn)行修飾。TCR可以對任何抗原、病原體或腫瘤具有特異性。存在針對黑素瘤(例如，MARTUgplOO)、白血病(例如，WT1、次要組織相容性抗原)、乳腺癌 (例如，her2、NY-BRl)中許多腫瘤抗原的TCR。
[0056]T淋巴細(xì)朐群的詵擇和分詵
[0057]本文描述的組合物提供了抗原反應(yīng)性⑶4+和⑶8+T淋巴細(xì)胞。
[0058]T淋巴細(xì)胞可以根據(jù)已知技術(shù)來收集，并通過已知技術(shù)來富集或消減，如與抗體的親和結(jié)合，如流式細(xì)胞計數(shù)和/或免疫磁珠選擇。經(jīng)過富集和/或消減步驟以后，可以根據(jù)已知技術(shù)(包括但不限于描述于Riddell等人的美國專利N0.6，040，177中的內(nèi)容)或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的其變體，對期望的T淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增。
[0059]例如，期望的T細(xì)胞群或亞群可通過如下來擴(kuò)增:將初始T淋巴細(xì)胞群加入至體外培養(yǎng)基中，然后向該培養(yǎng)基中加入飼養(yǎng)細(xì)胞如非分裂的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，(例如，從而使得所得細(xì)胞群，對于待擴(kuò)增的初始細(xì)胞群中每個T淋巴細(xì)胞，含有至少約5、10、20或40或更多個PBMC飼養(yǎng)細(xì)胞)；并孵育該培養(yǎng)物(例如，足以擴(kuò)增T細(xì)胞的數(shù)量的時間)。所述非分裂的飼養(yǎng)細(xì)胞可以包括Y射線輻照的PBMC飼養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述PBMC用范圍約3000-3600拉德(rad)的、射線輻照。向培養(yǎng)基中添加T細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞的順序可以根據(jù)需要顛倒。所述培養(yǎng)物通常可在適合T淋巴細(xì)胞生長的溫度等條件下培養(yǎng)。對于人T淋巴細(xì)胞的生長，例如，溫度通常為至少約25°C，優(yōu)選至少約30°C，更優(yōu)選至少約37°C。
[0060]擴(kuò)增的T淋巴細(xì)胞包括對存在于人腫瘤或病原體上的抗原具有特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和輔助性T淋巴細(xì)胞。[0061]任選地，擴(kuò)增方法還可以包括加入非分裂的EBV-轉(zhuǎn)化的類淋巴母細(xì)胞(LCL)作為飼養(yǎng)細(xì)胞的步驟。LCL可用范圍約6000-10，000拉德的、射線輻照。所述LCL飼養(yǎng)細(xì)胞可以任何合適的量提供，如LCL飼養(yǎng)細(xì)胞與初始T淋巴細(xì)胞的比例為至少約10:1。
[0062]任選地，所述擴(kuò)增方法還可以包括將抗-⑶3單克隆抗體添加至培養(yǎng)基(例如，以至少約0.5ng/ml的濃度)中的步驟。任選地，所述擴(kuò)增方法還可以包括將IL-2和/或IL-15添加至所述培養(yǎng)基(例如，其中IL-2的濃度為至少約10單位/ml)中的步驟。
[0063]將T淋巴細(xì)胞分離后，擴(kuò)增前后的細(xì)胞毒性和輔助性T淋巴細(xì)胞均可分類為初始、記憶和效應(yīng)性T細(xì)胞亞群。
[0064]可使用標(biāo)準(zhǔn)的方法獲得⑶8+細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，通過確定與初始、中心記憶和效應(yīng)性CD8+細(xì)胞中每一種有關(guān)的細(xì)胞表面抗原，CD8+細(xì)胞進(jìn)一步分類為初始、中心記憶和效應(yīng)性細(xì)胞。在實(shí)施方案中，記憶性T細(xì)胞存在于⑶8+外周血淋巴細(xì)胞的⑶62L+和⑶62L-亞群中。用抗-⑶8和抗-⑶62L抗體染色后，PBMC被分類為⑶62L-⑶8+和⑶62L+⑶8+部分。在一些實(shí)施方案中，中心記憶性TCM的表型標(biāo)志物的表達(dá)包括⑶45R0、⑶62L、CCR7、⑶28、⑶3和⑶127，且對于顆粒酶B為陰性的。在一些實(shí)施方案中，中心記憶性T細(xì)胞為CD45R0+、CD62L+、CD8+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)Te對于CD62L、CCR7、⑶28和⑶127為陰性的，對于顆粒酶B和穿孔素為陽性的。在一些實(shí)施方案中，初始⑶8+T淋巴細(xì)胞的特征在于表達(dá)初始T細(xì)胞的表型標(biāo)志物，包括⑶62L、CCR7、⑶28、⑶3、⑶127和CD45RA。
[0065]細(xì)胞或細(xì)胞群對于特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物是否為陽性的，可以利用針對表面標(biāo)志物的特異性抗體和同型匹配的對照抗體染色，通過流式細(xì)胞計數(shù)來確定。標(biāo)志物陰性的細(xì)胞群是指細(xì)胞群沒有高于同型對照的用特異性抗體明顯的染色，陽性是指細(xì)胞群高于同型對照的均一染色。在一些實(shí)施方案中，一個或多個標(biāo)志物表達(dá)的降低是指與參照細(xì)胞群相比，平均熒光強(qiáng)度減少IloglO和/或顯示該標(biāo)志物的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)降低所述細(xì)胞的至少 20%、25%、30%、35%、40%、45`%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 和 100%,以及20-100%之間的任何百分?jǐn)?shù)。在一些實(shí)施方案中，一個或多個標(biāo)志物為陽性的細(xì)胞群是指相比參照的細(xì)胞群，顯示該標(biāo)志物的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為所述細(xì)胞的至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%，以及50-100%之間的任何百分?jǐn)?shù)。
[0066]通過確定具有細(xì)胞表面抗原的細(xì)胞群，CD4+T輔助細(xì)胞被分類為初始、中心記憶和效應(yīng)性細(xì)胞。可通過標(biāo)準(zhǔn)方法獲得⑶4+淋巴細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，初始⑶4+T淋巴細(xì)胞為CD45R0-、CD45RA+、CD62L+CD4+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，中心記憶性CD4+細(xì)胞為⑶62L陽性和⑶45R0陽性。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)性⑶4+細(xì)胞為⑶62L和⑶45R0陰性。
[0067]抗原特異性的⑶4+和⑶8+細(xì)胞群可以通過用抗原刺激初始或抗原特異性T淋巴細(xì)胞來獲得。例如，通過從感染的個體中分離T細(xì)胞并在體外用同樣的抗原刺激所述細(xì)胞，可以針對巨細(xì)胞病毒抗原生成抗原特異性T細(xì)胞克隆。也可以使用初始T細(xì)胞?？梢允褂脕碜阅[瘤細(xì)胞、癌癥細(xì)胞或感染原的任何數(shù)目的抗原。這類抗原的實(shí)例包括Hiv抗原、HCV抗原、HBV抗原、CMV抗原、寄生蟲抗原和腫瘤抗原如酪氨酸激酶孤兒受體R0R1、tEGFR、Her2、Ll-CAM、⑶19、⑶20、⑶22、間皮素和CEA。在一些實(shí)施方案中，過繼性細(xì)胞免疫治療組合物可用于治療包括實(shí)體瘤、惡性血液病、黑素瘤或病毒感染的疾病或病癥。
[0068]T淋巴細(xì)胞群的修飾[0069]按照本發(fā)明，在一些實(shí)施方案中，將功能基因引入要用于免疫治療的T細(xì)胞中是期望的。例如，引入的一個或多個基因可以通過提高轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞的活力和/或功能來改善治療的功效；或它們可提供遺傳標(biāo)志物來允許選擇和/或評估體內(nèi)存活或遷移；或它們可整合改善免疫治療安全性的功能，例如，通過使細(xì)胞易于進(jìn)行體內(nèi)陰性選擇，其被Lupton S.D.等人，Mol.and Cell Biol., 11:6 (1991);以及 Riddell 等人，Human GeneTherapy3:319-338 (1992)描述；還參見 Lupton 等人的專利公開 PCT/US91/08442 和 PCT/US94/05601，描述了使用源自融合顯性陽性選擇標(biāo)志物和陰性選擇標(biāo)志物的雙功能選擇融合基因。這可以基于本發(fā)明公開根據(jù)已知技術(shù)(參見例如，Riddell等人擁有的美國專利N0.6，040, 177，14-17欄)或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的其變體來實(shí)施。
[0070]在實(shí)施方案中，用嵌合抗原受體(CAR)修飾T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，CAR包含單鏈抗體片段(scFv)，其源自單克隆抗體(mAb)的可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VL)，所述單克隆抗體連接至介導(dǎo)T-細(xì)胞活化和細(xì)胞毒性的TCR⑶3+鏈。將⑶28或4-1BB的共刺激域與CD3+鏈融合也可以通過CAR提供共刺激信號。CAR對于獨(dú)立于HLA的細(xì)胞表面分子具有特異性，從而克服了 TCR-識別的局限性，包括HLA-限制和腫瘤細(xì)胞上的低水平的HLA-表達(dá)。
[0071]通過利用例如抗體分子的抗原結(jié)合片段或抗體可變域，可以構(gòu)建具有針對任一細(xì)胞表面標(biāo)志物的特異性的CAR?？乖Y(jié)合分子可以連接至一個或多個細(xì)胞信號傳導(dǎo)模塊。在實(shí)施方案中，細(xì)胞信號傳導(dǎo)模塊包括CD3跨膜域、CD3胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域和CD28跨膜域。在實(shí)施方案中，所述胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域包括連接至⑶3胞內(nèi)域的⑶28跨膜和信號傳導(dǎo)域。在一些實(shí)施方案中，CAR還可以包括轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)志物如tEGFR。
[0072]在實(shí)施方案中，⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域和⑶4+輔助性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域相同。在其它實(shí)施方案中，CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域和CD4+輔助性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域不同。
[0073]在一些實(shí)施方案中， ⑶8+T細(xì)胞和⑶4+T細(xì)胞都用特異性結(jié)合至病原體特異性細(xì)胞表面抗原的抗體重鏈域進(jìn)行了遺傳修飾。在實(shí)施方案中，CAR對與病原體、腫瘤或癌癥細(xì)胞有關(guān)的細(xì)胞表面表達(dá)的抗原具有特異性。在一些實(shí)施方案中，CAR對HIV抗原、HCV抗原、HBV抗原、CMV抗原、寄生蟲抗原和腫瘤抗原如酪氨酸激酶孤兒受體R0R1、tEGFR、Her2、L1-CAM、⑶19、⑶20、⑶22、間皮素和CEA有特異性。本文描述了制備CAR的方法，也可參見 Forman 的 US6, 410，319，Jensen 等人的 W02002/077029.7, 446，191、W02010/065818、W02010/025177、W02007/059298 和 7，514，537，以 R Berger C?等人于 J.ClinicalInvestigation, 118:1294-308(2008)中的描述，它們均以引用的方式全部并入本文中。
[0074]在實(shí)施方案中，可將相同或不同的CAR引入至每個⑶4+和⑶8+T淋巴細(xì)胞中。在實(shí)施方案中，在這些細(xì)胞群的每個中的CAR具有特異地結(jié)合至相同抗原的抗原結(jié)合分子。所述細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊可以不同。在實(shí)施方案中，CD4或CD8T淋巴細(xì)胞的每個在轉(zhuǎn)導(dǎo)前均可分類為初始、中心記憶性、效應(yīng)記憶性或效應(yīng)細(xì)胞。在可選的實(shí)施方案中，所述CD4或CD8T淋巴細(xì)胞的每個在轉(zhuǎn)導(dǎo)前均可分類為初始、中心記憶性、效應(yīng)記憶性或效應(yīng)細(xì)胞。
[0075]在可選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞可用重組T細(xì)胞受體進(jìn)行修飾。TCR可能對任何抗原、病原體或腫瘤具有特異性。存在針對在黑素瘤(例如，MART1、gplOO)、白血病(例如，WT1、次要組織相容性抗原)、乳腺癌(例如，her2、NY-BRl)中的許多腫瘤抗原的TCR。[0076]已經(jīng)開發(fā)出利用重組的感染病毒粒子進(jìn)行基因遞送的各種感染技術(shù)。這代表了本發(fā)明T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的當(dāng)前優(yōu)選方法。已經(jīng)以這種方式使用的病毒載體包括源自猿猴病毒40、腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、慢病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒的病毒載體。因此，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)方法眾多但本質(zhì)上的功能是在哺乳動物細(xì)胞中引入和表達(dá)遺傳物質(zhì)。一些上述技術(shù)已經(jīng)用于轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞或淋巴細(xì)胞，包括磷酸鈣法轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔以及用重組腺病毒、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感染。已經(jīng)成功地通過電穿孔和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染轉(zhuǎn)導(dǎo)了原代T淋巴細(xì)胞。
[0077]逆轉(zhuǎn)錄病毒載體提供了將基因轉(zhuǎn)移至真核細(xì)胞的高效方法。而且，逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合以受控方式發(fā)生，使得每個細(xì)胞穩(wěn)定地整合一個或多個拷貝的新遺傳信息。
[0078]預(yù)期到刺激因子(例如，淋巴因子或細(xì)胞因子)的過表達(dá)可能對所處理的個體有毒性。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括使得本發(fā)明的T細(xì)胞易于在體內(nèi)進(jìn)行陰性選擇的基因片段。所用“陰性選擇”是指作為在個體的體內(nèi)條件下的變化結(jié)果，融合細(xì)胞可以被去除。所述陰性選擇表型可能是由于插入賦予對所施用制劑例如化合物的敏感性的基因的結(jié)果。在本領(lǐng)域中已知陰性選擇基因，除其它以外包括下述基因:賦予對更昔洛韋敏感性的單純皰疹病毒I型胸苷激酶(HSV-1 TK)基因(Wigler et al.，Cellll: 223，1977)，細(xì)胞次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)基因，細(xì)胞腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)基因、細(xì)菌胞苷脫氨酶(Mullen et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.89:33 (1992)) ?
[0079]在一些實(shí)施方案中，在T細(xì)胞中包含使得能夠在體外挑選出陰性選擇表型細(xì)胞的陽性標(biāo)志物是有用的。所述陽性選擇標(biāo)志物可以是基因，當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時，其表達(dá)出允許對攜帶所述基因的細(xì)胞進(jìn)行陽性選擇的顯性表型。這種基因在本領(lǐng)域是已知的，除其它以外包括，賦予對潮霉素-B抗性的潮霉素-B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(hph)、來自編碼對抗生素G418抗性的Tn5的氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neo或aph)、二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、腺苷脫氨酶基因(ADA)和多重耐藥(MDR)基因。
[0080]優(yōu)選地，將陽性選擇標(biāo)志`物和陰性選擇元件(element)相連接，從而使得失去陰性選擇元件也必然伴隨著失去陽性選擇標(biāo)志物。甚至更優(yōu)選地，所述陽性和陰性選擇標(biāo)記是融合的從而失去一個必然導(dǎo)致失去另一個。產(chǎn)生賦予所期望的上述陽性和陰性選擇兩種特征的表達(dá)產(chǎn)物多肽的融合多核苷酸實(shí)例為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。該基因的表達(dá)產(chǎn)生了賦予用于體內(nèi)陽性選擇的潮霉素B抗性和用于體內(nèi)陰性選擇的更昔洛韋敏感性的多肽。參見 Lupton S.D.等人，Mol.and Cell.Biologyll: 3374-3378，1991。此外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼嵌合受體的本發(fā)明多核苷酸在含有融合基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，尤其是賦予用于體內(nèi)陽性選擇的潮霉素B抗性和用于體內(nèi)陰性選擇的更昔洛韋敏感性的那些，例如HyTK逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,其描述于Lupton, S.D.等人(1991),同上。也可參見S.D.Lupton的專利公開PCT/US91/08442和PCT/US94/05601，描述了使用源自融合顯性陽性選擇標(biāo)志物和陰性選擇標(biāo)志物的雙功能選擇融合基因。
[0081]優(yōu)選的陽性選擇標(biāo)志物源自選自下組的基因:hph、nc0和gpt，優(yōu)選的陰性選擇標(biāo)志物源自選自下組的基因:胞嘧啶脫氨酶、HSV-1 TK、VZVTK、HPRT，APRT和gpt。尤其優(yōu)選的標(biāo)志物為雙功能選擇融合基因，其中所述陽性選擇標(biāo)志物源自hph或neo，所述陰性選擇標(biāo)志物源自胞嘧啶脫氨酶或TK基因或選擇標(biāo)志物。
[0082]可使用本領(lǐng)域熟知的各種方法轉(zhuǎn)導(dǎo)T淋巴細(xì)胞。例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)可按如下進(jìn)行:使用如本文所描述的REM刺激后第I天，給細(xì)胞提供20-30單位/ml的IL-2 ;第3天，用按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液替換二分之一的培養(yǎng)基，然后向培養(yǎng)基中補(bǔ)充5ug/ml聚凝胺和20-30單位/ml IL-2 ;第4天，洗滌所述細(xì)胞并將其放入補(bǔ)充有20-30單位/ml IL-2的新鮮培養(yǎng)基中；第5天，重復(fù)暴露于逆轉(zhuǎn)錄病毒中；第6天，將所述細(xì)胞放入補(bǔ)充有30單位/ml IL-2的選擇性培養(yǎng)基(例如，含有對應(yīng)于所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中提供的抗生素抗性基因的抗生素)中；第13天，使用FicollHypaque密度梯度分離法將活細(xì)胞與死細(xì)胞分離，然后將所述活細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。
[0083]⑶4+和⑶8+細(xì)胞可以用編碼CAR的表達(dá)載體進(jìn)行修飾。在實(shí)施方案中，然后如上所述，通過針對這些細(xì)胞群中每一種是唯一的細(xì)胞表面抗原的分選，將這些細(xì)胞進(jìn)一步分類為初始、中心記憶和效應(yīng)細(xì)胞亞群。此外，CD4+或CD8+細(xì)胞群可通過其細(xì)胞因子譜或增殖活性來挑選。例如，可以挑選用抗原刺激時，相比假(sham)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞，具有提高的細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-10、TNFa和IFN Y產(chǎn)物的CD4+T淋巴細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，挑選出具有提高的IL-2和/或TNF a產(chǎn)物的初始CD4+T細(xì)胞。同樣，相比假轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞，將具有提高的IFNy產(chǎn)物的CD8+細(xì)胞挑選出來。
[0084]在實(shí)施方案中，將響應(yīng)抗原而增殖的CD4+和CD8+細(xì)胞挑選出來。例如，挑選出用抗原刺激時，相比假轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞或轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞，增殖旺盛的CD4+細(xì)胞。
[0085]在一些實(shí)施方案中，挑選出對于帶有抗原的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性的CD4+和CD8+細(xì)胞。在實(shí)施方案中，預(yù)期相比CD8+細(xì)胞，CD4+具有弱的細(xì)胞毒性。
[0086]本申請預(yù)期，⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的組合可用于組合物中。在一個實(shí)施方案中，組合CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+細(xì)胞可與對CAR具有同樣的抗原特異性的CD8+抗原反應(yīng)性細(xì)胞組合。在其它實(shí)施方案中，將CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞與抗原反應(yīng)性CD4+細(xì)胞組合。在又一個實(shí)施方案中，將CAR修飾的⑶4+和⑶8+細(xì)胞組合。
[0087]如本文所描述，本申請預(yù)期，可將⑶4+和⑶8+細(xì)胞進(jìn)一步分開為亞群如初始、中心記憶和效應(yīng)細(xì)胞群。如本文所描述，在一些實(shí)施方案中，初始⑶4+細(xì)胞為⑶45R0-、⑶45RA+、⑶62L+⑶4+T細(xì)胞。 在一些實(shí)施方案中，中心記憶性⑶4+細(xì)胞為⑶62L陽性和⑶45R0陽性。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)⑶4+細(xì)胞為⑶62L陰性和⑶45R0陽性。這些細(xì)胞群的每一種均可獨(dú)立地用CAR修飾。
[0088]如本文所描述，在實(shí)施方案中，記憶T細(xì)胞存在于⑶8+外周血淋巴細(xì)胞的⑶62L+和⑶62L-亞群中。用抗-⑶8和抗-⑶62L抗體染色后，將PBMC分類為⑶62L-⑶8+和⑶62L+⑶8+部分。在一些實(shí)施方案中，中心記憶性TCM的表型標(biāo)志物的表達(dá)包括⑶62L、CCR7、⑶28、⑶3和⑶127，其對于顆粒酶B為陰性的。在一些實(shí)施方案中，中心記憶性T細(xì)胞為CD45R0+、CD62L+、CD8+T細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)Te對于CD62L、CCR7、CD28和CD 127為陰性的，對于顆粒酶B和穿孔素為陽性的。在一些實(shí)施方案中，初始CD8+T淋巴細(xì)胞的特征在于 CD8+、CD62L+、CD45R0+、CCR7+、CD28+、CD127+ 和 CD45R0+。這些細(xì)胞群的每一種均可獨(dú)立地用CAR修飾。
[0089]⑶4+和⑶8+細(xì)胞亞群的每一種均可彼此組合。在一個具體實(shí)施方案中，將修飾的初始CD4+細(xì)胞與修飾的中心記憶CD8+T細(xì)胞組合，以提供針對帶有抗原的細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞的協(xié)同細(xì)胞毒性作用。
[0090]方法[0091]本申請?zhí)峁┝酥苽溥^繼性細(xì)胞免疫治療組合物的方法，以及使用這些組合物在患有疾病或病癥的個體中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的用途和方法。
[0092]在實(shí)施方案中，制備所述組合物的方法包括獲得修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞，其中所述修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0093]在另一個實(shí)施方案中，方法還包括獲得修飾的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其中所述修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+細(xì)胞,所述嵌合抗原受體包含對疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0094]在另一個實(shí)施方案中，方法包括獲得修飾的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞，其中所述修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域，還包括將所述修飾的CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞與抗原特異性CD4+輔助細(xì)胞淋巴細(xì)胞制劑組合。
[0095]用CAR修飾的⑶4+和⑶8+細(xì)胞制劑已經(jīng)在上文和實(shí)施例中進(jìn)行了描述。抗原特異性T淋巴細(xì)胞可從患有疾病或病癥的患者中獲得，或者可在抗原存在下通過體外刺激T淋巴細(xì)胞來制備。CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群也可按照本文所描述的進(jìn)行分離并在制備方法中組合。
[0096]本申請還提供了在患有疾病或病癥的個體中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療方法，包括施用權(quán)利要求1-19任一項中的組合物。在其它實(shí)施方案中，方法包括向個體施用提供細(xì)胞免疫應(yīng)答的遺傳修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑，其中所述細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞,所述嵌合抗原受體包含對疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞或其它受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域；以及遺傳修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑，其引發(fā)直接的腫瘤識別并增強(qiáng)所述遺傳修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，其中所述輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對與疾病或病癥相關(guān)的抗原有特異性的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
[0097]在另一個實(shí)施方案中，在患有疾病或病癥的個體中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法包括:向所述個體施用遺傳修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑，其中所述修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對與所述疾病或病癥相關(guān)的抗原有特異性的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊。在一個實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括向個體施用遺傳修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑，其中所述修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8陽性細(xì)胞,所述嵌合抗原受體包含對與所述疾病或病癥相關(guān)的抗原有特異性的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊。
[0098]另一實(shí)施方案描述了在患有疾病或病癥的個體中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法，包括:分析所述個體的生物樣本中所述疾病或病癥相關(guān)抗原的存在，以及施用本文所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中嵌合抗原受體特異性結(jié)合至所述抗原。
[0099]制備CAR，其具有提供與疾病或病況如實(shí)體瘤、癌癥、病毒感染和寄生蟲感染有關(guān)的抗原特異性結(jié)合的組件(component)。在實(shí)施方案中,所述嵌合抗原受體的T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊包含跨膜域、CD28信號傳導(dǎo)域和CD3胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域或T細(xì)胞共刺激分子的其它域。在一些實(shí)施方案中，所述胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子包含⑶3胞內(nèi)域、⑶28域、連接至CD3胞內(nèi)域的CD28跨膜和信號傳導(dǎo)域，或T細(xì)胞共刺激分子其它域。
[0100]在可選的實(shí)施方案中，T細(xì)胞可用重組T細(xì)胞受體進(jìn)行修飾。TCR可以對任一抗原、病原體或腫瘤具有特異性。存在針對在黑素瘤(例如，MART1、gplOO)、白血病(例如，WT1、次要組織相容性抗原)、乳腺癌(例如，her2、NY-BRl)中的許多腫瘤抗原的TCR。
[0101]在一些實(shí)施方案中，⑶4+輔助性T淋巴細(xì)胞選自初始⑶4+T細(xì)胞、中心記憶性⑶4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性⑶4+T細(xì)胞或大型⑶4+T細(xì)胞。在一個具體的實(shí)施方案中，⑶4+輔助性淋巴細(xì)胞為初始⑶4+T細(xì)胞，其中所述初始⑶4+T細(xì)胞包括⑶45R0-、⑶45RA+、⑶62L+⑶4+T細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，所述⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞選自初始⑶8+T細(xì)胞、中心記憶性⑶8+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性⑶8+T細(xì)胞或大型⑶8+T細(xì)胞。在一個具體的實(shí)施方案中，⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞為中心記憶性T細(xì)胞，其中所述中心記憶性T細(xì)胞包括⑶45R0+、⑶62L+、⑶8+T細(xì)胞。在一個具體的實(shí)施方案中，所述⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞為中心記憶性T細(xì)胞，且所述⑶4+輔助性T淋巴細(xì)胞為初始⑶4+T細(xì)胞。
[0102]在實(shí)施方案中，⑶8+T細(xì)胞和⑶4+T細(xì)胞都用包含特異性結(jié)合至病原體或腫瘤特異性細(xì)胞表面抗原的抗體重鏈域的CAR進(jìn)行了遺傳修飾。在其它實(shí)施方案中，所述CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域和所述CD4輔助性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域相同。在其它實(shí)施方案中，所述CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域和所述CD4輔助性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域不同。
[0103]通常可由本發(fā)明治療的個體為人和其它靈長類個體，如用于獸醫(yī)藥目的的猴和猿。所述個體可為雄性或雌性，且可為任何合適的年齡，包括嬰幼兒、少年、青年、成年和老年個體。
[0104]所述方法可用于治療例如，實(shí)體瘤、惡性血液病、黑素瘤，或者病毒或其它病原體感染。病原體感染包括HIV、HCV、HBV、CMV和寄生蟲病。在一些實(shí)施方案中，與所述疾病或病癥相關(guān)的抗原選自酪氨酸激酶孤兒受體RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、間皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原。
[0105]可治療的個體包括患有癌癥的個體，所述癌癥包括但不限于結(jié)腸、肺、肝臟、乳腺、前列腺、卵巢、皮膚(包括黑素瘤)、骨骼和腦部的癌癥等。在一些實(shí)施方案中，腫瘤相關(guān)的抗原是已知的，如黑素瘤、乳腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、白血病、骨髓瘤、前列腺癌等(在這些實(shí)施方案中，可以分離記憶T細(xì)胞或通過引入所述T細(xì)胞受體基因?qū)ζ溥M(jìn)行改造)。在其它實(shí)施方案中，可以用表達(dá)改造的免疫受體的遺傳修飾的T細(xì)胞來靶向所述腫瘤相關(guān)蛋白。實(shí)例包括但不限于B細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、前列腺癌和白血病。
[0106]可被治療的個體還包括患有傳染病或具有發(fā)展為傳染病風(fēng)險的個體，所述傳染病包括但不限于病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、細(xì)菌和原生動物感染等?？杀恢委煹膫€體包括患有病毒感染的免疫缺陷型患者，包括但不限于移植患者中的巨細(xì)胞病毒(CMV)、愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒(EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒感染等。
[0107]根據(jù)已知技術(shù)或基于本申請公開而對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的其變體，按照以上描述制備的細(xì)胞可用于進(jìn)行過繼性免疫治療的方法和組合物中。參見,例如，Gruenberg等人的美國專利申請公開N0.2003/0170238,也參見Rosenberg的美國專利N0.4，690, 915。
[0108]在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞配制如下:首先從其培養(yǎng)基收獲它們，然后在適于以治療有效量施用的培養(yǎng)基和容器系統(tǒng)(“藥學(xué)上可接受的”載體)中洗滌和濃縮所述細(xì)胞。合適的輸注培養(yǎng)基可為任何等滲培養(yǎng)基制劑，通常為生理鹽水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)注射液,也可使用5%葡萄糖水或林格氏乳酸鹽溶液。所述輸注培養(yǎng)基可以補(bǔ)充有人血清白蛋白。
[0109]組合物中的治療有效量的細(xì)胞為至少2細(xì)胞(例如，I個⑶8+中心記憶性T細(xì)胞和I個⑶4+輔助性T細(xì)胞亞群)，或者更通常為大于IO2個細(xì)胞，多達(dá)106，多達(dá)并包括IO8或IO9個細(xì)胞，并且可以大于IOltl個細(xì)胞。細(xì)胞的數(shù)量取決于組合物預(yù)期的最終應(yīng)用及其所包括的細(xì)胞類型。例如，如果期望細(xì)胞對于特定抗原具有特異性，則細(xì)胞群應(yīng)含有大于70%，通常大于80%、85%和90-95%的這類細(xì)胞。對于本文提供的應(yīng)用，通常細(xì)胞在I升或更少的體積中，可以為500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，所期望的細(xì)胞的密度通常大于IO6細(xì)胞/ml，通常大于IO7細(xì)胞/ml，通常IO8細(xì)胞/ml或更大。臨床上相關(guān)的免疫細(xì)胞數(shù)目可分配到多個輸注，累積等于或大于109、IO10或IO11個細(xì)胞。
[0110]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的淋巴細(xì)胞可用于賦予個體免疫力。所用“免疫力”是指減輕與對病原體感染或腫瘤的應(yīng)答有關(guān)的一個或多個身體癥狀，淋巴細(xì)胞的應(yīng)答針對所述病原體感染或腫瘤。所施用細(xì)胞的量通常為在具有針對病原體的免疫力的正常個體中存在的范圍。因此，所述細(xì)胞通常通過輸注施用，每次輸注的用量范圍從2個細(xì)胞到至少IO6-1Oltl個細(xì)胞/m2，優(yōu)選范圍為至少IO7-1O9細(xì)胞/m2。克隆可通過單次輸注施用，或通過在一段時間中進(jìn)行多次輸注。然而，由于預(yù)期不同個體的響應(yīng)性也不同，輸注細(xì)胞的類型、數(shù)量以及輸注次數(shù)和進(jìn)行多次輸注的時間范圍由主治醫(yī)生確定，這可以通過常規(guī)檢查來確定。如本文所示例，足夠水平的T淋巴細(xì)胞(包括細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和/或輔助性T淋巴細(xì)胞)的產(chǎn)生可使用本發(fā)明的快速擴(kuò)增方法容易地獲得。參見，例如，Riddell等人的美國專利 N0.6,040，177，第 17 欄。
[0111]在下述實(shí)施例中進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0112]實(shí)驗(yàn)
`[0113]實(shí)施例1-T細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)和CAR表達(dá)分析
[0114]RORl-特異性CAR可在人⑶8+T細(xì)胞中表達(dá)，并賦予特異性識別R0R1+B-細(xì)胞腫瘤而非成熟的正常B細(xì)胞的能力。我們構(gòu)建了 RORl-特異性嵌合抗原受體，當(dāng)其在來自健康供體或CLL患者的T細(xì)胞中表達(dá)時，賦予特異性識別原代B-CLL和套細(xì)胞淋巴瘤的能力。
[0115]材料和方法
[0116]細(xì)胞系
[0117]如所描述的(25)，制備愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒(EBV)轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞(EBV-LCL)。腫瘤細(xì)胞系 Jeko-1 和 BALL-1 由 Oliver Press 和 Jerald Radich (弗雷德哈欽森癌癥研究中心)博士提供。所有細(xì)胞系均維持于RPMI中，10%胎牛血清、0.8mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素(LCL培養(yǎng)基)。K562細(xì)胞獲自美國典型培養(yǎng)物中心(AmericanType Culture Collection)。
[0118]用RORl轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞
[0119]對于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-擴(kuò)增所述RORl-基因，由B-CLL細(xì)胞獲得總RNA (RNeasyPlusKit; QIAGEN),并用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄至 cDNA 中。使用Herculase-1I DNA 聚合酶(Stratagene)，用特定的引物進(jìn)行 PCR(R0R1_F: 5-XhoIAGAGGAGGAATGCACCGGCC-3,以及 R0R1-R: 5-Xho1-CACAGAAGGTACTTGTTGCGATGT_3)。將所述 PCR產(chǎn)物克隆至MIGR-1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(23)中，并驗(yàn)證其序列。將Effectene轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)用于轉(zhuǎn)染具有MIGR-1/R0R1的鉬(Platinum)-A細(xì)胞(Cell Biolabs)，并產(chǎn)生RORl-編碼的逆轉(zhuǎn)錄病毒。將K562細(xì)胞于32°C以2500rpm離心60min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，擴(kuò)增，然后將所述RORl-陽性細(xì)胞亞群分選純化。
[0120]實(shí)時定量PCR
[0121]按照前述段落的描述制備B-CLL、正常的靜止和活化B細(xì)胞和EBV-LCL的第一鏈cDNA。來自正常組織(人組織板(Human Tissue panel) I/II, Blood Fractions)的第一鏈cDNA獲自Clontech。一式兩份分析RORlmRNA的表達(dá)，并相對于GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在ABI Prism7900 (Applied Biosystems)上于50 y L反應(yīng)物中進(jìn)行擴(kuò)增，所述反應(yīng)物由25 y LPower SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)>2.5ng 的 cDNA 和 300nM 基因-特異性正向和反向引物組成:
[0122]R0R1-F5-AGCGTGCGATTCAAAGGATT-3，
[0123]R0R1-R5-GACTGGTGCCGACGATGACT-3,
[0124]GAPDH-F5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，以及
[0125]GAPDH-R5-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3。
[0126]使用SDS軟件v2.2.2 (Applied Biosystems)確定所述循環(huán)閾值(Ct),用比較性Ct法(2_(A ACt))計算基因表達(dá)水平。
[0127]載體構(gòu)建和慢病毒的制備
[0128]CD20-CAR(CD20R-印HIV7)和綠色熒光蛋白(GFP)-編碼的慢病毒載體(GFP-印HIV7)如前所述(24)。R0R1-CAR被編碼于相同的載體中。在以前的研究中制備、克隆并表征了小鼠mAb (克隆2A2)，其顯示了對在原代B-CLL和MCL腫瘤細(xì)胞系表達(dá)的人RORl的特異性結(jié)合。合成了編碼包含mAb2A2的VL和VH鏈的scFv的密碼子優(yōu)化核苷酸序列(GENEART)，并用NheI和RsrII限制位點(diǎn)克隆至CD20R-印HIV7以替換CD20-特異性ScFv0在293T細(xì)胞中制備慢病毒,所述細(xì)胞利用EfTectene(Qiagen)共轉(zhuǎn)染了慢病毒載體與包裝載體pCHGP-2、pCMVRev2和pCMV_G。轉(zhuǎn)染后16小時更換培養(yǎng)基，48小時后收集慢病毒。
[0129]慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞克隆的分離
[0130]用抗-CD3mAb (30ng/mL)激活來自健康供體和B-CLL患者的PBMC以及分選純化的CD8+CD45R0+CD62L+中心記憶性T細(xì)胞(TCM) (25)，激活后的第2和3天，在補(bǔ)充有I U g/mL聚凝胺(Sigma-Aldrich)和50IU/mL重組人白介素-2 (IL-2)的慢病毒上清液中，通過于320C以2500rpm離心60min進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。含有10%人血清、2mM L-谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素的RPMI (CTL培養(yǎng)基)中擴(kuò)增T細(xì)胞(25)。擴(kuò)增后，將等份的每個轉(zhuǎn)導(dǎo)T-細(xì)胞系用生物素-偶聯(lián)的抗-EGFR(表皮生長因子受體)mAb、鏈霉親和素-PE和抗-OTSmAb進(jìn)行染色。將EGFR+⑶8+T細(xì)胞分選純化并通過有限稀釋法(0.5細(xì)胞/孔)克隆(25)。通過用生物素化的重組Fc-RORl胞外域融合蛋白和鏈霉親和素-PE染色來鑒定R0R1-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞。在瞬時轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞(Invitrogen)中生產(chǎn)重組R0R1-蛋白，如描述進(jìn)行純化(26)，并用BiotinTag試劑盒(Sigma)進(jìn)行生物素化。通過流式細(xì)胞儀鑒定GFP-轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶8+T細(xì)胞，將其分選純化并以類似方式克隆。[0131]鉻釋放和細(xì)胞因子分泌檢測
[0132]用51Cr(PerkinElmer)標(biāo)記靶細(xì)胞過夜，洗滌并按一式三份以1-2X103細(xì)胞/孔和不同的效應(yīng)細(xì)胞比靶細(xì)胞(E:T)比例與效應(yīng)T細(xì)胞一起孵育。孵育4小時后，收集上清液用于Y計數(shù)，用標(biāo)準(zhǔn)公式計算特異性細(xì)胞溶解(25)。
[0133]結(jié)果
[0134]利用生物素化的抗-EGFR mAb和鏈霉親和素偶聯(lián)的染料來分選純化轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶8+T細(xì)胞。通過用直接結(jié)合至RORl-CAR的scFv的生物素化重組Fc-RORl胞外域融合蛋白來染色所述細(xì)胞以及與鏈霉親和素-偶聯(lián)物共染色，評估了分選純化的T細(xì)胞表面上的RORl-CAR表達(dá)。Fc-RORl-蛋白特異性染色用RORl-CAR慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞，而不染色用編碼GFP的對照慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞(圖1)。
[0135]我們通過有限稀釋法建立了 RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的(n=10)和對照GFP-轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T-細(xì)胞克隆(n=4)，并證實(shí)了在多輪體外擴(kuò)增后，CAR穩(wěn)定的細(xì)胞表面表達(dá)。相比未轉(zhuǎn)導(dǎo)的或GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的T-細(xì)胞克隆，RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T-細(xì)胞克隆的生長并沒有明顯差異(數(shù)據(jù)未不出)。
[0136]RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T-細(xì)胞克隆，有效地裂解了用RORl-基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的原代B-CLL和K562細(xì)胞，而非初始、RORl-陰性K562細(xì)胞，這證明了對RORl的特異性識別(圖2).[0137]討論
[0138]在臨床試驗(yàn)上針對B-細(xì)胞惡性腫瘤研究了使用CAR-修飾的T細(xì)胞的過繼性免疫治療。被靶向的表面分子為B-細(xì)胞譜系-特異性的，且包括從祖-B-細(xì)胞階段至漿細(xì)胞的正常B-譜系細(xì)胞上表達(dá)的⑶19，以及從前-B-細(xì)胞階段至記憶B細(xì)胞的正常B細(xì)胞上表達(dá)的CD20。因此，靶向這些分子的預(yù)期的有效治療結(jié)果是正常B細(xì)胞和B-細(xì)胞前體的消減。在2個獨(dú)立的分析中，基因表達(dá)譜研究已經(jīng)鑒定了優(yōu)先或僅由惡性而非正常B細(xì)胞表達(dá)的基因，以及作為CLL標(biāo)簽基因出現(xiàn)的RORl (27，28)。在用已經(jīng)修飾為表達(dá)⑶154的自體腫瘤細(xì)胞進(jìn)行接種后，在CLL患者中產(chǎn)生 了針對RORl的特異性抗體，用來那多胺(Ienalidomide)治療對正常組織無明顯毒性，表明該腫瘤抗原可以是用于免疫治療的適合靶標(biāo)(29，30)。
[0139]我們的研究說明了用改造的表達(dá)RORl-CAR的T細(xì)胞靶向RORl-陽性腫瘤細(xì)胞的可能性。在慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)大型PBMC或分選純化的TCM后，⑶8+R0R1-CAR T細(xì)胞可源自正常供體和CLL患者，其在過繼轉(zhuǎn)移后于動物模型中長時間持續(xù)存在(31)。RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞有效地裂解了原代B-CLL而非正常靜止或激活的B-細(xì)胞。這些T細(xì)胞產(chǎn)生了效應(yīng)細(xì)胞因子包括TNF- a、IFN Y和IL-2，并且能夠響應(yīng)表達(dá)RORl的腫瘤細(xì)胞而增殖。
[0140]實(shí)施例2 -制備⑶4+CAR T細(xì)胞系以及效應(yīng)功能分析
[0141]CD4+R0R1-CAR T細(xì)胞可由健康供體/CLL-患者的PBMC產(chǎn)生。RORl-特異性CAR可在人⑶4+Τ細(xì)胞中表達(dá)，并賦予特異性識別R0R1+B-細(xì)胞腫瘤而非成熟的正常B細(xì)胞的能力。
[0142]材料和方法
[0143]細(xì)胞系
[0144]如所描述的(25)制備愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒(EBV)轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞(EBV-LCL) ο 腫瘤細(xì)胞系 Jeko-1 和 BALL-1 由 Oliver Press 和 Jerald Radich(弗雷德哈欽森癌癥研究中心)博士提供。所有細(xì)胞系均維持于RPMI中，含有10%胎牛血清、0.8mML-谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素(LCL培養(yǎng)基)。K562細(xì)胞和293T細(xì)胞獲自美國典型培養(yǎng)物中心(American Type Culture Collection)并根據(jù)其指導(dǎo)進(jìn)行培養(yǎng)。
[0145]用RORl轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞
[0146]對于RORl-基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)-擴(kuò)增，由B-CLL細(xì)胞獲得總RNA (RNeasyPlusKit; QIAGEN),并用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄至 cDNA 中。使用Herculase-1I DNA 聚合酶(Stratagene)，用特異性引物進(jìn)行 PCR(R0R1_F: 5-XhoIAGAGGAGGAATGCACCGGCC-3,以及 R0R1-R: 5-Xho1-CACAGAAGGTACTTGTTGCGATGT_3)。將所述 PCR產(chǎn)物克隆至MIGR-1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(23)中，并驗(yàn)證其序列。將Effectene轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)用于轉(zhuǎn)染具有MIGR-1/R0R1的鉬(Platinum)-A細(xì)胞(Cell Biolabs)，并產(chǎn)生RORl-編碼的逆轉(zhuǎn)錄病毒。將K562細(xì)胞于32°C以2500rpm離心60min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，擴(kuò)增，然后分選純化RORl-陽性細(xì)胞亞群。
[0147]載體構(gòu)建和慢病毒的制備
[0148]CD20-CAR(CD20R-印HIV7)和綠色熒光蛋白(GFP)-編碼的慢病毒載體(GFP-印HIV7)如先前的描述(24)。RORl-CAR被編碼于相同的載體中。在此前的研究中已制備、克隆并表征了小鼠mAb (克隆2A2)，其顯示了對原代B-CLL和MCL腫瘤細(xì)胞系表達(dá)的人RORl的特異性結(jié)合。合成了編碼包含mAb2A2的VL和VH鏈的scFv的密碼子優(yōu)化核苷酸序列(GENEART)，并用NheI和RsrII限制位點(diǎn)克隆至CD20R-印HIV7以替換CD20-特異性scFv。在293T細(xì)胞中使用Effectene (Qiagen)將慢病毒載體與包裝載體pCHGP_2、pCMVRev2和pCMV-G共轉(zhuǎn)染來制備慢病毒。轉(zhuǎn)染后16h更換培養(yǎng)基，48h后收集慢病毒。
[0149]慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞系的分離
[0150]從來自健康供體的PBMC中分離⑶4+T細(xì)胞，并用抗-⑶3mAb (30ng/mL)激活(25)，激活后的第2和3天,在補(bǔ)充 有I μ g/mL聚凝胺(Sigma-Aldrich)和50IU/mL重組人白介素-2(IL-2)的慢病毒上清液中，通過于32°C以2500rpm離心60min進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。在含有10%人血清、2mML-谷氨酰胺和1%青霉素-鏈霉素的RPMI (CTL培養(yǎng)基)中擴(kuò)增T細(xì)胞(25)。擴(kuò)增后，將等份的每個轉(zhuǎn)導(dǎo)的T-細(xì)胞系用生物素-偶聯(lián)的抗_EGFR(表皮生長因子受體)mAb、鏈霉親和素-PE和抗-⑶4mAb進(jìn)行染色。將EGFR+⑶4+T細(xì)胞分選純化并擴(kuò)增。通過用生物素化的重組Fc-RORl胞外域融合蛋白和鏈霉親和素-PE染色來鑒定RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞。在瞬時轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞(Invitrogen)中生產(chǎn)重組RORl-蛋白，如所描述的進(jìn)行純化(26),并用BiotinTag試劑盒(Sigma)進(jìn)行生物素化。通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定GFP-轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞，對其分選純化并以類似方式克隆。
[0151]鉻釋放和細(xì)胞因子分泌檢測
[0152]用51Cr (PerkinElmer)標(biāo)記靶細(xì)胞過夜，洗滌并按一式三份以1-2 X IO3細(xì)胞/孔和不同的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞(E:T)比例與效應(yīng)T細(xì)胞一起孵育。孵育4小時后，收集上清液用于Y計數(shù)，用標(biāo)準(zhǔn)公式計算特異性細(xì)胞溶解(25)。對于細(xì)胞因子分泌分析，將靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞以2:1的E/T比例接種到三個重復(fù)的孔中，孵育24小時后，在移出的上清液中通過多重細(xì)胞因子免疫測定(Luminex)測量干擾素INF Y、腫瘤壞死因子(TNF-α )和IL-2。
[0153]CFSE增殖測定
[0154]用0.2 μ M羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE; Invitrogen)標(biāo)記T細(xì)胞，洗滌T細(xì)胞，并將其與刺激細(xì)胞(stimulator cells)以2:1的比例接種于含有10U/mL重組人IL-2的CTL培養(yǎng)基中。孵育72小時后，用抗-CD4mAb和碘化丙啶(PI)標(biāo)記細(xì)胞以將死細(xì)胞排除在分析之外。樣本通過流式細(xì)胞術(shù)分析，通過CFSE稀釋來評估活CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞分裂。
[0155]共培養(yǎng)檢測
[0156]用CFSE標(biāo)記RORl-CAR轉(zhuǎn)染的CD4+T細(xì)胞和RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，以2:1、1:1和1:2的比例共培養(yǎng)。然后，用K562/R0R1細(xì)胞和對照K562細(xì)胞刺激所述共培養(yǎng)物，孵育5天后通過CFSE染色稀釋測定來測量細(xì)胞增殖。對于流式分析，用偶聯(lián)的抗-⑶8和抗-⑶4mAb染色染色樣本以區(qū)分⑶8+和⑶4+亞群。
[0157]結(jié)果
[0158]從健康供體和CLL患者的PBMC制備⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞
[0159]我們已經(jīng)表明，癌胚酪氨酸激酶受體RORl在CLL和MCL上均一表達(dá)，并由抗-RORlmAb產(chǎn)生R0R1-CAR，當(dāng)在⑶8+T細(xì)胞中表達(dá)時其賦予特異性識別惡性而非成熟正常B細(xì)胞的能力(32)。在本發(fā)明中，我們制備了 CD4+R0R1-CAR T細(xì)胞以分析直接的腫瘤識別和它們增強(qiáng)⑶8+R0R1-CAR CTL的能力。使用編碼RORl-CAR的慢病毒載體，可以很容易地由來自健康供體(n=4)和CLL患者(n=4)的大型外周⑶4+T細(xì)胞制備CAR-修飾的⑶4+T細(xì)胞。在該載體中，我們編碼了在RORl-CAR和可自我剪切的2A元件(element)下游的截短型EGFR(表皮生長因子受體，tEGFR)域，以作為轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)記和用于利用抗-EGFR mAb富集表達(dá)轉(zhuǎn)基因的T細(xì)胞(圖3)。利用tEGFR標(biāo)志物，我們在用編碼RORl-CAR的慢病毒(M0I=3)進(jìn)行單次轉(zhuǎn)導(dǎo)后第12天，確定了 CAR-修飾的T細(xì)胞的頻數(shù)，并發(fā)現(xiàn)相比來自相同個體的CD8+CART細(xì)胞系，在⑶4+中一致具有更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。為了證明RORl-CAR在⑶4+T細(xì)胞表面上的表達(dá)，我們利用了生物素化的重組Fc-RO`Rl胞外域融合蛋白，其直接結(jié)合至RORl-CAR的scFv并特異性染色用RORl-CAR慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞而非未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照CD4+T細(xì)胞(圖3)。我們利用tEGFR標(biāo)志物富集了表達(dá)轉(zhuǎn)基因的⑶4+T細(xì)胞，并且通過用抗-⑶3mAb刺激擴(kuò)增了 CAR-陽性T細(xì)胞亞群。在14-天刺激周期結(jié)束時可獲得大于3-log擴(kuò)增的⑶4+CAR T細(xì)胞，其與在⑶8+CAR CTL中觀察到的擴(kuò)增相當(dāng)。擴(kuò)增后，我們證實(shí)了 RORl-CAR在⑶4+CAR T細(xì)胞表面上的穩(wěn)定表達(dá)(數(shù)據(jù)未示出)，并分析了 RORl-陽性腫瘤細(xì)胞的識別。
[0160]⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞特異性識別RORl-陽性腫瘤
[0161]我們分析了⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞針對RORl-陽性原代腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞系的效應(yīng)功能。我們通過鉻釋放試驗(yàn)(CRA)分析了 CD4+CART細(xì)胞賦予直接的細(xì)胞毒性的能力，并在標(biāo)準(zhǔn)的4-小時孵育結(jié)束時檢測到RORl-陽性靶細(xì)胞的較弱但具有特異性的細(xì)胞溶解(圖4)。我們將CRA延長至10小時，并觀察到進(jìn)一步增加的特異性細(xì)胞溶解，然而，CD4+CART細(xì)胞的總體溶細(xì)胞活性還是低于⑶8+R0R1-CAR CTL(圖2，4)。通過IFN-Y ELISA，來自健康供體和CLL患者的⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞特異性識別了原代CLL細(xì)胞、RORl-陽性腫瘤細(xì)胞系 Jeko-1 (MCL)和 BALL-1 (B-ALL)，以及用 RORl-基因(K562/R0R1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 K562 細(xì)胞，而不識別初始RORl-陰性K562細(xì)胞，證明了對靶細(xì)胞的細(xì)胞表面上的RORl的特異性識別(圖5A)。多重細(xì)胞因子分析揭示產(chǎn)生了相比⑶8+CAR CTL明顯更高水平的其它Thl細(xì)胞因子如 TNF- a 和 IL-2,并產(chǎn)生了 IL-4、IL-10 和 IL-17 (圖 5B)。
[0162]接著，我們通過CFSE染色評估了用RORl-陽性腫瘤細(xì)胞刺激后的⑶4+CAR T細(xì)胞的增殖，并且使用了不添加外源細(xì)胞因子的嚴(yán)格培養(yǎng)條件以去除任何潛在的非特異性刺激。⑶4+CAR T細(xì)胞顯示出響應(yīng)RORl-陽性腫瘤細(xì)胞的明顯且具有特異性的增殖。經(jīng)誘導(dǎo)進(jìn)行增殖的T細(xì)胞百分比和增殖亞群進(jìn)行細(xì)胞分裂的次數(shù)在CD4+中均明顯高于CD8+CART細(xì)胞(圖6)。總之，我們的數(shù)據(jù)表明，來自健康供體和CLL患者的⑶4+T細(xì)胞，用RORl-特異性CAR進(jìn)行遺傳修飾后，獲得了抗腫瘤反應(yīng)性。而且，在無外源細(xì)胞因子條件下增殖和產(chǎn)生高水平Thl細(xì)胞因子的能力，意味著通過CAR刺激后，CD4+CAR T細(xì)胞表現(xiàn)出典型的輔助性功能，除了賦予直接的抗-腫瘤效應(yīng)，其還可以用于增強(qiáng)⑶8+CAR CTL0
[0163]CAR-修飾的但未轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+T細(xì)胞為⑶8+CAR CTL提供幫助
[0164]為了分析⑶4+CAR T細(xì)胞是否能夠?yàn)棰?+CAR CTL提供幫助，我們用從健康供體和CLL患者建立的CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的和對照未轉(zhuǎn)導(dǎo)的多克隆CD4+和CD8+T細(xì)胞系進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。作為提供了幫助的數(shù)據(jù)讀出，我們定義了相比單獨(dú)培養(yǎng)的CD8+T細(xì)胞，在CD4+T細(xì)胞存在下腫瘤特異性CD8+效應(yīng)功能的改善。我們將CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的或未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照CD4+T細(xì)胞與CD8+CAR CTL以不同的CD4:CD8比例(2: 1，1: 1，1:2)組合，用RORl-陽性腫瘤細(xì)胞刺激它們，并通過CFSE染料稀釋法來測量增殖。我們發(fā)現(xiàn)，將CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的而非未轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+T細(xì)胞添加至⑶8+CAR CTL，相比單獨(dú)的⑶8+CAR CTL,明顯增加了⑶8+亞群的特異性增殖(圖7)。當(dāng)把至少等量的⑶4+CAR T細(xì)胞(⑶4:⑶8比例為2:1或1:1)加入至共培養(yǎng)物中時，增殖的增加最顯著。將未轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+和未轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶8+T細(xì)胞組合作為另外的對照，在⑶8+亞群中沒有誘導(dǎo)出非特異性的增殖(數(shù)據(jù)未示出)。
[0165]討論
[0166]在兩個獨(dú)立的分析中，基因表達(dá)譜研究已經(jīng)確定了優(yōu)先或僅由惡性而非正常B細(xì)胞表達(dá)的基因，以及作為CLL標(biāo)簽基因出現(xiàn)的RORl (27，28)。我們的研究說明了用改造的表達(dá)RORl-CAR的T細(xì)胞靶向RORl-陽性惡性細(xì)胞的可能性。⑶8和⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞可以源自大型PBMC或分選純化的T細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的正常供體。⑶8+R0R1-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞有效地溶解了原代B-CLL而不是正常的靜止或激活的B-細(xì)胞。⑶4+R0R1-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞較弱地溶解了原代B-CLL而不是正常的靜止或激活的B-細(xì)胞。這些T細(xì)胞產(chǎn)生了效應(yīng)細(xì)胞因子包括TNF- a、IFN Y、IL-2, IL-4和IL-10。CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量明顯高于轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+細(xì)胞。兩種細(xì)胞類型均能夠響應(yīng)表達(dá)RORl的腫瘤細(xì)胞而增殖。而且，⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞的增殖比⑶8+R0R1-CAR CTL高2_3倍。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+輔助性T細(xì)胞表現(xiàn)出典型的輔助性功能，意味著它們可用于增強(qiáng)CD8+CAR CTL0
[0167]實(shí)施例3-源自初始、中心和效應(yīng)記憶性細(xì)胞亞群的⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞的效應(yīng)功能
[0168]比較了源自初始、中心和效應(yīng)記憶性細(xì)胞亞群、然后用R0R1CAR修飾的⑶4T細(xì)胞的效應(yīng)功能。
[0169]材料和方法
[0170]分選純化初始、中心和效應(yīng)記憶性⑶4細(xì)胞
[0171]使用陰性磁珠選擇(Miltenyi⑶4分選試劑盒)從健康供體的PBMC中分離⑶4+T細(xì)胞，其產(chǎn)生未觸碰的(untouched)⑶4+T細(xì)胞。所述⑶4+部分用偶聯(lián)的抗-⑶45RA、抗-⑶45R0和抗-⑶62L mAb標(biāo)記,用FACSAria流式細(xì)胞分選儀(BD Biosciences)進(jìn)行流式分選純化，并基于這些定義的標(biāo)志物的表達(dá)純化初始(⑶45RA+⑶45R0-⑶62L+)、中心記憶(CD45RA-CD45R0+CD62L+)和效應(yīng)記憶性(CD45RA-CD45R0+CD62L-) CD4+T 細(xì)胞。
[0172]CFSE增殖檢測[0173]用0.2μ M羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE; Invitrogen)標(biāo)記T細(xì)胞，將其洗滌，并與刺激細(xì)胞(stimulator cells)以2:1的比例接種于含有10U/mL重組人IL-2的CTL培養(yǎng)基中。孵育72小時后，用抗-CD8或CD4mAb和碘化丙啶(PI)標(biāo)記細(xì)胞以將死細(xì)胞排除在分析之外。樣本用流式細(xì)胞儀分析，通過CFSE稀釋法來評估活CD8+和CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞分裂。
[0174]細(xì)胞因子檢測
[0175]為了分析細(xì)胞因子分泌，將靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞以2:1的E/T率接種于一式三份的孔中，孵育24小時后移出的上清液中通過多重細(xì)胞因子免疫測定(Luminex)來測量干擾素INF Y、腫瘤壞死因子(TNF- α )和IL-2。
[0176]結(jié)果
[0177]我們從3個健康供體的外周血中，基于⑶45RA、⑶45R0和⑶62L的表達(dá)，用流式分選純化⑶4+Ν、中心(CM)和效應(yīng)記憶性(EM)⑶4+Τ細(xì)胞(圖8Α)，并比較用RORl-CAR修飾后它們的效應(yīng)功能。在源自所述3個細(xì)胞亞群中每一個的CAR T細(xì)胞系中，我們獲得了類似的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。富集表達(dá)轉(zhuǎn)基因的T細(xì)胞后，多參數(shù)流式細(xì)胞儀顯示了在CD4+NCAR T細(xì)胞系中的⑶45R0表達(dá)和⑶45RA缺失，與慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后活化的表型一致。所述⑶4+N、CM和EM CAR T細(xì)胞系保持了差異化的⑶62L表達(dá)，這證實(shí)了起初的流式分選純化已經(jīng)高純度地完成。
[0178]然后，我們分析了源自N、CM和EM細(xì)胞亞群的⑶4+CAR T細(xì)胞的腫瘤識別、細(xì)胞因子分泌和增殖，并將它們與由大型⑶4+T細(xì)胞制備的CAR T細(xì)胞系比較。通過IFN- y ELISA我們在每個細(xì)胞系中都觀察到了 RORl-陽性腫瘤細(xì)胞的特異性識別。多重細(xì)胞因子分析揭示了，源自N細(xì)胞亞群的CD4+CAR T細(xì)胞產(chǎn)生了目前最高水平的Thl細(xì)胞因子尤其是IL-2 (圖8C)，且CFSE染料稀釋法顯示，它們響應(yīng)RORl-陽性腫瘤細(xì)胞的刺激進(jìn)行了最旺盛的增殖(圖8B)。
[0179]討論
[0180]我們的研究說明了用表達(dá)RORl-CAR的改造的T細(xì)胞靶向RORl-陽性惡性細(xì)胞的可能。⑶8和⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞可以源自慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)任一種大型PBMC后的正常供體，以及來自定義的初始或記憶T細(xì)胞亞群的分選純化的T細(xì)胞。⑶4+初始、中心記憶和效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞因子包括TNFa、正^^、幾-2、11^-4和11^-10。通過CAR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)后，源自初始細(xì)胞亞群的CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+細(xì)胞產(chǎn)生的TNF α和IL-2的量，明顯高于源自中心和效應(yīng)記憶細(xì)胞亞群的⑶4+CAR T細(xì)胞。所有⑶4細(xì)胞類型均能響應(yīng)R0R1/K562而增殖，然而，在源自初始細(xì)胞亞群的CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+細(xì)胞中，經(jīng)誘導(dǎo)增殖的T細(xì)胞的百分比和增殖的細(xì)胞亞群進(jìn)行分裂的次數(shù)明顯更高。細(xì)胞因子譜和增殖能力均顯示，初始⑶4+R0R1-CART細(xì)胞可能最適用于增強(qiáng)CD8+R0R1-CARCTL。
[0181]實(shí)施例4-初始⑶4+T細(xì)胞比記憶⑶4+T細(xì)胞更有助益
[0182]將初始、中心記憶和效應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+T細(xì)胞與轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，并測量所述細(xì)胞響應(yīng)K562/R0R1細(xì)胞刺激的增殖反應(yīng)。
[0183]材料和方法
[0184]共培養(yǎng)
[0185]用CFSE標(biāo)記源自初始、中心和效應(yīng)記憶性的RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+T細(xì)胞和源自初始和中心記憶性⑶8+T細(xì)胞的RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，且⑶4+和⑶8+CAR T細(xì)胞系以1:1的比例進(jìn)行共培養(yǎng)。然后，用K562/R0R1細(xì)胞和對照K562細(xì)胞刺激所述共培養(yǎng)物，孵育5天后通過CFSE染料稀釋法檢測細(xì)胞增殖。為了進(jìn)行流式分析，用偶聯(lián)的抗-⑶8和抗-⑶4mAb染色樣本以區(qū)分⑶8+和⑶4+亞群。
[0186]結(jié)果
[0187]⑶4+初始CAR T細(xì)胞在增強(qiáng)⑶8+CAR CTL的效應(yīng)功能方面具有優(yōu)異能力
[0188]我們比較了⑶4+N、CM和EM CAR T細(xì)胞系的輔助性功能，以確定是否⑶4+N CAR T細(xì)胞的良好細(xì)胞因子譜和增殖潛力也能轉(zhuǎn)化為對于CD8+CAR CTL的最強(qiáng)輔助性效應(yīng)。此前的工作已經(jīng)證明，N、CM和EM⑶8+T細(xì)胞之間存在影響其用于過繼性免疫治療的潛在效用的內(nèi)在差異。我們的小組最近揭示，過繼轉(zhuǎn)移后源自CM而非EM的CD8+T細(xì)胞能夠長時間持續(xù)存在，這使得它們成為用于免疫治療的優(yōu)選CD8+T細(xì)胞亞群(33，34)。其它小組提出，CD8+N T細(xì)胞也可能具有用于T細(xì)胞治療的良好特質(zhì)(35，36)。因此，我們從分選純化的N和CM T細(xì)胞制備⑶8+CAR CTL,以確定⑶8+和⑶4+CAR T細(xì)胞亞群的最佳組合。在慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和用tEGFR標(biāo)志物富集CAR-轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞后，我們證實(shí)了 CD8+N和CM CAR CTL的腫瘤反應(yīng)性(數(shù)據(jù)未示出)，并和之前一樣與CD4+CAR T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。如所預(yù)期的，相比與⑶4+CM或EMCAR T細(xì)胞的共培養(yǎng)，或單獨(dú)的⑶8+CAR CTL,⑶8+N和CM CAR CTL與CD4+N CAR T細(xì)胞的共培養(yǎng)導(dǎo)致CD8+亞群顯著升高的腫瘤特異性增殖(圖9)。在所有組合中，⑶4+N CAR T細(xì)胞與⑶8+CM CAR CTL共培養(yǎng)后，觀察到響應(yīng)RORl-陽性腫瘤細(xì)胞的刺激所產(chǎn)生的最大⑶8+CARCTL增殖(圖9)?？傊?，我們的數(shù)據(jù)表明，N、CM和EM⑶4+T細(xì)胞在細(xì)胞因子譜和增殖潛力方面存在內(nèi)在差異，CD4+N T細(xì)胞產(chǎn)生更高的IL-2并具備更優(yōu)的增殖。我們的數(shù)據(jù)顯示，分選純化的N而非CM、EM或大型CD4+T細(xì)胞可能最適合于增強(qiáng)⑶8+CTL的效應(yīng)功能，補(bǔ)充了此前在⑶8+T細(xì)胞中的工作，即源自CM的⑶8+T細(xì)胞具有用于過繼性免疫治療的良好特性。
[0189]討論
`[0190]總之，這些數(shù)據(jù)表明，RORl-CAR修飾的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移在侵襲性全身性淋巴瘤體內(nèi)模型中賦予了有效的抗-腫瘤反應(yīng)，提供了⑶4+CAR T細(xì)胞對于⑶8+CAR CTL抗腫瘤功效的有益和協(xié)同作用的證據(jù)。我們的數(shù)據(jù)說明，通過細(xì)胞內(nèi)在特性分析如何能夠得知對包含腫瘤特異性CD8+和CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)物合理設(shè)計，從而提高癌癥免疫治療的效果。
[0191]實(shí)施例5-全身性套細(xì)胞淋巴瘤(NSG/Jeko-1-ffLuc)的小鼠腫瘤模型
[0192]我們在侵襲性全身性套細(xì)胞淋巴瘤的體內(nèi)模型中檢測了對RORl-CAR修飾的⑶8+CTL抗腫瘤功效提供⑶4輔助的效果。
[0193]材料和方法
[0194]將已經(jīng)用螢火蟲突光素酶(Jeko-1/ffLuc)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的5xl05Jeko_l細(xì)胞,通過尾靜脈移植到亞致死量輻照的NOD/SCID/Y-A(NSG)小鼠，以便用生物發(fā)光成像來評估腫瘤負(fù)荷和分布。我們確認(rèn)了在這些條件下NSG小鼠中的一致移植物(接受率(take rate) =100%)和快速進(jìn)展的散播性淋巴瘤的發(fā)展。在腫瘤移植后，3只小鼠的小組通過尾靜脈注射接受⑶8+CARCTL(組I)、⑶4+CAR T細(xì)胞(組2)、⑶8+和⑶4+R0R1-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的組合(組3)、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照T細(xì)胞(組4、5、6)或非處理組(組7)。所有情況下，轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞總數(shù)為ΙΟχΙΟ6。過繼轉(zhuǎn)移后2天，我們獲得小鼠的眼部血，并確認(rèn)在外周血中存在RORl-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的或未轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞。
[0195]結(jié)果
[0196]T-細(xì)胞轉(zhuǎn)移后第6天，我們進(jìn)行生物發(fā)光成像以評估腫瘤負(fù)荷。在接受⑶8+和⑶4+R0R1-CAR T細(xì)胞的組合的小鼠中觀察到最強(qiáng)的抗-腫瘤效果，相比對照組其生物發(fā)光信號具有>21og的減少(圖10)。我們還在接受⑶8+或⑶4+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞的小鼠中觀察到強(qiáng)的抗-腫瘤效果，相比對照組其生物發(fā)光信號具有>llog的減少(圖10)。重要的是，施用⑶8+/⑶4+CAR T細(xì)胞組合后的腫瘤負(fù)荷減少，大于施用⑶8+CARCTL和⑶4+CART細(xì)胞的腫瘤負(fù)荷減少總和，這表明⑶4+CAR T細(xì)胞和⑶8+CAR CTL產(chǎn)生了協(xié)同作用。
[0197]討論
[0198]總之，這些數(shù)據(jù)表明，RORl-CAR修飾的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞的過繼轉(zhuǎn)移在侵襲性全身性淋巴瘤體內(nèi)模型中賦予了有效的抗-腫瘤反應(yīng)，并提供了 CD4+CAR T細(xì)胞對于CD8+CARCTL抗腫瘤功效具有有益和協(xié)同作用的證據(jù)。我們的數(shù)據(jù)說明，通過細(xì)胞內(nèi)在特性分析如何能夠得知對包含腫瘤特異性CD8+和CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)物合理設(shè)計，從而提高癌癥免疫治療的效果。
[0199]實(shí)施例6-⑶19CAR T細(xì)胞表現(xiàn)出同樣的協(xié)同作用
[0200]在侵襲性全身性套細(xì)胞淋巴瘤的體外和體內(nèi)模型中的共培養(yǎng)物中，我們檢測了提供⑶4對⑶19修飾的⑶8+CTL抗腫瘤功效的助益的效果。
[0201]材料和方法
[0202]⑶19CAR T細(xì)胞的制備可如US2008/0131415所描述，其通過引用并入本文中。
[0203]共培養(yǎng)檢測
[0204]用CFSE標(biāo)記⑶19-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶4+T細(xì)胞和⑶19-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的⑶8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，并以2:1、1:1和1:2的比例共培養(yǎng)。然后用K562/R0R1細(xì)胞和對照K562細(xì)胞刺激所述共培養(yǎng)物，孵育5天后通過CFSE染料稀釋測定法來測量細(xì)胞增殖。對于流式分析，用偶聯(lián)的抗-⑶8和抗-⑶4mAb染色樣品，以區(qū)分⑶8+和⑶4+亞群。
[0205]體內(nèi)模型
[0206]將已經(jīng)用螢火蟲突光素酶(Jeko-1/ffLuc)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的5xl05Jeko_l細(xì)胞,通過尾靜脈移植到亞致死量輻照的N0D/SCID/y + (NSG)小鼠，以便用生物發(fā)光成像來評估腫瘤負(fù)荷和分布。我們確認(rèn)了在這些條件下NSG小鼠中的一致移植物(接受率=100%)和快速侵襲的散播性淋巴瘤的發(fā)展。在腫瘤移植后，3只小鼠的小組通過尾靜脈注射接受CD8+CD19CARCTL (組 I)、CD4+CD19CAR T 細(xì)胞(組 2)、CD8+ 和 CD4+CD19CAR 轉(zhuǎn)導(dǎo)的 T 細(xì)胞的組合(組3)、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照T細(xì)胞(組4、5、6)或非處理組(組7)。所有情況下，轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞總數(shù)為ΙΟχΙΟ6。過繼轉(zhuǎn)移后2天，我們獲得小鼠的眼部血。
[0207]結(jié)果
[0208]圖10顯示了，在用⑶19+套細(xì)胞淋巴瘤腫瘤系Jeko-1刺激的⑶8+⑶19-CAR CTL和⑶4+⑶19-CAR T-細(xì)胞系共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，源自初始亞群的⑶4+CAR T-細(xì)胞系在增強(qiáng)中心記憶-衍生的⑶8+CAR CTL的腫瘤特異性增殖方面的優(yōu)異能力。盡管源自中心或效應(yīng)記憶細(xì)胞亞群的⑶4+CAR T-細(xì)胞系增強(qiáng)中心記憶-衍生的⑶8+CAR CTL的腫瘤特異性增殖的
程度小得多。[0209]圖11顯示了，⑶8+CAR T細(xì)胞和⑶4+CAR T細(xì)胞在免疫缺陷型小鼠(N0D/SCID-Raji)的淋巴瘤模型中獨(dú)立地賦予了直接的抗腫瘤功效。小鼠接受⑶19-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的或?qū)φ漳M轉(zhuǎn)導(dǎo)的(mock-transduced)⑶8+中心記憶-衍生的(A),或者⑶19-CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的或?qū)φ漳M轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+初始-衍生的T細(xì)胞(B)。[0210]圖12顯示了，在全身性套細(xì)胞淋巴瘤(NSG/Jeko-1-ffLuc)的小鼠腫瘤模型中，⑶4+R0R1-CAR修飾的T細(xì)胞對⑶8+R0R1-CAR CTL的抗腫瘤功效的增強(qiáng)和協(xié)同作用。在全身侵襲性套細(xì)胞淋巴瘤(NSG/Jeko-1)的小鼠腫瘤模型中，相比單獨(dú)的細(xì)胞群或相比未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，RORl-CAR修飾的⑶8+和⑶4+T細(xì)胞的抗腫瘤功效得到增強(qiáng)。
[0211]圖13顯示了，在全身性淋巴瘤(NSG/Raji)的小鼠模型中，CD8+和CD4+CD19-CART細(xì)胞的協(xié)同作用。在腫瘤接種后(處理前)第6天通過生物發(fā)光成像證實(shí)了 Raji腫瘤的移植(處理方案如圖A中所示，通過生物發(fā)光的腫瘤如圖B所示)。在用⑶8+⑶19-CAR T細(xì)胞處理的同批次小鼠，以及在用組合的⑶8+和⑶4+⑶19-CAR T-細(xì)胞產(chǎn)物(處理后中間的黑色和灰色條)圖B)處理的小鼠中，使用生物發(fā)光成像分析腫瘤負(fù)荷顯示，完全根除了所述Raji腫瘤。然后將所述小鼠第二次接種Raji腫瘤細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)(challenge)，并分析外周血中的⑶4+和⑶8+CAR T細(xì)胞頻數(shù)和腫瘤移植。在用組合的⑶8+和⑶4+CAR T-細(xì)胞產(chǎn)物處理的小鼠中，腫瘤激發(fā)后有顯著升高水平的CD8+CART細(xì)胞(圖C的下部圖面)，且完全排斥Raji接種物(腫瘤激發(fā)后，右邊的灰色條，圖B)。相反，在接受單獨(dú)的⑶8+⑶19-CARCTL的小鼠中，我們未檢測到腫瘤激發(fā)后的CAR T細(xì)胞增加(圖C)，并且Raji腫瘤細(xì)胞能夠進(jìn)行移植(腫瘤激發(fā)后，右邊黑色條，圖面B)。
[0212]討論
[0213]總之，這些數(shù)據(jù)表明，用另外的CAR構(gòu)建體，⑶19轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞、⑶19-CAR修飾的⑶4+和CD8+T細(xì)胞在侵襲性全身性淋巴瘤體內(nèi)模型中賦予了有效的抗-腫瘤反應(yīng)，并提供了⑶4+CAR T細(xì)胞對于⑶8+CARCTL抗腫瘤功效的有益和協(xié)同作用的證據(jù)。
[0214]前文對本發(fā)明進(jìn)行了說明，但不應(yīng)解釋為對本發(fā)明的限制。本發(fā)明由所附權(quán)利要求書以及包括于其中的權(quán)利要求的等同物進(jìn)行限定。本文引用的所有參考文獻(xiàn)和文件均通過引用并入本文中。
[0215]參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1.過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，包含: a)抗原反應(yīng)性嵌合抗原受體修飾的CD4+輔助性T細(xì)胞，其引發(fā)直接的腫瘤識別并增強(qiáng)CD8+對病原體的免疫應(yīng)答，其中所述輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域；以及 b)生理學(xué)上可接受的賦形劑。
2.如權(quán)利要求1所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物,還包含: c)遺傳修飾的CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑，其包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
3.如權(quán)利要求1所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物,還包含: c)引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的抗原特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑，其包含源自患者的⑶8+T細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述抗原反應(yīng)性嵌合抗原受體修飾的⑶4+輔助性T細(xì)胞源自⑶45R0陰性、⑶62L陽性⑶4陽性T細(xì)胞。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞選自初始⑶4+T細(xì)胞、中心記憶性⑶4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性⑶4+T細(xì)胞或大型⑶4+T細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述CD4+輔助性淋巴細(xì)胞為初始CD4+T細(xì)胞，其中所述初始C`D4+T細(xì)胞包括CD45R0-、CD45RA+、CD62L+CD4+T細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞選自初始⑶8+T細(xì)胞、中心記憶性⑶8+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性⑶8+T細(xì)胞或大型⑶8+T細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞為中心記憶性T細(xì)胞，其中所述中心記憶性T細(xì)胞包括⑶45R0+、⑶62L+、⑶8+T細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞為中心記憶性T細(xì)胞，且所述⑶4+輔助性T淋巴細(xì)胞為初始⑶4+T細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述疾病或病癥為實(shí)體瘤、惡性血液病、黑素瘤或病毒感染。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述疾病或病癥相關(guān)抗原為腫瘤相關(guān)的細(xì)胞表面抗原。
12.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述疾病或病癥相關(guān)的抗原選自酪氨酸激酶孤兒受體ROR1、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、間皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述嵌合抗原受體包括單鏈抗體衍生的嵌合抗原受體。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述嵌合抗原受體的T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊包含跨膜域、CD28信號傳導(dǎo)域和CD3胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域或T細(xì)胞共刺激分子的其它域。
15.如權(quán)利要求14所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域包含連接至⑶3胞內(nèi)域的⑶28跨膜和信號傳導(dǎo)域。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域與所述CD4+輔助性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域相同。
17.如權(quán)利要求1-15中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域與所述CD4+輔助性T細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域不同。
18.如權(quán)利要求2-17中任一項所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中所述CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞都用特異地結(jié)合至病原體特異性細(xì)胞表面抗原的抗體重鏈域進(jìn)行了遺傳修飾。
19.如權(quán)利要求18所述的過繼性細(xì)胞免疫治療組合物，其中與所述疾病或病癥相關(guān)的病原體特異性細(xì)胞表面抗原選自HIV抗原、HCV抗原、HBV抗原、CMV抗原和寄生蟲抗原。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項所述的過繼性免疫治療組合物在治療癌癥中的用途。
21.如權(quán)利要求20所述的用途，其中所述癌癥選自實(shí)體瘤、惡性血液病或黑素瘤。
22.如權(quán)利要求1-19中任一項所述的過繼性免疫治療組合物在治療傳染性疾病中的用途。
23.如權(quán)利要求22所述的過繼性免疫治療組合物的用途，其中所述傳染性疾病為病毒感染。
24.如權(quán)利要求23所述的過繼性免疫治療組合物的用途，其中所述病毒感染選自皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄酶病毒和黃病毒的感染。
25.如權(quán)利要求24所述的過繼性免疫治療組合物的用途，其中所述病毒感染為肝炎病毒感染。
26.制備權(quán)利要求1-19中任一項所述的過繼性免疫治療組合物的方法，其包括獲得引發(fā)Thl細(xì)胞因子應(yīng)答的修飾的初始CD4+T輔助細(xì)胞，其中所述修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4陽性細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，還包括獲得引發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的嵌合抗原受體修飾的腫瘤特異性CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑和抗原反應(yīng)性嵌合抗原受體，其中所述修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+細(xì)胞,所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊。
28.在患有疾病或病癥的個體中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法,其包括:施用權(quán)利要求1-19中任一項所述的組合物。
29.在患有疾病或病癥的個體中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法,其包括:分析所述個體的生物樣本的所述疾病或病癥相關(guān)抗原的存在，以及施用權(quán)利要求1-19中任一項所述的組合物，其中所述嵌合抗原受體特異地結(jié)合至所述抗原。
30.在患有疾病或病癥的個體中進(jìn)行細(xì)胞免疫治療的方法,其包括: 將遺傳修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑施用于所述個體，其中所述修飾的輔助性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD4+T細(xì)胞,所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，還包括將遺傳修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑施用于所述個體，其中所述修飾的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞制劑包含具有嵌合抗原受體的CD8+T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體包含對所述疾病或病癥相關(guān)抗原特異的胞外抗體可變域和T細(xì)胞受體的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)模塊。
32.如權(quán)利要求26-31中任一項所述的方法，其中所述疾病或病癥相關(guān)抗原為腫瘤相關(guān)的細(xì)胞表面抗原。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述疾病或病癥相關(guān)的抗原選自酪氨酸激酶孤兒受體 R0R1、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19 和 CD20。
34.如權(quán)利要求26-31中任一項所述的方法，其中所述疾病或病癥相關(guān)的抗原為來自HIV, HCV、HBV、CMV和寄生蟲抗原的病原體特異性細(xì)胞表面抗原。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述⑶8+T細(xì)胞和⑶4+T細(xì)胞都用特異地結(jié)合至病原體特異的細(xì)胞表面抗原的抗體重鏈域進(jìn)行了遺傳修飾。
36.如權(quán)利要求26-35中任一項所述的方法,其中具有Thl表型的所述嵌合抗原受體修飾的CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞制劑在腫瘤細(xì)胞存在下引發(fā)增強(qiáng)的增殖應(yīng)答、傳達(dá)持久性或增強(qiáng)抗腫瘤反應(yīng)性應(yīng)答。
37.如權(quán)利要求26-36中任一項所述的方法，其中所述CD4+輔助性T淋巴細(xì)胞選自初始⑶4+T細(xì)胞、中心記憶性⑶4+T細(xì)胞、效應(yīng)記憶性⑶4+T細(xì)胞或大型⑶4+T細(xì)胞。
38.如權(quán)利要求37所述的方`法，其中所述⑶4+輔助性T淋巴細(xì)胞為初始⑶4+T細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/0783GK103502438SQ201280019825
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月23日
【發(fā)明者】斯坦利·R·利戴爾, 邁克爾·胡德賽克 申請人:弗雷德哈欽森癌癥研究中心