來源于極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、表達載體及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種來源于極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、表達載體及其構(gòu)建和應(yīng)用。所述的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示，通過構(gòu)建包含還基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體，經(jīng)試驗表明，該基因能夠在梭菌中穩(wěn)定高效表達，有效提高了梭菌對丁醇的耐受性。同時，利用厭氧發(fā)酵，還表明該基因能夠大幅度提高梭菌產(chǎn)丁醇能力。
【專利說明】來源于極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、表達載體及其構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種來源于極端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、包含該基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體及其構(gòu)建方法，以及它們在提高梭菌丁醇耐受性，促使梭菌提高產(chǎn)高含量丁醇中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]生物丁醇是是一種極具潛力的第二代新型生物燃料，與乙醇相比，丁醇作為生物燃料具有以下眾多優(yōu)勢:1)能量含量高，與乙醇相比可多走30%的路程；2)丁醇的揮發(fā)性只有乙醇的1/6倍，汽油的1/13.5，與汽油混合對水的寬容度大，對潮濕和低水蒸氣壓力有更好的適應(yīng)能力；3)丁醇可在現(xiàn)有燃料供應(yīng)和分銷系統(tǒng)中使用，而乙醇則需要通過鐵路、船舶或貨車運輸；4)與其他生物燃料相比，腐蝕性較小，比乙醇、汽油安全；5)與現(xiàn)有的生物燃料相比，生物丁醇與汽油的混合比更高，無需對車輛進行改造，就可以使用幾乎100%濃度的丁醇，而且混合燃料的經(jīng)濟性更高；6) 丁醇可以通過不消耗糧食、不占用耕地、不增加環(huán)境壓力為前提進行發(fā)酵生產(chǎn)。如果丁醇占生物燃料市場的20%，全球市場將超過200億美
J Li ο
[0003]由于丁醇具有毒性，影響細菌的生長和原料轉(zhuǎn)化。目前生產(chǎn)中，丁醇的終濃度維持在13-14g/L，當超過這個濃度時，由于丁醇的毒性，細胞代謝就終止了(Zheng2009J IndMicrobiol Biotechnol )。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)丁醇的毒性主要是破壞細胞膜的磷脂成分，從而進一步影響糖和氨基酸的吸收。目前普遍認為若細胞對丁醇的抗性得以提高，丁醇的產(chǎn)量也將相應(yīng)提聞。
[0004]泛應(yīng)激蛋白(Universal stress protein, Usp)是一類在細胞質(zhì)中普遍存在的小分子蛋白，通常由111-167個氨基酸殘基組成。Usp最早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)，其表達受多種脅迫影響(NyStroml993，J Bacterio)。此后，USP蛋白在多種古生菌、細菌、植物中均被發(fā)現(xiàn)。USPA蛋白在埃希氏菌屬大腸桿菌細胞生長受到限制，DNA被損壞時誘導表達；該蛋白在化學毒素，滲透脅迫，UV照射條件下調(diào)節(jié)細胞中的營養(yǎng)物質(zhì)；被認為外界壓力的生物傳感器。研究表明該類蛋白在碳、氮、磷、硫酸鹽、氨基酸等缺乏時，以及在高溫、氧化、紫外線、環(huán)絲氨酸、抗生素等刺激下能積累表達(Liu2007, Micro Pathog)。Freestone等(1997, JMol Biol)的研究結(jié)果顯示，UspA作用于絲氨酸、蘇氨酸的蛋白磷酸化，對細胞穩(wěn)定期的生長有重要作用。在埃希氏菌屬大腸桿菌細胞中發(fā)現(xiàn)，USPA與細胞分裂蛋白有協(xié)同作用，同時可激活RecA的表達，RecA蛋白是細菌中參與DNA同源重組修復的重要蛋白，增強細胞抗性。RecA蛋白和Rad51蛋白分別是細菌和真核生物參與DNA同源重組修復的重要蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種來源于極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因、表達載體及其構(gòu)建和應(yīng)用，以彌補現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。[0006]本發(fā)明按照梭菌的偏愛密碼合成源于端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛應(yīng)急蛋白 FaUSPA 基因(Genbank ZP_05570298.1)，設(shè)計引物，采用 PTDS 方法(Xiong2004，Nucleic Acids Res)人工合成并克隆該基因,對犾得的陽性克隆進彳丁序列測定,其喊基序列如SEQ IDNOl所示，即為本發(fā)明的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因，命名為FaUSPAI。
[0007]進一步，本發(fā)明通過構(gòu)建包含上述合成的泛應(yīng)急蛋白FaUSPAI基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體，使其能夠在梭菌中高效表達。
[0008]所述的表達載體是以pS0S94載體為基礎(chǔ)載體，將氯霉素抗性基因表達單元，梭菌CAC3645基因啟動子、上述合成的FaUSPAI基因的閱讀框單元和枯草桿菌pyruvate kinase基因終止子定向連接后替換PS0S94載體中的CtfAB及abc表達單元構(gòu)建而成的。
[0009]其中，從PXYP251載體中擴增氯霉素表達單元。弓丨物為cml:5’-AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’，cm2:5’ -TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3’ ；擴增條件為 940C 30s, 600C 30s, 72°C 60s ;25 循環(huán)。
[0010]從梭菌C.acetobutylicum ATCC824 中擴增 CAC3645 基因啟動子，引物為 c3645z: 5，-TCTAGATAACCTGTAAAAAGATGATGG-3，，c3645f: 5，-GGATCCCTTGTTTCTCCTCTCACTTGA-3，。擴增條件為94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25循環(huán)。所得的梭菌CAC3645基因啟動子的堿基序列如SEQ ID N02所示。
[0011]從枯草桿菌Bacillus subtilisl68中擴增PYK基因終止子，引物為pykl: 5’_GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3，，pyk2:5，-CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACAGGCG CCG-3’ ；擴增條件為 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25 循環(huán)。
[0012]利用電擊法將上述含 有FaUSPAI基因表達單元的梭菌-大腸桿菌穿梭表達載體導入梭菌中，通過紅霉素篩選轉(zhuǎn)化子。試驗表明，該FaUSPAI基因可以在梭菌中高效表達，有效提高了梭菌對丁醇的耐受性。并在厭氧發(fā)酵中，大幅度提高了梭菌產(chǎn)丁醇能力，較原始菌株824提聞了 18%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本發(fā)明的含有FaUSPAI基因表達單元的梭菌-大腸桿菌穿梭表達載體的構(gòu)建圖譜。
[0014]圖2至圖5為FaUSPAI梭菌轉(zhuǎn)化子和原始菌種在不同濃度對丁醇的耐受性。
[0015]圖6至圖7為FaUSPAI轉(zhuǎn)化子和原始菌種發(fā)酵后產(chǎn)物和生長情況。
【具體實施方式】
[0016]實施例1來源于極端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因的合成
[0017]在不改變氨基酸序列的前提下，根據(jù)梭菌特有的密碼子特點，合成源極端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus 的泛應(yīng)急蛋白 FaUSPA 基因(Genbank ZP_05570298.1),設(shè)計引物，并人工合成。引物序列如下，引物長度為60bp左右。
[0018]1.NI10=FAUSPA1-1:Tm=54, 60mer
[0019]GGA, TCC, ATG, AAG, GTC, CTC, GTC, TCC, TAT, GAT, GGT, TCT, GAA, GGT, GCT, AGA, GAA, GCT, CTC, AAG
【權(quán)利要求】
1.一種來源于極端嗜酸菌Ferroplasma acidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因,其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.包含權(quán)利要求1所述的來源于來極端嗜酸菌的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體，其特征在于，所述表達載體是以pS0S94載體為基礎(chǔ)載體，將氯霉素抗性基因表達單元，梭菌CAC3645基因啟動子、權(quán)利要求I所述的FaUSPA基因的閱讀框表達單元和枯草桿菌pyruvate kinase基因終止子定向連接后替換PS0S94載體中的ctfAB及abc表達單元構(gòu)建而成的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體，其特征在于，從PXYP251載體中擴增氯霉素表達單元，引物為 cml:5’ -AAGCTTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’，cm2:5，-TCTAGATATACGAAGATAACTTCGTATAGCATACAT-3，；擴增條件為 94 °C 30s, 60 °C 30s,72°C 60s ；25 循環(huán)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體，其特征在于，從梭菌C.acetobutylicum ATCC824 中擴增 CAC3645 基因啟動子，引物為 c3645z:5’ -TCTAGATAACCTGTAAAAAGATGATGG-3，，c3645f: 5，-GGATCCCTTGTTTCTCCTCTCACTTGA-3 ’。擴增條件為940C 30s, 600C 30s,72°C 30s ;25 循環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求 3或5所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體，其特征在于，所述梭菌CAC3645基因啟動子的堿基序列如SEQ ID N02所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌-梭菌穿梭表達載體,其特征在于,從枯草桿菌Bacillus subtilisl68 中擴增 PYK 基因終止子，引物為 pykl: 5’ -GAGCTCTTACAGGTGAAAATGGAAGGGGA-3’，pyk2:5’ _CATATGTATAGCGGGTAACCCAACGGGATAAGAAGACAGGCGCCG_3’ ；擴增條件為 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 30s ；25 循環(huán)。
8.權(quán)利要求1所述的來源于來極端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因在提高梭菌丁醇耐受性中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的來源于來極端嗜酸菌Ferroplasmaacidarmanus的泛應(yīng)急蛋白FaUSPA基因在提高梭菌丁醇產(chǎn)量中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/21GK103898126SQ201210585227
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】彭日荷, 姚泉洪, 田永生, 趙偉, 付曉燕, 朱波, 許晶, 高建杰, 韓紅娟, 王波, 王麗娟, 韓靜, 薛永 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院