一種改良藻類性狀的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種改良藻類性狀的方法，首次揭示一種以提高藻類光能利用效率為目的的改良藻類的新方法，所述方法通過在藻類中表達(dá)光能吸收和傳遞蛋白(Light?EnergyAbsorption?and?Transduction?protein，LEAT蛋白)，拓展對太陽光能利用的光譜范圍，提高藻類光利用效率。
【專利說明】一種改良藻類性狀 的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體地，本發(fā)明涉及一種改良藻類性狀的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]光合作用是地球上最重要的化學(xué)反應(yīng)，光合生物通過光合作用將光轉(zhuǎn)化為可為人類直接利用的穩(wěn)定的化學(xué)能形式，并提供了人類生存所需的氧氣和食物。在當(dāng)今全球人口增加、糧食危機(jī)、能源危機(jī)的背景下，發(fā)現(xiàn)提高光合生物的光利用效率的新途徑具有重要的意義。
[0003]多年來，人們嘗試各種手段提高光合生物光合作用效率，主要的策略包括降低光呼吸損失，增加Rubisco羧化與氧化反應(yīng)比值，改造C3植物成為C4植物等等。這些策略都是集中于改良影響光合效率的某個方面。目前尚無一種途徑被完全證實(shí)可以有效提高光能利用效率。鑒于光合機(jī)構(gòu)運(yùn)轉(zhuǎn)模式在各種植物間非常保守，一旦一種提高光能利用效率的途徑得到充分驗(yàn)證，其有巨大潛力可以在不同光合生物中得到應(yīng)用。
[0004]微藻類能夠利用太陽能將水和二氧化碳轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)能，許多微藻富含油脂，并且可以通過目前現(xiàn)有的技術(shù)轉(zhuǎn)化為生物柴油。某些微藻的含油量可超過其干重的80%，與微藻形成對照，油料作物如大豆和棕櫚等的產(chǎn)油率在5%以下，此外，食用油需要和石油混合才能作為生物柴油使用，所以不能完全代替石油。大約有300種藻類，被認(rèn)為是適合生物柴油生產(chǎn)，意味著油脂生產(chǎn)生物柴油的來源不必再靠陸地植物栽培。因此，微藻油將是一種完全可以替代石油的生物柴油，具有廣闊的應(yīng)用前景和具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益
[0005]然而，目前來自微藻的生物質(zhì)能遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)實(shí)能源的需求，主要問題是生物質(zhì)的生產(chǎn)效率仍然很低，原因是光合作用效率低。雖然在一般條件下陽光與光合作用所需要的原料水和二氧化碳并不缺乏，可是由于種種內(nèi)外原因，光合生物利用太陽能的效率很低，據(jù)估計(jì)溫帶地區(qū)光合生物光合作用的轉(zhuǎn)化率按全年平均計(jì)算約為太陽全部輻射能的0.5%-2.5%，整個生物圈的平均轉(zhuǎn)化率可達(dá)3%-5%。在提供理想的環(huán)境與條件下，光合作用的最高效率可達(dá)8~15%。因此，如何提高光能利用率是未來進(jìn)一步提高能源植物產(chǎn)量的重大突破口。
[0006]因此，本領(lǐng)域迫切需要研究和開發(fā)提高光合生物特別是藻類的光利用效率的新方法，以培育出光能利用效率高的光合生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種改良藻類性狀的方法。
[0008]在本發(fā)明的第一方面，提供一種改良藻類性狀的方法，包括以下步驟:1)將一種或多種編碼光能吸收和傳遞蛋白(LEAT蛋白)的多核苷酸轉(zhuǎn)化進(jìn)入藻類；2)從轉(zhuǎn)化后的藻類中選擇出相較對照藻類而言性狀獲得改良的藻類；上述光能吸收和傳遞蛋白是能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白。
[0009]在一個優(yōu)選例中，所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸選自下組:(a)編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；更佳地1-5個)氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸；或(b)編碼非熒光生色蛋白(non-fluorescent chromoprotein)或其經(jīng)一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；更佳地1-5個)氨基酸位點(diǎn)突變后但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；更佳地1-5個)氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組:
[0011](a)編碼SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；
[0012](b)編碼SEQ ID NO: 10所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；
[0013](c)編碼SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的蛋白(efasCFP)的多核苷酸；
[0014](d)編碼SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；
[0015](e)編碼SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；
[0016](f)編碼SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的蛋白(scubGFP)的多核苷酸；
[0017](g)編碼SEQ ID N O:44所示氨基酸序列的蛋白(rmueGFP)的多核苷酸；
[0018](h)編碼SEQ ID NO:52所示氨基酸序列的蛋白(cpGFP)的多核苷酸；
[0019](i)編碼SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的蛋白(YFP)的多核苷酸；
[0020](j)編碼SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu2)的多核苷酸；
[0021](k)編碼SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu4)的多核苷酸；
[0022](I)編碼SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的蛋白(YFPmu7)的多核苷酸；
[0023](m)編碼SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的蛋白(YFPl232h)的多核苷酸；
[0024](η)編碼SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的蛋白(YFPl232q)的多核苷酸；
[0025](ο)編碼SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的蛋白(phiYFP)的多核苷酸；
[0026](P)編碼SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白(mCherry)的多核苷酸；
[0027](q)編碼SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的蛋白(mCherrymu3)的多核苷酸；
[0028](r)編碼SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的蛋白(mCherrymu4)的多核苷酸；
[0029](s)編碼SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的蛋白(mCherrymu5)的多核苷酸；
[0030](t)編碼SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的蛋白(eqFP611)的多核苷酸；
[0031](u)編碼SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的蛋白(eforCP/RFP)的多核苷酸；
[0032](V)編碼SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的蛋白(rf1RFP)的多核苷酸；
[0033](w)編碼SEQ ID N0:46所示氨基酸序列的蛋白(ceriantRFP)的多核苷酸；
[0034](x)編碼SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的蛋白(hcriCP)的多核苷酸；
[0035](y)編碼SEQ ID N0:48所示氨基酸序列的蛋白(anm2CP)的多核苷酸；
[0036](z)編碼SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的蛋白(YFP1^1)的多核苷酸；
[0037](aa)編碼SEQ ID NO:58所示氨基酸序列的蛋白(GFP1.)的多核苷酸；
[0038](ab)編碼(a)至(aa)任一所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1_30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白的多核苷酸；
[0039](ac)編碼與(a)至(aa)任一氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70% (更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98% ;更佳地高于99%)，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白的多核苷酸；或
[0040](ad)與上述(a)-(ac)任一所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；更佳地1-5個)氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組:
[0042](a)如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0043](b)如SEQ ID N0:9所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0044](c)如SEQ ID NO:35所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0045](d)如SEQ ID NO:5所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0046](e)如SEQ ID NO:27所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0047](f)如SEQ ID NO:39所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0048](g)如SEQ ID NO:43所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0049](h)如SEQ ID NO:51所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0050](i)如SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0051](j)如SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0052](k)如SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0053](I)如SEQ ID NO: 15所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0054](m)如SEQ ID NO: 17所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0055](η)如SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0056](ο)如SEQ ID NO:49所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0057](P)如SEQ ID NO:1所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0058](q)如SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0059](r)如SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0060](s)如SEQ ID NO:25所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0061](t)如SEQ ID NO:29所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0062](u)如SEQ ID NO:33所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0063](V)如SEQ ID NO:41所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0064](w)如SEQ ID NO:45所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0065](χ)如SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的多核苷酸；
[0066](y)如SEQ ID N0:47所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0067](z)如SEQ ID NO:55所不核苷酸序列的多核苷酸；
[0068](aa)如SEQ ID NO:57所不核苷酸 序列的多核苷酸；或
[0069](ab)與(a)-(aa)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
[0070]在另一優(yōu)選例中，所述的編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；更佳地1-5個)氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選擇下組:
[0071](a) SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的蛋白(spisCP)；
[0072](b)將(a)所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-30個；較佳地1_20個；更佳地1-10個；更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白；
[0073](c)與(a)所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%(更佳地高于80% ;更佳地高于90% ;更佳地高于95% ;更佳地高于98% ;更佳地高于99%)，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白；或
[0074](d)與(a)-(c)任一所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
[0075]在另一優(yōu)選例中，所述的編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1-10個；更佳地1-5個)氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組:
[0076](a)如SEQ ID NO:37所示核苷酸序列的多核苷酸；或
[0077](b)與(a)所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。 [0078]在另一優(yōu)選例中，所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸還選自:編碼選自下列 GenBank 登錄號的蛋白的多核苷酸:AF168421、AY646070、AY646072、AY646071、AF168424、AF168420、AY182022、AY182023、DQ206381、DQ206392、DQ206382、AY181556、AY679113、EU498721、AY182017、AY646069、AY646066、AY151052、EU498722、AY647156、AY508123、AY508124、AY508125、AF435432、AY646067、AY485334、AY485335、AY646068、AF545827、AF545830、AY037776、AB180726、DQ206383、DQ206395、DQ206396、DQ206385、EU498723、AB193294、AY182020、AY182021、AB107915、DQ206389、P42212、AY268073、AY181553、AY181554、AY181555、DQ206393、AY155344、AY037766、AY679112、AF401282、EU498724、AY268076、AY268074、AY268075、AY268071、AY268072、DQ206391、AY015995、AY182014、AF372525、EU498725、DQ206390、AF168422、AY646073、AY296063、AF272711、AB128820、DQ206379、DQ206380、AF168419、AY059642、EF186664、AF420591、DQ206387、AY182019、AY765217、AB085641、AY181552、DQ206386、AY182013、AY646064、AY485333、AF168423、AY646077、AY646076、AY646075、EF587182、AF363775、AF383155、DQ206394、DQ206376、AF38315、AF363776、AY461714、AB209967、DQ206377、DQ206378 ;或上述蛋白經(jīng)一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白。
[0079]在另一優(yōu)選例中，所述將多核苷酸轉(zhuǎn)化入藻類方法包括:將含有編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)入藻類中，從而在藻類中表達(dá)上述多核苷酸。較佳地，所述的表達(dá)盒包括:至少一種(可以是一種或多種)編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸；所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸與表達(dá)調(diào)控元件可操作性相連。
[0080]在另一優(yōu)選例中，所述的光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸通過同源重組的方式轉(zhuǎn)化進(jìn)入藻類；更佳地，使得光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸整合到植物類囊體膜上。
[0081]在另一優(yōu)選例中，所述的改良藻類性狀選自下列一種或幾種:提高藻類的生物量；促進(jìn)藻類生長；提高藻類的光利用效率；增加藻類PSI或PSII的光化學(xué)效率；增加藻類光合電子傳遞效率；提高藻類對CO2的同化能力；提高藻類的凈光合效率；提高藻類的光合器官的光保護(hù)能力；提高藻類中光合輔助色素(包括類胡蘿卜素)的含量；或提高藻類的光合放氧速率。
[0082]在另一優(yōu)選例中，所述的藻類是真核藻類或原核藻類。
[0083]所述的藻類含有光合機(jī)構(gòu)或含有葉綠素。
[0084]在另一優(yōu)選例中，所述的藻類是微藻；更佳地，所述的微藻選自:藍(lán)藻門、綠藻門、金藻門、紅藻門、裸藻門、甲藻門、隱藻門、金黃藻門、褐藻門或輪藻門。
[0085]在本發(fā)明的另一方面，提供光能吸收和傳遞蛋白或編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸的用途，用于改良藻類性狀。
[0086]在一個優(yōu)選例中，所述的光能吸收和傳遞蛋白選自:熒光蛋白或非熒光生色蛋白。
[0087]在本發(fā)明的另一方面，提供一種改良的藻類，其基因組中包括光能吸收和傳遞蛋白的表達(dá)盒。較佳地，所述的改良的藻類是轉(zhuǎn)基因藻類，其通過前述任一種方法制備獲得。
[0088]在本發(fā)明的另一方面，提供一種藻類，所述藻類的細(xì)胞中含有外源的一種或多種編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸。
[0089]在另一優(yōu)選例中，所述的藻類為非植物的藻類。
[0090]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0091]圖1、光照對YFP還原NAD+或NADP+的影響。圖中所示為開光前后NADH和NADPH在340nm處吸收值的變化。
[0092]圖2、YFP，CFP，BFP和GFP光下催化2，3，5_三甲基-1, 4_對苯醌(TMBQ)的還原活力的比較。50mM的磷酸緩沖液(pH6.5)，了1^0，40(^11，熒光蛋白濃度為251^。還原速率在1-2μηιο1 IrTiV1各自激發(fā)光下測定。
[0093]圖3、TMBQ存在條件下YFP和GFP催化水裂解放氧的光強(qiáng)響應(yīng)曲線。TMBQ:2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌；反應(yīng)速率以每個蛋白分子每分鐘轉(zhuǎn)換的分子數(shù)表示。反應(yīng)體系為:50mM 的磷酸緩沖液(pH6.5)，YFP，10nM(終濃度，下同);GFP，I μ M ;TMBQ，400 μ M，;光強(qiáng):0.6-1 μ mo I m 2S、
[0094]圖4、TMBQ存在條件下mCherry和GFP光下催化水裂解放氧活力的光強(qiáng)響應(yīng)曲線。TMBQ:2，3，5-三甲基-1,4-對苯醌；反應(yīng)體系為:50mM的磷酸緩沖液(ρΗ6.5)，mCherry,10nM;GFP，lyM;TMBQ，400yM;光強(qiáng):0.6-1 μ mo I nT2s'
[0095]圖5、熒光蛋白GFP，YFP，CFP和BFP放氧活力的TMBQ濃度響應(yīng)曲線。50mM的磷酸緩沖液(pH6.5)，GFP，I μ M ;其他熒光蛋白，10nM，TMBQ，400 μ M ;光強(qiáng):0.6-1 μ mo I nT2s'
[0096]圖6、不同醌存在條件下YFP⑷和mCherry⑶的光下催化水裂解放氧活力的比較。BQ: 1,4-對苯醌;MBQ:甲基-1,4-對苯酉昆；DMBQ1:2，5-二甲基-1，4-對苯醌；DMBQ2:2，6-二甲基-1,4-對苯醌；TMBQ:2, 3，5-三甲基-1，4-對苯醌；DQ:杜醌或四甲基_1，4-對苯醌；UQ:2, 3-甲氧基-5-甲基-1，4-對苯醌。反應(yīng)體系為:50mM磷酸緩沖液，pH6.5 ；YFP,IOnM ；mCherry, 5nM ;光強(qiáng):0.6-1 μ mo I m 2s、
[0097]圖7、YFP(A, B)和mCherry (E，F(xiàn))及其突變體的吸收光譜，(B)為A圖中YFPmu4和YFPmu7部分的放大；(F)為E圖中mCherrymu4和mCherrymu7部分的放大。YFP(C)和mCherry (G)及其突變體的熒光光譜；YFP (D)和mCherry (H)與其突變體的在光下裂解水放氧活力。(A，B，C，E，F(xiàn)，G):光吸收和熒光強(qiáng)度在相同蛋白濃度下進(jìn)行比較，以突變前的YFP或mCherry的吸收峰值的強(qiáng)度為1，熒光發(fā)射峰值的強(qiáng)度為100。
[0098]圖8、GFP系列不同熒光蛋白序列比較。
[0099]圖9、(A)YFP蛋白232位氨基酸點(diǎn)突變及231位后末端去除的突變蛋白光下放氧活力的比較。(B)GFP蛋白與其231位后末端去除的點(diǎn)突變光下放氧活力的比較。YFP的L232H和GFP蛋白濃度為I μ M，其他蛋白濃度為10nM，TMBQ濃度為400 μ M，在1_2μπιο1HT2s-1激發(fā)光下測定。
[0100]圖10、(A)細(xì)胞色素f (Cytf)和質(zhì)藍(lán)色(PC)濃度依賴的、質(zhì)醌類似物2，3，5_三甲基(PQ)介導(dǎo)的YFP對Cytf和PC的光下還原。在沒有添加PQ的條件下，YFP在光下不能催化無論是細(xì)胞色素f還是質(zhì)藍(lán)素的還原；(B)YFP光下催化PQ介導(dǎo)的細(xì)胞色素f和質(zhì)藍(lán)素還原的光響應(yīng)曲線。
[0101]圖11、CFP、GFP、mCherry、YFP及YFP點(diǎn)突變體光下催化PQ介導(dǎo)的細(xì)胞色素f(A和B)和質(zhì)藍(lán)素(C和D)還原活性的比較。
[0102]圖12、110種刺胞動物(Cnidarian)和節(jié)足動物(Arthropoda)來源突光蛋白和非熒光生色蛋白進(jìn)化樹(摘自Alieva et al.，2008)。圖中黑點(diǎn)表示在本發(fā)明中所選用的熒光蛋白。這些熒光蛋白在進(jìn)化樹上分別屬于A，B, C，D等不同的分枝。
[0103]圖13、(A)本發(fā)明所用的所有LEAT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。(B)本發(fā)明所用的所有LEAT蛋白的序列同源性比較，其中I對應(yīng)eqFP611、2對應(yīng)hcriCP，依次類推。
[0104]圖14、(A)PsbC-熒光蛋白融合基因藍(lán)藻轉(zhuǎn)化質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。將YFP片段插入PsbC基因的C末端，構(gòu)建了用于轉(zhuǎn)化藍(lán)藻的PPsbC-YFP質(zhì)粒。箭頭所示為克隆是使用的酶切位點(diǎn)。Sp (Streptomycin)表示鏈霉素抗性標(biāo)記。(B)PsbC-YFP融合基因整合情況。利用自然轉(zhuǎn)化方法將PPsbC-YFP質(zhì)粒對藍(lán)藻細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后在含有相應(yīng)的抗生素的瓊脂平板上畫線，放在藍(lán)藻的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化的克隆后，進(jìn)行PCR鑒定，在含有100μ g/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行多于三代的培養(yǎng)，以便將野生型的背景清除，最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有20μ g/ml鏈霉素中培養(yǎng)。圖為PsbC-YFP轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的PCR鑒定。上方箭頭所示的2.7kb片段為插入的目的基因(psbC-YFP)加上抗性基因的片段，下方箭頭所示的1.0kb片段為PsbC基因。
[0105]圖15、轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻PsbC-YFP類囊體膜時間依賴的綠光誘導(dǎo)的遠(yuǎn)紅光關(guān)閉后的細(xì)胞色素f和質(zhì)藍(lán)素的氧化還原動力學(xué)變化。黑色線為野生型；紅色線為PsbC-YFP。(A)綠光誘導(dǎo)的遠(yuǎn)紅光關(guān)閉后的細(xì)胞色素f的氧化還原動力學(xué)變化(以554.5nm光吸收變化為指標(biāo))，即554.5nm光吸收增加表示細(xì)胞色素的還原；(B)綠光誘導(dǎo)的遠(yuǎn)紅光關(guān)閉后的質(zhì)藍(lán)素的氧化還原動力學(xué)變化(以598nm光吸收變化為指標(biāo))，598nm光吸收的減少為質(zhì)藍(lán)素的還原。由于原核光合生物藍(lán)藻的光合電子傳遞鏈和呼吸電子傳遞鏈共用質(zhì)醌，這兩條途徑是相互依存相互制約的關(guān)系。在 正常條件下，由于來自呼吸基質(zhì)的電子對質(zhì)醌庫的還原，細(xì)胞色素f和質(zhì)藍(lán)素等電子遞體處于還原狀態(tài)，必須使用遠(yuǎn)紅光激發(fā)光系統(tǒng)I將質(zhì)醌庫氧化，排空電子后，才能觀察到光誘導(dǎo)的電子遞體的氧化還原動力學(xué)的變化。與野生型相比，YFP的轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的細(xì)胞色素f呈現(xiàn)先被氧化后被還原的變化，而質(zhì)藍(lán)素則呈現(xiàn)先被還原后被氧化的變化，這是由于遠(yuǎn)紅光關(guān)閉后，積累在質(zhì)醌庫的電子繼續(xù)向這兩個電子遞體傳遞的結(jié)果，另外，質(zhì)藍(lán)素是移動的電子遞體，它氧化細(xì)胞色素f的反應(yīng)是迅速的，使得這兩個電子遞體呈現(xiàn)相反的氧化還原趨勢。這些氧化還原動力學(xué)的變化均被其激發(fā)光——520nm的綠光所促進(jìn)，說明了 YFP能夠光還原質(zhì)醌，進(jìn)而向細(xì)胞色素f和質(zhì)藍(lán)素等電子遞體提供電子。
[0106]圖16、綠光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻活體細(xì)胞的光合放氧。由于在原核光合生物藍(lán)藻中，光合電子傳遞鏈和呼吸電子傳遞鏈共用質(zhì)醌，它們是相互依存相互制約的關(guān)系。在暗中，來自呼吸底物NAD (P) H的電子經(jīng)由質(zhì)醌還原氧分子，表現(xiàn)出吸氧反應(yīng)，而在光下，積累在質(zhì)醌庫的電子就會傳遞給光系統(tǒng)I，引起光系統(tǒng)II的放氧反應(yīng)。在沒有添加抑制劑的條件下，野生型及轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻細(xì)胞PsbC-YFP都顯示暗中吸氧呼吸作用，當(dāng)給細(xì)胞照射520nm的綠光后，PsbC-YFP的吸氧被抑制，但野生型細(xì)胞的吸氧沒有受到影響；在呼吸電子傳遞鏈NDH的抑制劑氯化汞的存在下，呼吸作用的吸氧被抑制，PsbC-YFP表現(xiàn)出綠光誘導(dǎo)的放氧反應(yīng)，而野生型沒有綠光誘導(dǎo)的放氧活性。這進(jìn)一步證明了 YFP可以作為一種類似葉綠素a的天線色素和反應(yīng)中心色素，將其吸收的綠光能量轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，參與光合作用。
[0107]圖17、轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻的光合能力比較。(A)激發(fā)能分配即狀態(tài)轉(zhuǎn)換的變化程度；(B)光合蛋白含量變化的免疫印跡分析；(C)藍(lán)藻捕光天線色素蛋白藻藍(lán)素(phycoerythrin)和藻紅素(phycocyanin)的含量；⑶光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II的量子效率(OPSI，ΦΡΞ II)，以及質(zhì)醌庫的氧化還原狀態(tài)參數(shù)(1-1-qL) ; (E)NADPH的光合成速率；(F)光合磷酸化速率；(G)光合碳同化關(guān)鍵酶Rubisco的羧化活性。
[0108]圖18、藍(lán)藻生長光 質(zhì)。黑色線為熒光燈光譜，紅色線為白熾燈光譜。
[0109]圖19、(A)PsbC-YFP轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻在缺少藍(lán)綠光的熒光燈和富含綠光的白熾燈下的生長表型及生長速率比較。PsbC-YFP轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻在前兩種光質(zhì)下的生長都比野生型快，尤其是在白熾燈下比野生型的生長優(yōu)勢更明顯。(B)PsbC-YFP轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻與野生型凈光合放氧速率的比較。左圖為熒光燈下，右圖為白熾燈下。(C) PsbC-YFP轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻與野生型藍(lán)藻呼吸速率的比較。左圖為熒光燈下；右圖為白熾燈下。
【具體實(shí)施方式】
[0110]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，開發(fā)了一種以提高藻類的光能利用效率為目的的改良藻類的新方法，所述方法通過在藻類中類囊體膜系統(tǒng)II外周蛋白PsbC上融合表達(dá)了外源的光能吸收和傳遞蛋白(Light Energy Absorption and Transduction protein, LEAT 蛋白)，在光下催化水的裂解，同時將裂解長生的電子和質(zhì)子傳遞給與藻類類囊體膜上質(zhì)體醌(plastoquinone)等，并釋放氧氣，這一過程在光下為光合電子傳遞鏈額外提供持續(xù)的電子來源，改變了藻類體內(nèi)電子傳遞速率和氧還還原狀態(tài)，引起藻類體內(nèi)光合相關(guān)基因表達(dá)的改變，從而提高藻類光能利用效率。
[0111]術(shù)語
[0112]如本文所用，所述的“改良性狀”指改良的藻類的特性，包括但不僅限于:提高藻類的光吸收效率、促進(jìn)藻類生長、提高的CO2利用率、增強(qiáng)的光轉(zhuǎn)化效率、增強(qiáng)的光合同化效率、增強(qiáng)的光保護(hù)機(jī)制，增加生物量和/或產(chǎn)量等等特征。本發(fā)明的一個重要方面，改良性狀是促進(jìn)藻類生長或提高藻類生物量，包括在無環(huán)境脅迫壓力條件下的提高和在環(huán)境壓力條件下的提高。環(huán)境脅迫壓力條件可以包括，如日照不足、高光強(qiáng)、高紫外輻射條件、高溫、高生物密度?！爱a(chǎn)量”能被很多特征所影響，包括生物對光吸收效率、光轉(zhuǎn)化效率、光合碳同化效率，生物量的累積等特征的影響。
[0113]如本文所用，“藻類性狀的改良”、“改良的性狀” “改良的藻類性狀”、“性狀改良”、
“藻類性狀改良”等可以等同替代，是指與未改良前藻類(如野生型藻類)相比，經(jīng)本發(fā)明改良的藻類光吸收效率提高、光轉(zhuǎn)化效率增強(qiáng)、光合碳同化效率增強(qiáng)、光保護(hù)機(jī)制增強(qiáng)，器官的數(shù)目或大小向有利的方向變化、構(gòu)造向有利的方向變化、提聞經(jīng)濟(jì)廣量、生物量提聞和/或廣量提聞等。
[0114]如本文所用，術(shù)語“產(chǎn)量”可以涉及藻類的營養(yǎng)生物量，涉及繁殖器官和/或涉及繁殖體。
[0115]“產(chǎn)量相關(guān)性狀”包括但不限于生物量、產(chǎn)量等。
[0116]如本文所用，術(shù)語“提高”、“改良”或“增強(qiáng)”是相互可以交換的并且在應(yīng)用含義上應(yīng)當(dāng)意指與本文中定義的對照藻類相比較，至少2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%、優(yōu)選的至少15%或20%、更優(yōu)選25%、30%、35%或40%更多的生長量等性狀。
[0117]如本文所用，生物體內(nèi)廣泛存在各種類型的甲基醌的衍生物，有些甲基醌是代謝過程中的中間產(chǎn)物，有些則本身參與生物體內(nèi)各種基礎(chǔ)代謝和次生代謝的調(diào)控。其中“質(zhì)體醌”(plastoquinone，PQ)就是一種甲基苯醌的衍生物。醌環(huán)上聯(lián)2個甲基，有一側(cè)鏈聯(lián)著不同數(shù)目的異戊二烯單位。光合生物體中有幾種PQ，它們的區(qū)別是異戊二烯單位數(shù)目不同。PQ廣泛存在于葉綠體和胞質(zhì)中，如粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。葉綠體中最多的是PQ9。在光合鏈中，既可傳遞電子，又可傳遞質(zhì)子，其氧化還原反應(yīng):氧化還原電位約為±0.1伏。氧化型的PQ從類囊體膜的靠外一側(cè)接受電子，并與膜外質(zhì)子結(jié)合，爾后向內(nèi)擴(kuò)散，在膜內(nèi)側(cè)被細(xì)胞色素f氧化，交出電子，同時把質(zhì)子釋放到膜內(nèi)腔。即伴隨PQ氧化和還原作用，使質(zhì)子從膜外橫渡膜進(jìn)入膜內(nèi)腔。這種質(zhì)子的移動導(dǎo)致的膜內(nèi)外質(zhì)子梯度與光合磷酸化有關(guān)。
[0118]本文中所述的“光”，除了指波長范圍從400_760nm的可見光范圍內(nèi)的電磁波外，還包括波長范圍是300-400nm的紫外線和760nm-1000nm的近紅外線的電磁波。所述“光能”，指上述范圍，即300-1000nm，的電磁波的能量。
[0119]如本文所用，所述的“光能吸收和傳遞蛋白(LEAT蛋白)”是一類由其自身組成蛋白質(zhì)序列的氨基酸殘基構(gòu)成的生色基團(tuán)吸收300-1000nm的電磁波，并將其吸收的電磁波的能量(如上述用法所述，以下簡稱為“光能”)轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的蛋白。所述轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的過程為，在吸收光能后，通過催化水的裂解將裂解產(chǎn)生的電子和質(zhì)子傳遞給相關(guān)的甲基醌及其衍生物，還原甲基醌及其衍生物的蛋白。所述甲基醌及其衍生物包括，TMBQ(2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌)、DMBQ2 (2, 6- 二甲基_1，4-對苯醌)、MBQ(甲基_1，4-對苯醌)和DMBQl (2，5- 二甲基-1, 4-對苯醌)，較佳的是TMBQ (2，3，5-三甲基-1, 4-對苯醌)。
[0120]LEAT所吸收的電磁波的波長下限是300nm,較佳的，320nm、340nm,350nm、360nm更佳的，370nm、380nm、390nm、400nm、410nm 或 420nm ;上限是 1000nm,較佳的，950nm、900nm,850nm、800nm,更佳的，750nm、700nm、680nm、660nm、650nm、640nm、630nm 或 620nm。
[0121]所述LEAT蛋白優(yōu)選自:
[0122] 熒光蛋白或其經(jīng)一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1_10個；更佳地1-5個)氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水裂解同時完成甲基醌衍生物(例如2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌或質(zhì)體醌)的還原或其類似物的突變體蛋白；或[0123]非熒光生色蛋白其經(jīng)一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1_10個；更佳地1-5個)氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水裂解的同時催化甲基醌衍生物(例如2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌或質(zhì)體醌)的還原或其類似物的突變體蛋白。
[0124]所述熒光蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，無需外加輔助因子，可受一定波長光的激發(fā)并發(fā)射熒光。
[0125]所述非熒光生色蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，無需外加輔助因子，可吸收一定波長的光，并且具有吸收光能后不發(fā)射熒光的蛋白。帶有任何輔基或輔助因子或通過任何輔基或輔助因子吸收光能的生色蛋白，如:血紅蛋白、黃素蛋白、細(xì)胞色素蛋白等，均不在本發(fā)明所述的非熒光生色蛋白范圍內(nèi)。
[0126]上述熒光蛋白和非熒光生色蛋白都具有相似的三維圓柱形結(jié)構(gòu)，其多肽骨架大部分折疊成11條氫鍵鏈接的β-片層，中央為包含生色基團(tuán)的α螺旋，其均都可依靠其自身的氨基酸序列就能夠形成生色團(tuán)結(jié)構(gòu)來吸收及發(fā)射光能。
[0127]本發(fā)明中所述的熒光蛋白優(yōu)選自:藍(lán)色熒光蛋白、青色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、遠(yuǎn)紅光熒光蛋白、近紅外熒光蛋白。
[0128]所述的“藍(lán)色突光蛋白”(Blue Fluorescent Protein, BFP)是發(fā)射峰位于440-470nm的熒光蛋白；如SEQ ID N0:4所示的藍(lán)色熒光蛋白。
[0129]所述的“青色突光蛋白”(Cyan Fluorescent Protein, CFP)是發(fā)射峰位于470-500nm的熒光蛋白；如SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO:36所示的青色熒光蛋白。
[0130]所述的“綠色突光蛋白”(Green Fluorescent Protein, GFP)是發(fā)射峰位于500-525nm 的熒光蛋白；如 SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:28,SEQ ID N0:40 或 SEQ ID N0:44 所示的綠色熒光蛋白。
[0131]所述的“黃色突光蛋白”(Yellow Fluorescent Protein, YFP)是發(fā)射峰位于525-570nm的熒光蛋白；如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:50所示的黃色熒光蛋白。
[0132]所述的“紅色突光蛋白”(Red Fluorescent Protein, RFP)是發(fā)射峰位于570-630nm的熒光蛋白；如SEQ ID NO:2所示的紅色熒光蛋白；如SEQ ID NO:2, SEQ IDNO:30, SEQ ID NO:34, SEQ ID N0:42 或 SEQ ID N0:46 所示的紅色熒光蛋白。
[0133]所述的“遠(yuǎn)紅光突光蛋白”(Far-red Fluorescent Protein)是發(fā)射峰位于630-760nm的熒光蛋白。
[0134]所述的“近紅外突光蛋白”(Near Infra-red Fluorescent Protein)是發(fā)射峰位于760-900nm的熒光蛋白；如SEQ ID N0:32或SEQ ID N0:48所示的近紅外熒光蛋白。
[0135]所述的“非突光生色蛋白”(non-fluorescent chromoprotein)如 SEQ ID NO: 38所示的非熒光生色蛋白。
[0136]如本文所用，“表達(dá)”是指多核苷酸(一個或多個)或含有多核苷酸的表達(dá)盒至mRNA的轉(zhuǎn)錄，有或無后者至蛋白質(zhì)的隨后翻譯。該過程包括DNA的轉(zhuǎn)錄和所獲得的mRNA產(chǎn)物的加工。
[0137]如本文所用，術(shù)語“引入”或“轉(zhuǎn)化”包括將外源多核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞，不考慮轉(zhuǎn)移所用的方法。
[0138]外來基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入宿主基因組中稱為轉(zhuǎn)化。生物物種的轉(zhuǎn)化目前是一種相當(dāng)常規(guī)的技術(shù)。有利地，可以使用若干轉(zhuǎn)化方法的任一種向適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞引入目的基因?？梢岳霉_的轉(zhuǎn)化方法以及由生物組織或器官再生的方法來進(jìn)行瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法包括應(yīng)用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學(xué)物質(zhì)、直接向藻類注射DNA、基因槍/粒子槍轟擊、用病毒或花粉轉(zhuǎn)化和微粒轟擊。方法可以選自用于原生質(zhì)體的鈣 / 聚乙二醇方法(Krens, F.A.等，(1882)Nature296, 72-74 ;Negrutiu 1.等，(1987)Plant Mol.Biol.8:363-378);原生質(zhì)體的電穿孔法(Shillito R.D.等，(1985)Rio/Technol3, 1099-1102)；植物材料的顯微注射(Crossway A.等，(1986)Mol.GenGenet202:179-185) ;DNA 或 RNA 包被的粒子轟擊(Klein T.Μ.等，(1987) Nature327:70)；用(非整合型)病毒感染，等等。
[0139]關(guān)于“對照藻類”，選擇合適的對照藻類是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的例行部分，可以包括對應(yīng)的野生型藻類或無目的基因的相應(yīng)轉(zhuǎn)基因藻類。對照藻類一般是相同的藻類物種或甚至是與待評估藻類相同的品種。對照藻類也可以是因分離而丟失轉(zhuǎn)基因藻類的個體。如本文所用的對照藻類不僅指完整藻類，也指藻類部分。
[0140]本文所用的術(shù)語“增加的表達(dá)” “過表達(dá)”或“異位表達(dá)”是指相對于原有的野生表達(dá)水平外額外的任何形式的表達(dá)。
[0141]如本文所用，“表達(dá)盒”在這里是指重組DNA分子，它包含預(yù)期的核酸編碼序列，這個序列編碼光能吸收和傳遞蛋白；這個DNA分子還包含轉(zhuǎn)錄在體外或體內(nèi)可操作的連接編碼序列所必需的或預(yù)期的適合的調(diào)控元件?！罢{(diào)控元件”在這里指的是可控制核酸序列表達(dá)的核苷酸序列?？勺鳛榈浞兜恼{(diào)控元件包括啟動子，轉(zhuǎn)錄終止序列或上游調(diào)節(jié)區(qū)，這些調(diào)控元件有助于核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾等。此外，調(diào)控元件還可以包括:增強(qiáng)子，內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)，復(fù)制起點(diǎn)，多腺苷酸化信號等。 [0142]如本文所用，所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
[0143]如本文所用，“外源的”或“異源的”基因或蛋白是指并非天然包含在原生物體基因組中的基因或蛋白。所述的“外源蛋白的編碼基因”也稱為“異源DNA”，指在所給定的宿主細(xì)胞中原本不存在的一種DNA分子，或一個DNA分子群；或指異于特定宿主細(xì)胞的DNA分子。
[0144]如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”;“主要由……構(gòu)成”、“基本上由……構(gòu)成”和“由……構(gòu)成”屬于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
[0145]LEAT 蛋白
[0146]本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，一系列光能吸收和傳遞蛋白(LEAT蛋白)，能夠在光下催化水的裂解和質(zhì)體醌類似物(如對2，3，5三甲基-1，4-對苯醌)的還原，同時放出氧氣。因此LEAT蛋白在藻類類囊體膜上整合表達(dá)后，其在光下催化裂解水反應(yīng)可持續(xù)地產(chǎn)生的電子用于還原光合電子傳遞鏈下游的質(zhì)體醌，還原型的質(zhì)體醌可提供額外的電子來源參與光合電子傳遞，調(diào)控藻體內(nèi)的各種氧化還原狀態(tài)，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)藻類的生長，改良藻類的性狀。
[0147]多種光能吸收和傳遞蛋白(LEAT)蛋白可應(yīng)用于本發(fā)明，只要其是吸收光子的能量超過裂解水所需能量的蛋白，或能夠吸收300-1000nm波長的蛋白。本領(lǐng)域公知，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，1分子 水分解成氧和2個電子和2個質(zhì)子需要1.23電子伏特光能，因此LEAT蛋白吸收光子的能量只要超過裂解水所需的能量，也就是1.23電子伏特就能驅(qū)動這一反應(yīng)，放出的電子和質(zhì)子通過這類醌化合物的介導(dǎo)，還原體內(nèi)的氧化物質(zhì)。因此，本發(fā)明涉及一系列具有光能吸收和傳遞功能的蛋白，包括吸收光波輻射的發(fā)射和不發(fā)射熒光的蛋白基因，如綠色、黃色、紅色熒光蛋白及其突變體，它們能夠用于提高藻類的光能利用率，極顯著地提高生物量。
[0148]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的LEAT蛋白包括:藍(lán)色熒光蛋白，青色熒光蛋白，綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，紅色熒光蛋白或遠(yuǎn)紅光熒光蛋白或非熒光生色蛋白。
[0149]熒光蛋白是一類在適當(dāng)條件下能發(fā)光的蛋白，其生色基團(tuán)是由組成其蛋白序列的氨基酸殘基構(gòu)成。在現(xiàn)有技術(shù)中其主要被用于標(biāo)記細(xì)胞結(jié)構(gòu)和監(jiān)測胞內(nèi)過程，它還用于細(xì)胞群體的體內(nèi)示蹤，如腫瘤細(xì)胞。最早出現(xiàn)的綠色熒光蛋白(GFP)是于1962年在一種學(xué)名Aequorea victoria的水母中發(fā)現(xiàn)，之后又在海洋珊瑚蟲中分離得到了 GFP。隨后的研究又在腔腸動物門中的珊瑚蟲綱(Actinozoa)中，如珊瑚和?？邪l(fā)現(xiàn)了一系列不同光譜特性的熒光蛋白。所有的熒光蛋白都具有相似的三維圓柱形結(jié)構(gòu)，其多肽骨架大部分折疊成11條氫鍵鏈接的β_片層，中央為包含生色基團(tuán)的α螺旋。迄今為止，熒光蛋白經(jīng)過基因工程手段的改造已發(fā)展出一系列的衍生物，它們的發(fā)射光譜基本已覆蓋了整個的可見光區(qū)(400-760nm)和近紅外線區(qū)(760_900nm)。因此，較佳地，熒光蛋白是三級結(jié)構(gòu)為11股β_折疊組成的β_桶狀結(jié)構(gòu)環(huán)繞著包含生色基團(tuán)的α-螺旋。
[0150]所述熒光蛋白是指天然存在的或合成的蛋白，無需外加輔助因子，其本身氨基酸構(gòu)成的生色基團(tuán)即可受一定波長范圍的電磁波激發(fā)并發(fā)射出可見光。另一方面，所述熒光蛋白可以是從腔腸動物，如水母，珊瑚蟲或?？蟹蛛x的熒光蛋白及其衍生物；另一方面，所述熒光蛋白是來自Aequorea的綠色熒光蛋白(Swiss-Prot:Ρ42212)及其衍生物，如SEQID Ν0:4所不的BFP ;或所述突光蛋白也可來自Discosoma sp.的紅色突光蛋白(DsRed)(Swiss-Prot: Q9U6Y8)或其衍生物，如 mCherry。
[0151]本發(fā)明中所述的非熒光生色蛋白與上述熒光蛋白具有類似的結(jié)構(gòu)，能夠吸收一定波長的光能，但其野生型蛋白發(fā)射熒光的能力極弱。
[0152]目前，GFP, RFP, BFP等被廣泛用于生物影像研究，報道蛋白在組織和細(xì)胞中的定位(Shaner NC, Patterson GH, Davidson WL 2007Advances in fluorescentproteintechnology.J Cell Sc1.15;120(Pt24):4247-4260 ；mCherry Shaner NC,CampbellRE, Steinbach PA, Giepmans BN, Palmer AE, Tsien RY.(2004)Improved monomericred, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp.redf luorescentprotein.Nat Biotechnol.22 (12): 1567-72)。但是，目前還沒有技術(shù)人員將這些熒光蛋白或非熒光生色蛋白用于制備轉(zhuǎn)基因藻類以提高藻類的光合作用效率。
[0153]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的LEAT蛋白是:藍(lán)色熒光蛋白(BlueFluorescentProtein, BFP),青色突光蛋白(Cyan Fluorescent Protein, CFP),綠色突光蛋白(GreenFluorescent Protein, GFP),黃色突光蛋白，紅色突光蛋白(Red FluorescentProtein, RFP),或遠(yuǎn)紅色熒光蛋白或非熒光生色蛋白。上述熒光蛋白的變異體也可應(yīng)用于本發(fā)明中。上述熒光蛋白的變異體盡管熒光強(qiáng)度發(fā)生較大的改變，但仍然能夠在甲基醌或其衍生物存在的條件下利用光能催化水的裂解反應(yīng)，釋放氧氣，持續(xù)的產(chǎn)生還原能并儲存在醌中，因此它們也能夠應(yīng)用于本發(fā)明。
[0154]作為本發(fā)明的另一優(yōu)選方式，所述的熒光蛋白選自但不限于:黃色熒光蛋白(Yellow Fluorescent Protein),紅色突光蛋白(Red Fluorescent Protein, RFP),或遠(yuǎn)紅光突光蛋白(Far-red Fluorescent Protein)。應(yīng)理解，本發(fā)明的方法通過利用突光蛋白來轉(zhuǎn)換吸收光的波長或光譜能量來實(shí)現(xiàn)技術(shù)效果，所以任何可被495-620nm的光激發(fā)且發(fā)射峰位于550-700nm間的熒光蛋白都具有與RFP類似的光學(xué)特性，可將藻類利用率低的光轉(zhuǎn)化為光系統(tǒng)利用效率高的光，從而可應(yīng)用于本發(fā)明，例如:mHoneydew(激發(fā)峰為487/504nm,發(fā)射峰為537/562nm), mBanana(激發(fā)峰為540nm,發(fā)射峰為553nm),mOrange (激發(fā)峰為548nm,發(fā)射峰為562nm), dTomato (激發(fā)峰為554nm,發(fā)射峰為581nm),tdTomato (激發(fā)峰為554nm,發(fā)射峰為581nm), mStrawberry (激發(fā)峰為574nm,發(fā)射峰為596nm), mCherry (激發(fā)峰為587nm,發(fā)射峰為610nm), mPlum(激發(fā)峰為590nm,發(fā)射峰為649nm), mRFPl (激發(fā)峰為584nm,發(fā)射峰為607nm), mTangerine (激發(fā)峰為568nm,發(fā)射峰為585nm)。[0155]所述的“綠色熒光蛋白”、“青色熒光蛋白”、“藍(lán)色熒光蛋白”還包括“增效的綠色熒光蛋白”、“增效的青色熒光蛋白”、“增效的藍(lán)色熒光蛋白”。
[0156]所述的“青色熒光蛋白”例如可以具有GenBank登錄號AAQ96626所示的氨基酸序列或與其基本上相同；或?qū)⒃摪被嵝蛄薪?jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白；或與GenBank登錄號AAQ96626所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有改良藻類性狀功能的蛋白。
[0157]所述的“黃色熒光蛋白”例如可以具有GenBank登錄號ADR00308所示的氨基酸序列或與其基本上相同；或?qū)⒃摪被嵝蛄薪?jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白；或與GenBank登錄號ADR00308所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有改良藻類性狀功能的蛋白。
[0158]所述的“遠(yuǎn)紅光熒光蛋白”例如可以具有GenBank登錄號ACH06541所示的氨基酸序列或與其基本上相同；或?qū)⒃摪被嵝蛄薪?jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白；或與GenBank登錄號ACH06541所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白。
[0159]所述的“非熒光生色蛋白”例如可以具有GenBank登錄號DQ206394 (gfasCP)，AF363776 (hcriCP)，AY485336 (anm2CP)等。
[0160]在本發(fā)明中，所用的LEAT蛋白可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自低等生物，如腔腸動物門。此外，所述的LEAT蛋白也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生產(chǎn)的LEAT蛋白。優(yōu)選的，本發(fā)明可采用重組的LEAT蛋白。任何適合的LEAT蛋白均可用于本發(fā)明。所述的LEAT蛋白包括全長的LEAT蛋白或其生物活性片段。將野生型LEAT蛋白的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-30個；較佳地1-20個；更佳地1_10個；更佳地1-5個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有該序列的蛋白相同功能的蛋白；或與野生型氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且具有野生型蛋白相同功能的蛋白。LEAT蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其光能吸收和傳遞特性。適當(dāng)替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實(shí)施并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認(rèn)識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性；見Watson 等 Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, The Benjamin/Cummings Pub.C0.P224。任何一種LEAT蛋白的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，LEAT蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的LEAT蛋白的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長LEAT蛋白的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長LEAT蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的LEAT蛋白，比如，可采用為了促進(jìn)其半衰期、有效性、代謝、和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的LEAT蛋白。也就是說，任何不影響LEAT蛋白的光能吸收和傳遞的變化形式都可用于本發(fā)明中。
[0161]本發(fā)明所述的熒光蛋白還能夠用于改良藻類多方面性能，包括:提高藻類的光能利用效率；增加藻類PSI或PSII的光化學(xué)效率；增加藻類光合電子傳遞效率；提高藻類對CO2的同化能力；提高藻類的凈光合效率；提高藻類的光合器官的光保護(hù)機(jī)制；促進(jìn)藻類生長；提高藻類的生物量；增加藻類的總蛋白量；提高藻類產(chǎn)量。上述藻類性狀變化對于藻類品種的改良是非常有益的。
[0162]改良藻類性狀的方法
[0163]本發(fā)明提供了一種改良藻類性狀的方法，所述方法包括:在藻類類囊體膜系統(tǒng)II外周蛋白PsbC上融合表達(dá)外源的LEAT蛋白。外源的LEAT蛋白與藻類體內(nèi)的質(zhì)體醌及其類似物一起，自發(fā)形成一個新的人工光反應(yīng)系統(tǒng)，通過催化水的裂解，將吸收的光能轉(zhuǎn)換為還原能儲存在醌分子中，并放出氧氣，而還原性的醌分子作為額外的電子來源，可以參與藻類的光合電子傳遞，調(diào)控體內(nèi)一系列的氧化還原反應(yīng)，同時還利用一些LEAT蛋白吸收一些對藻類有害的射線，如紫外或高強(qiáng)度的藍(lán)光等，保護(hù)強(qiáng)光下的光合機(jī)構(gòu)免受傷害。并進(jìn)而提高了藻類的光合作用、促進(jìn)生長提高了生物量和產(chǎn)量。所述的LEAT蛋白可以是:藍(lán)色熒光蛋白，青色熒光蛋白，綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，紅色熒光蛋白或遠(yuǎn)紅光熒光蛋白或他們的變異體。
[0164]使得藻類表達(dá)外源蛋白的方法是本領(lǐng)域周知的。通常，可通過轉(zhuǎn)入攜帶LEAT蛋白編碼基因的表達(dá)盒使植株表達(dá)熒光蛋白。
[0165]因此，本發(fā)明還提供了一種用于在藻類體內(nèi)表達(dá)LEAT蛋白的表達(dá)盒。所述的表達(dá)盒包括操作性連接的調(diào)控元件以及LEAT蛋白的編碼序列，從而當(dāng)其轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)或整合到基因組中后，可重組表達(dá)LEAT蛋白。所述的表達(dá)盒中包括與LEAT蛋白編碼序列操作性連接的啟動子。所述的啟動子可以是任何可指導(dǎo)LEAT蛋白編碼序列在藻類表達(dá)的啟動子，例如是組成型(例如CaMV35S啟動子)的或是組織特異性的或是誘導(dǎo)型的。在啟動子驅(qū)動下，LEAT蛋白的表達(dá)可提高藻類對光的利用效率。
[0166]本發(fā)明中，LEAT蛋白的表達(dá)盒可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。 [0167]此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。
[0168]本領(lǐng)域技術(shù)人員均了解，藻類的光合作用的機(jī)理是非常接近的，關(guān)鍵參與者是內(nèi)部的葉綠體，能夠?qū)⑵湮盏墓饽苻D(zhuǎn)換為還原力，向光合電子遞體提供電子，改變它們的氧化還原狀態(tài)。因此，應(yīng)理解，本發(fā)明的技術(shù)方案可以適用于多種藻類生物而不僅限于藍(lán)藻。
[0169]本發(fā)明的技術(shù)方案的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0170]本發(fā)明的方法可以拓展藻類對光能的利用，提高光合效率及產(chǎn)量。本發(fā)明將LEAT蛋白轉(zhuǎn)到藻類中，拓展藻對太陽光能利用的光譜范圍，通過催化水的裂解提供額外的電子，參與光合電子傳遞鏈，并改變氧化還原狀態(tài)來調(diào)控光合機(jī)構(gòu)的表達(dá)，從而達(dá)到提高對太陽光能利用效率。方法簡易，成本低，效果好，成效顯著。本發(fā)明對于拓展對太陽光能利用的光譜范圍，提高藻類對太陽光的利用效率，降低有害輻射(紫外線UVB)以及高光強(qiáng)對藻類的傷害，從而提高藻類光合作用效率，最終提高生物量和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量具有重要意義。因此本發(fā)明可以應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物能源產(chǎn)業(yè)等方面。
[0171]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0172]1.材料和方法
[0173]所用LEAT蛋白序列及基因序列
[0174]本發(fā)明用到的LEAT蛋白包括熒光蛋白及不發(fā)熒光的突變體，都具有相似的三維圓柱形結(jié)構(gòu)，其多肽骨架大部分折疊成11條氫鍵鏈接的β_片層，中央為包含生色基團(tuán)的α螺旋。吸收光譜覆蓋了大部分的可見光區(qū)和部分紫外線區(qū)(320-630nm)。
[0175]mCherry 基因序列如 SEQ ID NO:1。
[0176]mCherry 蛋白序列如 SEQ ID NO: 2 (激發(fā)波長 480_620nm)。
[0177]BFP 基因序列如 SEQ ID N0:3。
[0178]BFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:4(激發(fā)波長 320_410nm)。
[0179]GFP 基因序列如 SEQ ID N0:5。
[0180]GFP 蛋白序列如 SEQ ID NO:6)(激發(fā)波長 400_510nm)。
[0181]YFP 基因序列如 SEQ IDN0:7。
[0182]YFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:8(激發(fā)波長 450_530nm)。
[0183]CFP 基因序列如 SEQ ID NO:9) ?
[0184]CFP 蛋白序列如 SEQ ID NO: 10)(激發(fā)波長 350_490nm)。
[0185]YFP點(diǎn)突變后的基因和蛋白序列如下:
[0186]YFPmu2 (YFPm49c Y204A)基因序列如 SEQ ID NO: 11。
[0187]YFPmu2 (YFPm49c Y204A)蛋白序列如 SEQ ID NO: 12。
[0188]YFPmu4(YFPm49c F166N I168M Y204A)基因序列如 SEQ ID NO: 13。
[0189]YFPmu4(YFPm49c F166N I168M Y204A)蛋白序列(SEQ ID NO: 14)。
[0190]YFPmu7 (YFPsi48c H149C F166N K167M I168M S203A Y204A)基因序列如 SEQ ID NO: 15。
[0191]YFPmu7 (YFPsi48c H149C F166N K167M I168M S203A Y204A)蛋白序列如 SEQ ID NO: 16。
[0192]YFPl232h 基因序列如 SEQ ID NO: 17。
[0193]YFPl232h 蛋白序列 如 SEQ ID NO: 18。
[0194]YFPl232q 基因序列如 SEQ ID NO: 19。[0195]YFPl232q 蛋白序列如 SEQ ID N0:20。
[0196]mCherry點(diǎn)突變后的基因和蛋白序列如下
[0197]mCherrymu3 (mCherysl51c S152C K167M)基因序列如 SEQ ID NO: 210
[0198]mCherymu3 (mCherrysl51c S152C K167M)蛋白序列如 SEQ ID N0:22。
[0199]mCherrymu4(mCherrysl51c S152C K167M I202A)基因序列如 SEQ ID NO:23。
[0200]mCherymu4(mCherrysl51c S152C K167M I202A)蛋白序列如 SEQ IDNO:24?
[0201]mCherrymu5 (mCherysl51c S152C I166N K167M I202A)基因序列如 SEQ ID NO: 25。
[0202]mCherrymu5 (mCherrysl51c S152C I166N K167M I202A)蛋白如 SEQ ID NO: 26。
[0203]mGFP5 基因序列如 SEQ ID N0:27。
[0204]mGFP5 蛋白序列如 SEQ ID N0:28。
[0205]eqFP611(AY130757)基因序列如 SEQ ID N0:29。
[0206]eqFP611 蛋白序列如 SEQ ID N0:30。 [0207]hcriCP(AF363776)基因序列如 SEQ ID N0:31。
[0208]hcriCP 蛋白序列如 SEQ ID N0:32。
[0209]eforCP(EU498726)基因序列如 SEQ ID N0:33。
[0210]eforCP 蛋白序列如 SEQ ID N0:34。
[0211]efasCFP(DQ206397)基因序列如 SEQ ID N0:35。
[0212]efasCFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:36。
[0213]spisCP(DQ206398)基因序列如 SEQ ID N0:37。
[0214]spisCP 蛋白序列如 SEQ ID N0:38。
[0215]scubGFP(AY037767)基因序列如 SEQ ID N0:39。
[0216]scubGFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:40。
[0217]rf1RFP(AY037773)基因序列如 SEQ ID N0:41。
[0218]rfloRFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:42。
[0219]rmueGFP(AY015996)基因序列如 SEQ ID N0:43。
[0220]rmueGFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:44。
[0221]ceriantRFP(AY296063)基因序列如 SEQ ID N0:45。
[0222]ceriantRFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:46。
[0223]anm2CP(AY485336)基因序列如 SEQ ID N0:47。
[0224]anm2CP 蛋白序列如 SEQ ID N0:48。
[0225]phiYFP(AY485333)基因序列如 SEQ ID N0:49。
[0226]phiYFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:50。
[0227]cpGFP(AB185173)基因序列如 SEQ ID N0:51。
[0228]cpGFP 蛋白序列如 SEQ ID N0:52。
[0229]YFPl 基因序列如 SEQ ID NO:55
[0230]YFP1J31 蛋白序列如 SEQ ID NO:56
[0231]GFP突變后的基因和蛋白序列如下:
[0232]GFPl 基因序列如 SEQ ID NO:57
[0233]GFP1J31 蛋白序列如 SEQ ID NO:58[0234]LEAT蛋白的原核表達(dá)及其純化
[0235]PCR擴(kuò)增mCherry全長基因，PCR產(chǎn)物用BamHI和SalI酶切后接入pGEX_4T_l (GEhealthcare, Uppsala, Sweden)載體中，使得 GST 融合在 mCherry 基因的 N端，然后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 E.coli BL21 (DE3) (Promega,Madison,WI) ? PCR 擴(kuò)增正向引物為:5’_CCC迎ATCCATGGTGAGCMGGGCGAGGAG-3 ’ (SEQ ID NO: 53)，反向引物為:5 ’ -CCGGTCGACCTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’(SEQ ID N0:54)。正向和反向引物序列下劃線部分分別為BamHI和Sail酶切位點(diǎn)。
[0236]pRSET-BFP 經(jīng) EcoRI/XhoI 酶切將 BFP 全長基因片段連接到 pGEX-4T_lEcoRI/XhoI位點(diǎn)中，使得GST融合在BFP基因的N端，然后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)。
[0237]mCherry 點(diǎn)突變體基因(mCherrymu3, mCherrymu4 和 mCherrymu5)通過合成獲得(金斯瑞生物科技，南京，中國)，合成序列時分別兩端帶有BamHI和SacI,合成后mCherrymu3, mCherrymu4 和 mCherrymu5 片段連接到 pUC57 載體 BamHI/SacI 酶切位點(diǎn)。pUC57-mCherrymu3, pUC57-mCherrymu4 和 pUC57_mCherrymu5 用 BamHI 和 SacI 酶切后，片段接入pET30a (Novagen)載體，使得6XHis標(biāo)簽融合在mCherry各突變基因的N端。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)菌株中，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。
[0238]分別以pEYFP，pECFP(Clonetech)和 pl301-GFP(Li N, Zhang D-S, Liu H-S etal.The rice tapetum degeneration retardation gene is required for tapetumdegradation andanther development.The Plant Cell2006; 18:2999-3014.)為模板，利用 iProofHigh-Fidelity DNA 聚合酶(Bio-rad)，通過 PCR 擴(kuò)增 YFP，CFP, GFP 基因以及 C末端去除的YFP突變體基因(YFPl)和GFP突變體基因(GFPp231),將PCR產(chǎn)物用KpnI和SacI酶切后連接到pET51b載體(Novagen)中，YFPmu2、YFPmu4等的點(diǎn)突變通過引物擴(kuò)增引入。以上的基因的N末端融合有str印II，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21-CodonPluS菌株(Promega, Madison, WI)中，以 20。C，0.1mlIPTG 誘導(dǎo)過夜。
[0239]12個LEAT蛋白基因通過合成獲得(金斯瑞生物科技，南京，中國)，合成序列時分別兩端帶有BamHI和SacI或EcoRI和SacI酶切位點(diǎn)，用BamHI和SacI或EcoRI和SacI酶切后接入pET30a (Novagen)，N末端與6XHis標(biāo)簽融合。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21 (DE3)菌株中，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。
[0240]上述融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)參照生產(chǎn)廠商的產(chǎn)品說明書。純化的蛋白經(jīng)脫鹽后，-80° C保存在含10%甘油的50mM的PBS緩沖液中。
[0241]LEAT蛋白光下催化水裂解放氧速率的測定
[0242]將1.85毫升的50禮PBS (pH6.5)，加入Clark型氧電極的反應(yīng)池中，然后在暗中先后加入終濃度為0.1-1 μ g/ml LEAT蛋白(GFP蛋白含量約為10 μ g/ml)和400 μ M各種類型對苯醌。然后在其激發(fā)波長的光下(光強(qiáng)約為1-2 μ mol HT2s-1)測定其放氧速率。
[0243]熒光蛋白在光下催化TMBQ的還原能力測定方法
[0244]將2ml50mM PBS(pH6.5)加入3ml四面透光的石英比色杯中。然后避光先后加入終濃度為0.02-1 μ g/ml LEAT蛋白(GFP蛋白含量約為20 μ g/ml)和400 μ M2，3，5-三甲基-1,4-對苯醌(TMBQ)。然后在各自適合波長的光(光強(qiáng)約為1-2 μ mol m_2s_1)下用UV-3000 (日本島津公司Shimadzu)分別測定其OD436吸收減少速率，TMBQ還原速率按照其在436nm處的消光系數(shù)(41.AiT1CnT1)進(jìn)行計(jì)算。[0245]Rubisco酶活力測定
[0246]1，5_ 二憐酸核酮糖羧化酶 / 加氧酶(ribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, Rubisco)羧化活性的測定:用緩沖溶液(50mM Tris-HCl pH7.8, ImMEDTA, 50mMNaCl和2mM β -Mercaptoethano I)從藍(lán)藻中快速提取可溶性蛋白。將勻漿離心(4° C，12，000g，6分鐘)所得上清液用于分析Rubisco活力。用14C同位素法測定 Rubisco 的羧化活性(Wang ZY, Snyder Gff, Esau BD, Portis AR, OgrenWL(1992)Species-dependentvariation in the interaction of substrate-boundribulose-l, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase(rubisco)and rubisco activase.Plant PhysiologylOO: 1858-1862)。
[0247]藍(lán)藻細(xì)胞活體放氧測定
[0248]活體條件的光合放氧的葉綠素含量為每毫升10-20 μ g,光強(qiáng)為500 μ mol JiT2S'綠光依賴的光合放氧的作用光為520nm,光強(qiáng)約為6 μ mol m 2S、
[0249]藍(lán)藻葉綠素?zé)晒饧癙700氧化還原的測定
[0250]利用帶有IOlED發(fā)射-檢測-比色杯裝置(ED-1OlUS)的PAM葉綠素?zé)晒鈨x(Walz，Effeltrich，德國)測定細(xì)胞葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化。細(xì)胞經(jīng)暗適應(yīng)30秒后，打開非光化學(xué)調(diào)制光束(1.6可Hz)測得最小應(yīng)該值，F(xiàn)o ;細(xì)胞在遠(yuǎn)紅光或綠光下，用飽和閃光(XMT103，Walz, Effeltrich，德國)測得Fm’熒光水平；在遠(yuǎn)紅光或綠光下，測定細(xì)胞熒光的穩(wěn)態(tài)水平(Fs);在照射指定時 間的遠(yuǎn)紅光或綠光后測定測定Fo’值；在作用光下加入ΙΟμΜ敵草隆(DCMU)測定最大熒光(Fm);用 1-[(Fm，-Fs)/(Fm，-Fo)x(Fo’ -Fs)算出 QA 值。用帶有ED-P700DW-E光吸收單元的PAM葉綠素?zé)晒鈨x，檢測810-830納米的光吸收變化來反映P700的氧化還原狀態(tài)的變化，在照射遠(yuǎn)紅光40秒后測定P700暗中的還原初始速率(Klughammer and Schreiber,1998, Mi et al.1992)。
[0251]藍(lán)藻細(xì)胞密度的測定
[0252]藍(lán)藻接種后每天用分光光度計(jì)(UV-2450，Shimadzu)測定730nm吸光值來決定細(xì)胞密度，對在不同生長光下培養(yǎng)3天的細(xì)胞進(jìn)行拍照，記錄生長表型。
[0253]光合電子遞體細(xì)胞色素f和質(zhì)藍(lán)素的氧化還原測定
[0254]利用分光光度計(jì)(UV-2450，Shimadzu)測定554.5nm吸收的上升或下降來決定細(xì)胞色素f還原和氧化變化；測定598nm的下降和上升決定質(zhì)藍(lán)素的還原和氧化。光依賴的細(xì)胞色素f和質(zhì)藍(lán)素的氧化還原的是用帶有激發(fā)光源的分光光度計(jì)(UV-3000，Shimadzu)檢測，作用光是將白色光分別通過不同的干涉濾光片獲得，用適當(dāng)?shù)臑V光片保護(hù)檢測窗口。細(xì)胞色素f還原速率按照其在554.5nm處的消光系數(shù)31500m-1cm-1)，質(zhì)藍(lán)素的還原速率按照598nm處的消光系數(shù)(47001^01^1)進(jìn)行計(jì)算。
[0255]集胞藍(lán)藻PsbC融合蛋白突變體以及生長條件
[0256]通過分子生物學(xué)的技術(shù)，將外源基因YFP通過同源重組的技術(shù)，融合到能源藻——集胞藍(lán)藻PCC6803(常規(guī)藻種，獲自日本京都大學(xué))的光系統(tǒng)II PsbC基因的C末端上。PsbC-YFP轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的構(gòu)建如圖14A所示，利用pEYFP載體(ClontechLaboratories, Inc.CA, USA)構(gòu)建了 pEYFP_SpK質(zhì)粒，將這些帶有YFP的質(zhì)粒插入PsbC 基因的 C 末端，引物為:PsbC_SalF, ggggtcgactatttaccatgccctcc ;PsbC_BamHR,gggggatccaagtcgaggtcaggcatga;PsbDn_EcoRF, ggggaattcgttgttcatgcctgac ；PsbDn-XbaR, gggtctagaaatttggagtgaggcc,構(gòu)建了用于轉(zhuǎn)化藍(lán)藻的 PsbC_YFP_SpR 質(zhì)粒。
[0257]利用自然轉(zhuǎn)化法將PsbC-YFP-SpK轉(zhuǎn)化質(zhì)粒對藍(lán)藻細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在含有鏈霉素的抗生素的瓊脂平板上畫線，放在藍(lán)藻的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，獲得轉(zhuǎn)化的克隆后，進(jìn)行PCR鑒定(圖14B)，然后在含有100 μ g/ml鏈霉素培養(yǎng)基中進(jìn)行整合。
[0258]藍(lán)藻細(xì)胞的培養(yǎng)
[0259]野生型集胞藍(lán)藻6803、PsbC-YFP轉(zhuǎn)基因藍(lán)藻用含5mM Tris-HCl (pH8.0)的BG-1l培養(yǎng)基，在30°C，2%(v/v)C02、連續(xù)照射光GOym0InT2iT1)的條件下通氣培養(yǎng)，突變株系的培養(yǎng)基中添加適當(dāng)?shù)目股亍?br> [0260]I1.實(shí)施例
[0261 ] 實(shí)施例1、LEAT蛋白利用光能催化水的裂解
[0262]ULEAT蛋白在作用光下催化水對質(zhì)體醌的類似物2，3，5_三甲基_1，4_對苯醌的還原。
[0263]已有報道表明，GFP蛋白能夠作為電子供體還原一些氧化態(tài)的小分子化合物如NAD+、鐵氰化鉀以及一些蛋白如細(xì)胞色素C、以FAD為輔基的蛋白(Bogdanov AM等，2009，Nature Chemical Biology.5:459-461),但這一反應(yīng)是不可持續(xù)的。本發(fā)明人利用純化的大腸桿菌表達(dá)重組蛋白。預(yù)照光的YFP和mCherry雖然可以作為電子供體，但是其反應(yīng)是不可持續(xù)的(圖1)。通過監(jiān)測醌分子的在436nm吸收減少來分析LEAT蛋白催化的醌分子的光下還原。
[0264]LEAT蛋白可以作為一類與葉綠體內(nèi)反應(yīng)中心葉綠素a相似的反應(yīng)中心色素，在作用光的激發(fā)下，能夠催化水對甲基醌或其衍生物的還原，例如質(zhì)體醌的類似物2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌(圖2)。與TMBQ的光下還原相似，LEAT蛋白光下催化的水裂解放氧反應(yīng)是光強(qiáng)依賴的。雖然GFP光下也有催化水裂解放氧活性，但其活性比較低(圖3和圖4)，其余的LEAT蛋白都具有很強(qiáng)的催化TMBQ還原(圖2)并放出氧氣的活力(圖5)，且是TMBQ濃度依賴的(圖5)。
[0265]YFP/mChery在其他甲基醌存在時，也能在光下催化水裂解反應(yīng)，其中在TMBQ存在的情況下，YFP和mCherry蛋白分子的光下裂解水放氧活力最高，其中TMBQ>DMBQ2>MBQ>DMBQ1，而用杜醌(DuroQuinone，DQ，四甲基-1，4-對苯醌)和泛醌類似物(2，3- 二甲氧基-5-甲基-1，4-對苯醌，UQ)替代TMBQ時，YFP和mCherry蛋白則沒有光下裂解水放氧的活力(圖6)。生物體內(nèi)有有各種醌類物質(zhì)，其中甲基醌衍生物是最重要的一類醌之一，比如=TMBQ的類似物質(zhì)體醌含量很高，在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中都有廣泛分布。
[0266]2.LEAT蛋白光下催化TMBQ還原和水裂解放氧活力不依賴于其熒光的強(qiáng)弱
[0267]自然界中存在許多不發(fā)光但能吸收光的生色蛋白。為了進(jìn)一步探討LEAT蛋白的熒光特性與其光下催化水裂解放氧能力關(guān)系，將YFP和mCherry生色團(tuán)周圍相關(guān)殘基進(jìn)行突變，各得到了 3個熒光大幅度減弱的點(diǎn)突變:YFPmu2 (YFPhi49c Y204A)，YFPmu4 (YFPhi49c
F166N I168M Y204A) ρρ^(-yppSHSC H149C F166N Κ167Μ Ι168Μ S203A Υ204Α) mCherrymu3 (mCherryS151C 訓(xùn)況
K167M), mCherrymu4 (mCherrysl51c S152C K167M I202A), mCherrymu5 (mCherrysl51c S152C I166N K167M I2(I2A)。本發(fā)明人比較了這些突變體與野生型的光吸收能力、熒光強(qiáng)度、在光下催化TMBQ還原和水裂解放氧能力。吸收和熒光光譜掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這6個突變體只能發(fā)很弱的熒光或基本不發(fā)熒光。其中YFPmu2和mCherrymu3的吸收光的能力分別減少到原來的30%和40%(圖7A，E)，但其熒光強(qiáng)度分別只有原來的~I和4%(圖7D，H)。其他的4個突變體不僅熒光強(qiáng)度減弱得更多，其吸收光的能力也由很大幅度減少。其中YFPmu4和YFPmu7的熒光強(qiáng)度分別只有野生型的0.04%和0.07%(圖7A,B,E, F),而mCherrymu4和mCherrymu5的突光強(qiáng)度分別只有野生型的3%和5%(圖7C，G)。
[0268]進(jìn)一步的光下裂解水放氧活力測定表明，不管LEAT蛋白是否發(fā)熒光都能在光下催化醌介導(dǎo)的裂解水放氧。放氧活力不僅沒有隨著熒光強(qiáng)度降低，反而有大幅度的提高。其中YFPmu2和YFPmu7分別是野生型的6倍和30倍，mCherrymu3是野生型的6倍(圖7D, H)。這些結(jié)果表明，醌介導(dǎo)的LEAT蛋白催化水裂解放氧活性與其是否能發(fā)射熒光無關(guān)，而與蛋白吸收光能并傳遞和轉(zhuǎn)換光能的能力有關(guān)。由于其沒有熒光來耗散吸收的光能，它們催化TMBQ還原和水裂解放氧的活力反而更高。
[0269]3、YFP 突變體 YFPL232H，YFPl232q, YFP1^231 和 GFP1^31 放氧活力
[0270]通過對GFP和YFP，CFP, BFP氨基酸序列進(jìn)行序列比較后發(fā)現(xiàn)(圖8)，232位的氨基酸可能對放氧活力有影響。YFP⑵2H突變體光下裂解水放氧活性降低到野生型YFP的1%以下，如圖9A。但是去除C末端后YFP (圖9A)和GFP (圖9B)蛋白在TMBQ存在的情況下催化水裂解放氧活力很高。說明GFP活力較低的主要原因在于232位的組氨酸，還表明現(xiàn)在活力較低的LEAT蛋白經(jīng)過簡單的遺傳改造，如去除C末端，就可以大幅度提高它的活力，用于提聞光合效率。
[0271]實(shí)施例2、不同來源的LEAT蛋白光下催化水裂解放氧能力的比較
[0272]從110種刺胞動物(Cnidarian)和節(jié)足動物(Arthropoda)來源的突光蛋白和非熒光生色蛋白(表1)中選擇 了 9個熒光蛋白和3個非熒光生色蛋白(圖12)。這12個蛋白在進(jìn)化樹上分別屬于A、B、C、D等不同的分支(圖10)。這12個熒光蛋白和非熒光生色蛋白加上GFP系列和dsRED系列熒光蛋白在進(jìn)化上覆蓋了目前已報道的大部分的熒光蛋白和非突光生色蛋白(Alieva et al., 2008, Diversity and evolution of coar I fluorescentproteins.PLoS 0ne3 (7): e2680.do1: 10.1371/journal, pone.0002680)，它們分子進(jìn)化途徑以及氨基酸的同源性與GFP系列和dsRED系列的LEAT蛋白有很大的差別(圖13A和13B)。利用大腸桿菌表達(dá)這些蛋白，發(fā)現(xiàn)雖然它們的熒光強(qiáng)度、吸收光譜、熒光光譜有比較大的差異，但都有不同程度的光下催化水裂解放氧的活力(表2)。這就有可能將其或其突變體經(jīng)過合適的遺傳改造，利用其催化水裂解的功能，使得水在光下作為穩(wěn)定持續(xù)的電子供體，改善光合生物的性狀。
[0273]表1、110種刺胞動物(Cnidarian)和節(jié)足動物(Arthropoda)來源突光蛋白和非熒光生色蛋白名稱及基因序列號(Alieva et al.，2008)
[0274]
【權(quán)利要求】
1.一種改良藻類性狀的方法，包括以下步驟: 1)將一種或多種編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化進(jìn)入藻類； 2)從轉(zhuǎn)化后的藻類中選擇出相較對照藻類而言性狀獲得改良的藻類； 上述光能吸收和傳遞蛋白是能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸選自下組: (a)編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸； 或 (b)編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變后但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組: (a)編碼SEQID N0:4所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (b)編碼SEQID NO: 10所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (c)編碼SEQID NO:36所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (d)編碼SEQID NO:6所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (e)編碼SEQID NO:28所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (f)編碼SEQID N0:40所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (g)編碼SEQID N0:44所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (h)編碼SEQID NO:52所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (i)編碼SEQID NO:8所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (j)編碼SEQ ID NO: 12所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (k)編碼SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (I)編碼SEQ ID NO: 16所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (m)編碼SEQ ID NO: 18所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (η)編碼SEQ ID NO:20所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (ο)編碼SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (P)編碼SEQ ID ΝΟ:2所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (q)編碼SEQ ID NO:22所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (r)編碼SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (s)編碼SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (t)編碼SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (u)編碼SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (v)編碼SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (w)編碼SEQ ID N0:46所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸；(x)編碼SEQ ID N0:32所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (y)編碼SEQ ID N0:48所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (z)編碼SEQ ID NO:56所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (aa)編碼SEQID NO:58所示氨基酸序列的蛋白的多核苷酸； (ab)編碼(a)至(aa)任一所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白的多核苷酸； (ac)編碼與(a)至(aa)任一氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白的多核苷酸；或 (ad)與上述(a)-(ac)任一所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的編碼熒光蛋白或其經(jīng)一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組: (a)如SEQID N O:3所示核苷酸序列的多核苷酸； (b)如SEQID NO:9所示核苷酸序列的多核苷酸； (c)如SEQID NO:35所示核苷酸序列的多核苷酸； (d)如SEQID NO:5所示核苷酸序列的多核苷酸； (e)如SEQID NO:27所示核苷酸序列的多核苷酸； (f)如SEQID NO:39所示核苷酸序列的多核苷酸； (g)如SEQID NO:43所示核苷酸序列的多核苷酸； (h)如SEQID NO:51所示核苷酸序列的多核苷酸； (i)如SEQID NO:7所示核苷酸序列的多核苷酸； (j)如SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的多核苷酸； (k)如SEQ ID NO: 13所示核苷酸序列的多核苷酸； (I)如SEQ ID NO: 15所示核苷酸序列的多核苷酸； (m)如SEQ ID NO: 17所示核苷酸序列的多核苷酸； (η)如SEQ ID NO: 19所示核苷酸序列的多核苷酸； (ο)如SEQ ID Ν0:49所示核苷酸序列的多核苷酸； (P)如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸； (q)如SEQ ID NO:21所示核苷酸序列的多核苷酸； (r)如SEQ ID NO:23所示核苷酸序列的多核苷酸； (s)如SEQ ID NO:25所示核苷酸序列的多核苷酸； (t)如SEQ ID NO:29所示核苷酸序列的多核苷酸； (u)如SEQ ID NO:33所示核苷酸序列的多核苷酸； (V)如SEQ ID N0:41所示核苷酸序列的多核苷酸； (w)如SEQ ID NO:45所示核苷酸序列的多核苷酸； (x)如SEQ ID NO:31所示核苷酸序列的多核苷酸； (y)如SEQ ID NO:47所示核苷酸序列的多核苷酸； (z)如SEQ ID NO:55所示核苷酸序列的多核苷酸；(aa)如SEQID NO:57所示核苷酸序列的多核苷酸；或 (ab)與(a)-(aa)任一所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選擇下組: (a)SEQ ID NO: 38所不氣基酸序列的蛋白； (b)將(a)所示氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白； (c)與(a)所示氨基酸序列的蛋白的序列同源性高于70%，且能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的蛋白；或 (d)與(a)-(c)任一所述多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述的編碼非熒光生色蛋白或其經(jīng)一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變后依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白的多核苷酸選自下組: (a)如SEQID NO:37所示核苷酸序列的多核苷酸；或 (b)與(a)所述的多核 苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
7.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸還選自:編碼選自下列GenBank登錄號的蛋白的多核苷酸:
AF168421、AY646070、AY646072、AY646071、AF168424、AF168420、AY182022、AY182023、DQ206381、DQ206392、DQ206382、AY181556、AY679113、EU498721、AY182017、AY646069、AY646066、AY151052、EU498722、AY647156、AY508123、AY508124、AY508125、AF435432、AY646067、AY485334、AY485335、AY646068、AF545827、AF545830、AY037776、AB180726、DQ206383、DQ206395、DQ206396、DQ206385、EU498723、AB193294、AY182020、AY182021、AB107915、DQ206389、P42212、AY268073、AY181553、AY181554、AY181555、DQ206393、AY155344、AY037766、AY679112、AF401282、EU498724、AY268076、AY268074、AY268075、AY268071、AY268072、DQ206391、AY015995、AY182014、AF372525、EU498725、DQ206390、AF168422、AY646073、AY296063、AF272711、AB128820、DQ206379、DQ206380、AF168419、AY059642、EF186664、AF420591、DQ206387、AY182019、AY765217、AB085641、AY181552、DQ206386、AY182013、AY646064、AY485333、AF168423、AY646077、AY646076、AY646075、EF587182、AF363775、AF383155、DQ206394、DQ206376、AF38315、AF363776、AY461714、AB209967、DQ206377、DQ206378 ;或上述蛋白經(jīng)一個或多個氨基酸位點(diǎn)突變后熒光強(qiáng)弱或熒光發(fā)射光譜發(fā)生變化的，但依然能夠利用光能催化水的裂解和2，3，5-三甲基-1，4-對苯醌的還原的突變體蛋白。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述將多核苷酸轉(zhuǎn)化入藻類方法包括:將含有編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸的表達(dá)盒轉(zhuǎn)入藻類中，從而在藻類中表達(dá)上述多核苷酸。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸通過同源重組的方式轉(zhuǎn)化進(jìn)入藻類；更佳地，使得光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸整合到植物類囊體膜上。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的改良藻類性狀選自下列一種或幾種: 提高藻類的生物量； 促進(jìn)藻類生長； 提高藻類的光利用效率； 增加藻類PSI或PSII的光化學(xué)效率； 增加藻類光合電子傳遞效率； 提聞操類對CO2的同化能力； 提高藻類的凈光合效率； 提高藻類的光合器官的光保護(hù)能力； 提高藻類中光合輔助色素的含量；或 提高藻類的光合放氧速率。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的藻類是真核藻類或原核藻類。所述的藻類含有光合機(jī)構(gòu)或含有葉綠素。
12.光能吸收和傳遞蛋白或編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸的用途，用于改良藻類性狀。
13.一種藻類，其特征在于，所述藻類的細(xì)胞中含有外源的一種或多種編碼光能吸收和傳遞蛋白的多核苷酸。
【文檔編號】C12N1/13GK103911291SQ201210594376
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月31日
【發(fā)明者】米華玲, 陳根云, 蔡偉明, 孫衛(wèi)寧, 朱新廣 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院