合成的植酸酶變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及合成的植酸酶，其具有增加的熱穩(wěn)定性、在pH2對酸增加的穩(wěn)定性、對胃蛋白酶增加的穩(wěn)定性，并且具有加寬的活性pH范圍，涉及編碼合成的植酸酶的分離的核苷酸序列，涉及植酸酶在動物飼料中的用途，用于降低糞便中的磷酸鹽含量，并且涉及包含合成的植酸酶的動物飼料添加劑和動物飼料。
【專利說明】合成的植酸酶變體
[0001]本發(fā)明涉及植酸酶，涉及編碼植酸酶的氨基酸序列和編碼植酸酶的核苷酸序列，并涉及制備的方法以及植酸酶的用途和包含這些植酸酶的動物飼料。
[0002]磷是活生物生長的必需元素。在動物生產(chǎn)中，通常必須用無機(jī)磷補(bǔ)充飼料，以實(shí)現(xiàn)良好的生長速率。在谷物和豆類中，磷主要以植酸鹽的形式儲存。然而，單胃動物如豬、家禽和魚不能直接吸收植酸鹽或植酸而導(dǎo)致植酸鹽的排泄，這意味著在家畜集中生產(chǎn)的區(qū)域中磷是超載的。此外，與金屬如鈣、銅或鋅結(jié)合的植酸是作為對單胃動物的代謝起負(fù)作用的物質(zhì)。為了補(bǔ)償這些動物的磷酸鹽的缺乏，以及確保充分地生長和足夠的健康，將無機(jī)磷酸鹽加入到動物飼料中。無機(jī)磷酸鹽的這種添加是昂貴的，并且導(dǎo)致了對環(huán)境的其他不利影響。通過在動物飼料中使用植酸酶，水解了植酸鹽并且導(dǎo)致了糞便(slurry)中較低含量的磷酸肌醇和無機(jī)磷酸鹽。將植酸酶添加到動物飼料中改進(jìn)了有機(jī)磷的可用性，并降低了排泄的與植酸鹽結(jié)合的磷酸鹽對環(huán)境的不利影響。文獻(xiàn)描述了真菌和細(xì)菌來源的多種天然植酸酶。
[0003]植酸酶也稱為肌醇六磷酸鹽磷酸水解酶，其是能從植酸鹽切割至少一個(gè)磷酸殘基的一類磷酸酶。
[0004]EP420358 一般性地描述了微生物植酸酶的克隆和表達(dá)、W02006/38062描述了將來源于弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)的微生物植酸酶作為添加劑加入到動物飼料中，并且W02007/112739描述了基于來自布氏檸檬酸桿菌(Citrobacter braakii)的天然植酸酶的植酸酶及其制備方法和在動物飼料中的用途。
[0005]Haefner 等人(Haefner S., Knietsch A., Scholten E., Braun J., LohscheidtM.和 Zelder 0.(2005) Biotechnological production and application of phytases。Appl Microbiol Biotechnol68:588-597)描述了植酸酶在人類或動物營養(yǎng)領(lǐng)域中的多種已知用途。植酸酶的其他用途例如，在生物乙醇的產(chǎn)生中水解生物質(zhì)或淀粉的用途描述于W02008/097620 中。
[0006]W02008/116878 和 W02010/034835 描述了來自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的植酸酶，其蛋白質(zhì)序列及其變體。Zinin等人(FEMS Microbiology Letters (2004)236:283-290)公開了來自變形肥桿菌(Obesumbacterium proteus)的植酸酶，其序列以檢索號Q6U677存儲于UNIPR0T數(shù)據(jù)庫中。專利申請W02006/043178、W02008/097619和TO2008/092901描述了來自多種布丘氏菌屬(Buttiauxella sp)的植酸酶。目前，具有最高特異性活性的天然植酸酶包括來自中間耶爾森氏菌(Yersinia intermedia)(W02007/128160)和鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis) (W002/048332)的天然植酸酶。
[0007]然而，這些目前可用的植酸酶全部都未表現(xiàn)出用于制備動物飼料添加劑所需的那些性質(zhì)。目前可用的植酸酶在不會相當(dāng)大地喪失其活性的情況下，缺少用于制備動物飼料顆粒的足夠熱穩(wěn)定性。在動物飼料顆粒的制備中，在高溫和高濕度下將植酸酶與其他常規(guī)動物飼料組分一起壓縮，以作為一個(gè)實(shí)體喂飼給家畜。在制備期間，只有在80°C以上的溫度才能實(shí)現(xiàn)沙門氏菌屬(salmonella sp.)的有效破壞和淀粉的糊化(Amerah等人WorldsPoulty Science Journal (2011) 67:29-45)。在熱和潮濕條件下的這種壓縮導(dǎo)致植酸酶活性相當(dāng)大地喪失。防止活性喪失的一種可能是費(fèi)勁的植酸酶顆粒的涂層，以保護(hù)它們免于加熱的影響。用于涂層的脂肪或聚合物導(dǎo)致了植酸酶涂層的添加造成了相當(dāng)大的其他花費(fèi)。市售植酸酶的劑量通?；赑H5.5的活性測定(DIN IS030024:2009)而確定，并且并沒有對其進(jìn)行修改，以匹配各個(gè)消化道中的pH。在非5.5的pH值時(shí)活性的變化導(dǎo)致了相當(dāng)多的錯(cuò)誤劑量。
[0008]因此，本發(fā)明的目的是提供具有足夠熱穩(wěn)定性的植酸酶，以使在沒有其他保護(hù)措施如涂層的情況下和在盡可能少的活性喪失的情況下所述植酸酶可以用于制備無沙門氏菌的飼料顆粒。本發(fā)明的其他目的是提供可以在寬PH范圍(同時(shí)酶活性盡可能小的降低)使用的植酸酶，以使甚至在由于改變飼料組分，導(dǎo)致PH范圍波動的時(shí)候，所述植酸酶可以應(yīng)用于不同動物物種的消化道的多種PH范圍，并且確保消化道中足夠的酶活性。
[0009]通過合成的植酸酶實(shí)現(xiàn)所述目的，所述植酸酶具有的氨基酸序列與SEQ ID24的氨基酸序列具有至少90%的同一性。
[0010]根據(jù)本發(fā)明合成的植酸酶優(yōu)選地具有氨基酸序列，其與SEQ ID24的氨基酸序列具有至少94%，特別優(yōu)選地95%以及優(yōu)選地96%、97%、98%或99%的同一性。
[0011]根據(jù)本發(fā)明的植酸酶具有至少80°C的熱穩(wěn)定性，因此適合用于飼料顆粒的制備，且在顆?；陂g，不會由于熱和潮濕的條件導(dǎo)致相當(dāng)大的活性喪失。
[0012]此外，所述植酸酶具有3個(gè)pH單位以上的寬的pH范圍，在該pH范圍內(nèi)，它們保留了在PH5.5測定的活性的至少50%，因此，當(dāng)基于5.5的活性測定劑量時(shí)，可以在具有不同消化PH的多種動物中使用所述植酸酶并且將其與不同的飼料組分一起使用，而不會有導(dǎo)致活性喪失的過度低劑量，從而增加了通過動物排泄的磷酸鹽。
[0013]此外，根據(jù)本發(fā)明的植酸酶令人驚奇地具有增加的蛋白水解穩(wěn)定性，因此，它們可以在活性基本上不損失的情況下穿過胃，并在腸中的實(shí)際作用位點(diǎn)仍保留活性。此外，根據(jù)本發(fā)明的植酸酶在PH2具有至少85%的穩(wěn)定性，因此確保在在強(qiáng)酸性范圍中仍然保留活性。
[0014]兩個(gè)蛋白質(zhì)序列或核酸序列之間的同一性定義為通過在2011年4月可得到的版本中的程序needle計(jì)算的同一性。Needle是可免費(fèi)得到的程序包EMBOSS的一部分，其可以從網(wǎng)址http://emboss, sourceforge.net/下載。使用的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)為:空位開放10.0 (“空位開放罰分”)，空位延伸0.5 (“空位延伸罰分”)，就蛋白質(zhì)而言，使用數(shù)據(jù)文件EBL0SUM62(矩陣)，而就DNA而言，使用數(shù)據(jù)文件EDNAFULL (矩陣)。
[0015]在特別的實(shí)施方案中，本發(fā)明不包括具有以下氨基酸序列的植酸酶:SEQ ID18及其突變體 A-4 ；A-10 ；A-66 ;A_73 ;C_7 ;C_40 ;X_1 ;X_2 ;A_164 ;B_16 ;B_378 ；C~79 ;A_11 ；X-6 ；B-320 ；A-508 ;A_8 ；A~20 ;A_507 ;A_8 ；A~20 ;A_507 ;X_3 ;A_505 ;A_501 ;A_407 ;A_502 ；X-4 ；A-408 ；A-415 ;A_501 ;A_409 ;A_503 ;A_406 ;A_510 ;A_515 ;D_5 ;D_34 ;F_161 ;A_504 ；D-192 ；A-511 ；A-514 ;A_516 ;F_41 ;D_207 ;D_268 ;F_150 ;I_117;A_509 ；H-107 ;H_159 ；H-456 ；A-512 ;H_464 ;A_513 ;A_518 ;A_521 ;A_534 和 A-519 (如在表 6 中所定義)。
[0016]在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含根據(jù)本發(fā)明所述的植酸酶，以及具有由SEQID18的氨基酸序列組成的植酸酶，并且不包括表6中所述的突變體。
[0017]表6:氨基酸序列SEQ ID18的突變體
[0018]
【權(quán)利要求】
1.植酸酶，其具有的氨基酸序列與SEQID24的氨基酸序列具有至少90%的同一性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的植酸酶，基于根據(jù)SEQID24的位置，所述植酸酶具有在選自以下位置的至少一個(gè)的氨基酸修飾，所述位置選自位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、16、33、37、67、71、75、76、77、78、92、109、118、119、120、121、123、136、141、144、152、155、156、159、164、166、193、200、217、258、260、261、268、270、276、300、322、345、346、371、374、398 和 406。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的植酸酶，其具有5個(gè)，優(yōu)選地6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)修飾。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的植酸酶，相對于SEQID24的氨基酸序列，所述植酸酶具有選自以下的至少一個(gè)修飾，所述修飾選自S1- ；D2-,E ；T3Q, A4G,E ；P5A ；A6S, D ；G7K ；F8Y, M ；Q9K ；K12R ；L16V ；N33D, M ；H37Y ；R67L ；Q71E ；P75N ；K76N, I ；D77T ；N78T ；D92A, E, N, T, V ；Q109N, E；Q118S；N119A, T；I120L ；Q121T ；A123V ；S136K ；Q141K ；A144E ；T152G,A ；E155N ；T156G ；Q159N ；S164E ；A166E, H ；Q193L ；A200N ；S217G ；D258N ；M260I ；S261H ；K268N ；N270Q ；Q276N ；I300L ；T322Q ；D345G ；N346G ；L371A ；H374N ；D398E 和 Q406K。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的植酸酶，其具有5個(gè)，優(yōu)選地6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)修飾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的植酸酶，其具有選自以下的累積修飾的至少一個(gè)，所述累積修飾選自:
(PhV-00I)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T A123V T152G S164E A200ND258N S261H N270Q H374N D398E
(PhV-002)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92A Q121T A123V T152G S164E A200ND258N S261H N270Q H374N D398E
(PhV-003)D2E A4E A6S F8Y N33M R67L K76N N78T D92A Q121T A123V T152G S164EA200N D258N M260I S261H N270Q H374N D398E
(PhV-004)D2E A4E A6S F8Y N33M R67L K76N N78T D92N Q109N Q121T A123V A144ET152G Q159N S164E A200N S217G D258N M260I S261H N270Q H374N D398E
(PhV-020) S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121TT152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
(PhV-031)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T S164E A200N D258N S261HN270Q H374N
(PhV-048) S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76I N78T D92N Q121TT152G S164E A200N D258N S261H N270Q H374N
(PhV-053) S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q121TA123V T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L H374N
(PhV-055)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258NS261H N270Q Q276N H374N
(PhV-058)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258NS261H N270Q H374N
(PhV-059)D2E A4E A6S F8Y N33M K76N N78T D92N Q121T T152G S164E A200N D258NS261H N270Q H374N D398E
(PhV-060) S1-D2-T3Q A4G P5A A6D G7K F8M Q9K K12R N33M K76N N78T D92N Q109NQ121T T152G S164E A200N D258N S261H N270Q I300L N346G H374N
7.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的植酸酶,與根據(jù)權(quán)利要求5-6任一項(xiàng)的植酸酶之一相t匕，所述植酸酶在至少一個(gè)位置具有至少一個(gè)保守氨基酸交換。
8.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的植酸酶，其是分離的植酸酶。
9.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的植酸酶，與來自莫氏耶爾森氏菌和哈夫尼菌屬的兩種野生型植酸酶相比，所述植酸酶具有增加的對胃蛋白酶的穩(wěn)定性、增加的熱穩(wěn)定性和/或增加的特異性活性。
10.根據(jù)前面權(quán)利要求任一項(xiàng)的植酸酶，其中相對于SEQID24，所述植酸酶在位置R18、H19、G20、R22、P24、H306 和 D307 是未經(jīng)修飾的。
11.編碼植酸酶的分離的核酸序列，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的植酸酶之一。
12.編碼植酸酶的分離的核酸序列，其在高度嚴(yán)格條件下與根據(jù)權(quán)利要求11的序列之一的互補(bǔ)鏈雜交。
13.重組表達(dá)載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求11或12的核酸序列。
14.重組宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求11或12的核酸序列或者根據(jù)權(quán)利要求13的載體。
15.重組生產(chǎn)生物，其包含根據(jù)權(quán)利要求11或12的核酸序列或者根據(jù)權(quán)利要求13的載體。
16.動物飼料添加劑，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的植酸酶中的至少一種和其他飼料添加劑。
17.動物飼料，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的植酸酶中的至少一種。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的植酸酶或者根據(jù)權(quán)利要求16的動物飼料添加劑在動物飼料中的用途。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的植酸酶或者根據(jù)權(quán)利要求16的動物飼料添加劑或者根據(jù)權(quán)利要求17的動物飼料的用途，用于降低家畜糞便中的磷酸鹽含量。
【文檔編號】C12N9/16GK103687944SQ201280019478
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月21日
【發(fā)明者】S·哈夫納, A·威爾澤爾, R·圖默 申請人:巴斯夫歐洲公司