一種醫(yī)用納米復(fù)合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種醫(yī)用納米復(fù)合物，包括：（a）用于分子識別的寡核苷酸或多肽適配體；（b）超順磁氧化鐵納米微粒；（c）生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物載體，用于超順磁氧化鐵納納米粒子和連接用于分子識別的寡苷酸酸或多肽適配體。本發(fā)明使用適配體、超順磁性氧化鐵納米微粒與聚乙二醇、聚己內(nèi)酯和多糖的嵌段共聚物組裝成為的醫(yī)用納米復(fù)合物，利用適配體與靶分子特異性結(jié)合的靶向作用及SPIO納米微粒的磁共振造影特性，通過生物相容性的嵌段共聚物構(gòu)建復(fù)合納米膠束，進入體內(nèi)后，靶向定位微小病灶，通過常規(guī)的核磁共振造影診斷設(shè)備用于體內(nèi)外微小病變的早期靶向定位診斷。本發(fā)明通過選擇合適的靶分子適配體，也可以用于細胞信號傳導(dǎo)、代謝過程、基因檢測、病毒偵測、腫瘤探測等生物研究。
【專利說明】一種醫(yī)用納米復(fù)合物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種醫(yī)用納米復(fù)合物，適用于微小病變定位的早期的輔助治療。
【背景技術(shù)】
[0002]由于當(dāng)前老齡化社會的趨勢和世界范圍內(nèi)人們壽命的延長，人們逐漸意識到如何實現(xiàn)個人健康生活的重要性。相應(yīng)地，人們一直強調(diào)對于諸如癌癥和其它威脅生命的重大疾病早期診斷的必要，因此一直迫切需要開發(fā)一種在認為需要的時候能夠用于早期診斷，并且具備微小病變精確定位的診斷技術(shù)。在此背景下人們一直努力開發(fā)新穎的診斷和治療技術(shù)，應(yīng)用人類基因組計劃所獲得的豐富的生物信息與納米技術(shù)相結(jié)合，將兩者結(jié)合巧妙地用于制造高度敏感及具有精確靶向的生物傳感器件，結(jié)合常規(guī)的核磁共振影像技術(shù)，從而實現(xiàn)體內(nèi)外微小病變的早期靶向定位診斷及其它生物目的研究，如細胞信號傳導(dǎo)、代謝過程等等研究。[0003]SELEX技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種研究核酸結(jié)構(gòu)、功能及進化等的一種新的組合化學(xué)技術(shù)，它不僅在基礎(chǔ)研究、生物篩查等方面均有很好的應(yīng)用，而且在臨床診斷方面顯示了廣闊的前景。通過指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進化技術(shù)體外篩選得到的一組能與目標(biāo)靶分子高親和、高特異性結(jié)合的寡核苷酸系列(單鏈DNA或RNA)，稱為適配體(Aptamer)。作為一類新型的功能分子，適配體克高親和力和高特異性地識別不同的分子。它的親和力和特異性可與抗體相媲美，被認為是“挑戰(zhàn)”抗體地位的一種新型試劑，已在生命科學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域獲得越來越多的應(yīng)用，以不同類型的示蹤分子標(biāo)記適配體后，該類適配體探針可以直觀地將適配體與靶分子的特異性識別轉(zhuǎn)化為靈敏的示蹤信號，從而為靶分子的檢測提供一種靈敏、特異的新型模式，在疾病診斷和治療中發(fā)揮越來越重要的作用。最近Santa-ColomaTA等報道了用IE標(biāo)切換技術(shù)制備的高特異性“monoclonal oligobody (單克隆寡核苷酸適配體)”或 “synthetic oligobody (合成寡核苷酸適配體)” (Bianchini M et al, J.1mmunol, methods, 2001, 252:191-197)可以特異性識別相應(yīng)的蛋白質(zhì),應(yīng)用于蛋白質(zhì)印跡、免疫組化、免疫共沉淀等分析試驗中。相對于適配體，蛋白類抗體的產(chǎn)生和應(yīng)用存在以下限制:病毒性抗原免疫,動物無法產(chǎn)生耐受免疫,免疫原性弱導(dǎo)致抗體難以產(chǎn)生；雜交瘤單克隆抗體，在人體的排異反應(yīng)；抗體生產(chǎn)成本高、費時費力，稀有抗體需要大量篩選才能得到，克隆細胞株需要傳代培養(yǎng)；批間質(zhì)量不均一，需要重新優(yōu)化標(biāo)定，體內(nèi)外識別特異性差異；抗體對溫度敏感，壽命有限，需要低溫保存等缺點。而適配體在體外篩選，特性可依要求設(shè)計改變；動力學(xué)參數(shù)可依照診斷條件的要求而改變；無毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受限制；在體外化學(xué)合成，可以保證時間、質(zhì)量和數(shù)量的特別需要；特異性不受組織或樣品中非靶蛋白的干擾；可以在合成時精確、定點、隨意連接其它功能集團和分子，如巰基、氨基、熒光素、生物素、酶等；比抗體分子小，更適合于體內(nèi)影像診斷和治療；變性和復(fù)性可逆,而且速度快,可反復(fù)使用、長期保存和室溫下運輸。
[0004]目前在影像探針的研究領(lǐng)域，可用作藥物載體的聚合物膠束已受到越來越多的關(guān)注，這些聚合物膠束通過雙親性兩嵌段聚合物在水溶液中自組裝而形成核-殼結(jié)構(gòu)。經(jīng)自組裝形成的聚合物膠束體系具有較低臨界膠束濃度(CMC)、較低藥物毒副作用和較長血液循環(huán)時間等優(yōu)點，是包裹功能性納米粒子如SPIO和量子點燈的良好載體，用于生物成像的研究。聚合物膠束包裹納米粒子所形成的納米復(fù)合物除保留納米粒子原本的磁學(xué)和光學(xué)特性外，還提高了它在體內(nèi)外的生物相容性，尤其突出的是多個磁性納米微?？梢栽谀z束疏水核內(nèi)形成致密的團簇結(jié)構(gòu)，從而在同樣鐵濃度下產(chǎn)生比單個氧化鐵粒子更強的T2效應(yīng)，這一獨特結(jié)構(gòu)是開發(fā)高靈敏度磁共振影像探針的重要基礎(chǔ)。同時兩嵌段聚合物膠束的親水段可以和適配體連接，從而具有了靶向特異性。多糖是一類具有良好生物相容性的天然聚合物，其中葡聚糖、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素和殼聚糖等在藥物和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)中已有廣泛的應(yīng)用。右旋糖酐等葡聚糖因其良好的生物安全性而在臨床上用于血漿替代品，它也是Feridex和Resovist兩種SPIO造影劑得包被材料。但單一的葡聚糖本身并不能夠使疏水性SPIO顆粒在水溶液中穩(wěn)定分散。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供一種醫(yī)用納米復(fù)合物，包括:
Ca)用于分子識別的寡核苷酸或多肽適配體；
(b)超順磁氧化鐵納米微粒；
(c)生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物載體，用于超順磁氧化鐵納納米粒子和連接用于分子識別的輔助治療。
[0006]進一步的，上述寡核苷酸或多肽適配體是篩選可特異性結(jié)合某些靶標(biāo)；具體包括腫瘤、病毒、細菌、信號蛋白、抗原、抗體，核酸、有機小分子、金屬離子及某些特異性細胞等。
[0007]進一步的，上述生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物，是通過縮合反應(yīng)連接分子識別寡核苷酸或多肽適配體，通過乳液揮發(fā)包裹超順磁氧化鐵納米粒子。
[0008]進一步的，基于上述適配體的寡核苷酸或多肽與超順磁氧化鐵納米顆粒在生物相容性嵌段共聚物中組合成為具有靶向功能的納米復(fù)合影像造影劑，利用適配體的靶向識別革巴分子。
[0009]上述靶分子包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、核苷酸、藥物、維生素、有機化合物、無機化合物、細胞、細菌、病毒、腫瘤、信號蛋白、抗原、抗體、金屬離子中的一種或多種組合。
[0010]一種醫(yī)用納米復(fù)合物的應(yīng)用，可用于體內(nèi)、體外靶向定位微小病灶，通過常規(guī)的核磁共振造影診斷設(shè)備用于體內(nèi)外微小病變的早期靶向定位診斷，也可用于細胞信號傳導(dǎo)、代謝過程、基因檢測、病毒偵測、腫瘤探測等生物研究。
具體實施例
[0011]選用葉酸作為靶標(biāo)分子，將葉酸、福氏免疫佐劑、磷脂、膽固醇適量混合研磨制備免疫原,將上述免疫原小鼠大腿、背部皮下多點免疫注射,30-60天后采血檢測葉酸抗體。采小鼠血清提取葉酸抗體，將小鼠抗葉酸抗體用PBS緩沖液稀釋后在合適的溫度條件下包被聚乙烯小孔板。實驗時將葉酸稀釋適量加入已包被抗葉酸抗體的聚乙烯小孔板孵育適當(dāng)時間，用PBS緩沖液清 洗未結(jié)合的游離葉酸分子，真空低溫抽干密封儲存于4°C冰箱備用。
[0012]把約0.5nmol生物素標(biāo)記的隨機ssDNA和上述聚苯乙烯微孔板在500ul含1%BSA的結(jié)合 TE 緩沖液(IOmM Tris-HCl, PH 7.5，ImM EDTA, lmMCaC12, ImM MgCl2)中孵育，輕輕震蕩，4°C過夜。傾去孵育液，然后用0.5 ml TE緩沖液洗滌3次微孔板，然后用7M尿素在94°C反應(yīng)10分鐘洗脫結(jié)合的寡核苷酸，然后用酚/氯仿/異丙醇(25:24:1，PH 8)抽提，洗脫液加入10%糖原后用乙醇沉淀，再進行PCR (95°C預(yù)變性5分鐘后，擴增5個循環(huán):94°C變性1分鐘，55°C退火2分鐘，72°C延伸1分鐘，最后72°C終止延伸5分鐘)，取10 ul上述PCR產(chǎn)物為模板，再次PCR擴增，每3個循環(huán)取樣，選擇PCR產(chǎn)量大，無雜帶的循環(huán)數(shù)為最佳循環(huán)數(shù)，將剩余90ul產(chǎn)物全部擴增。其中一部份以[a -32P] CTP為底物進行PCR，得到的產(chǎn)物與包被不同濃度有葉酸的聚苯乙烯板雜交進行驗證。其余部分通過PCR生成生物素化dsDNA，再拆分為生物素化ssDNA。
[0013]不同濃度葉酸包被微孔板和放射性標(biāo)記的第一輪篩選后的擴增文庫進行點雜交，結(jié)果顯示雜交信號強度隨葉酸濃度增加而增加，表明獲得的標(biāo)記DNA文庫和葉酸有特異的結(jié)合作用。
[0014]將上述雜交方法篩選到與葉酸有強力結(jié)合的次級DNA文庫用尿素-苯酚洗脫抽提純化，通過PCR (95°C預(yù)變性5分鐘后，擴增90個循環(huán):94°C變性1分鐘，55 °C退火2分鐘，72°C延伸1分鐘，最后72°C終止延伸5分鐘)擴增生成生物素化dsDNA，拆分為生物素化ssDNA葉酸寡核苷酸適配體，多克隆寡核苷酸適配體經(jīng)過PCR擴增后，連接與pGEM-T easyVector,然后轉(zhuǎn)染感受態(tài)細胞，挑取3個克隆進行測序。每一個陽性克隆即為一個單克隆寡核苷酸適配體。通過包被葉酸聚苯乙烯微孔板，可以檢測單克隆寡核苷酸適配體的結(jié)合系數(shù)，選擇合適的單克隆寡核苷酸適配體備用。
[0015]將1mmolFe (acac) 3與5mmol 1，2_十六燒醇、3mmol油酸及3mmol油胺混合于1OmL芐醚、氬氣保護下加熱至300°C回流1小時，溶液冷卻至室溫后用甲醇沉淀得到黑色固體，將沉淀回溶于混合了油酸油胺的正己烷中，再用甲醇沉淀，得到的產(chǎn)物產(chǎn)物于正己烷中保存。
[0016]用乳液揮發(fā)法按照聚合物/SP1O等于3的質(zhì)量比，將適量的聚合物和SP1O分散于0.5mL氯仿，并將其加至5mL純水中，用探頭超聲(SON1CS，US)分散，氯仿?lián)]發(fā)后即得到水相中的Dex-g-PCL/SP1O納米復(fù)合物,該納米復(fù)合物的粒度分布和形貌分別通過MalvernNanos1zer粒度儀和掃描電子顯微鏡(H1tach1 S-4800, Janpan)進行表征。
[0017]生物素化ssDNA葉酸寡核苷酸適配體攜帶的生物素與Dex-g-PCL葡聚糖通過縮合反應(yīng)聯(lián)接在一起，通過合適的柱層析純化“適配體-Dex-g-PCL”復(fù)合物。
[0018]適配體-Dex-g-PCL/SP1O納米復(fù)合物制備
將柱層析純化“適配體-Dex-g-PCL”復(fù)合物加按照3:1加入超順磁氧化鐵納米微粒(SP10)，用乳液揮發(fā)法制備復(fù)合物。
[0019]用動態(tài)光散射、磁化強度和T2馳豫效能(relax1v1ty)等參數(shù)來表征膠束的物理特性；通過小鼠肝臟造影來評價該納米復(fù)合材料的體內(nèi)顯影效果；通過靜脈注射造影劑后在不同時間點對肝臟、脾臟進行組織病理學(xué)切片和染色，檢測磁共振造影劑在體內(nèi)的分布、細胞吞嗤及靶向情況。
[0020]本發(fā)明醫(yī)用納米復(fù)合物，利用適配體與靶分子特異性結(jié)合的靶向作用及SP1O納米微粒的磁共振造影特性，通過常規(guī)的核磁共振造影診斷設(shè)備用于體內(nèi)外微小病變的早期靶向定位診斷。本發(fā)明通過選擇合適的靶分子適配體，也可以用于細胞信號傳導(dǎo)、代謝過程、細菌/病毒偵測、分子相互作用等生物研究。[0021]本發(fā)明選擇雙親性葡聚糖作為包裹SPIO納米粒子而形成納米復(fù)合材料，技術(shù)上以聚乙二醇、聚己內(nèi)酯等與多糖合成的嵌段共聚物，形成雙親性的納米膠束，既可以包裹疏水性SPIO納米微粒，同時通過合適的基團與修飾后的適配體聚合反應(yīng)，可以共同組成具有靶向特異性的一種醫(yī)用納米復(fù)合物。
【權(quán)利要求】
1.醫(yī)用納米復(fù)合物，其特征在于， 包括: Ca)用于分子識別的寡核苷酸或多肽適配體； (b)超順磁氧化鐵納米微粒； (c)生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物載體，用于超順磁氧化鐵納納米粒子和連接用于分子識別的寡苷酸酸或多肽適配體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核磁共振影像造影劑，其特征在于，寡核苷酸或多肽適配體是經(jīng)篩選的可特異性結(jié)合靶標(biāo)或特異性細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種核磁共振影像造影劑，其特征在于，所述可特異性結(jié)合靶標(biāo)包括腫瘤、病毒、細菌、信號蛋白、抗原、抗體，核酸、有機小分子或金屬離子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核磁共振影像造影劑，其特征在于，所述生物相容性雙親性葡聚糖嵌段共聚物，是通過縮合反應(yīng)連接分子識別寡核苷酸或多肽適配體，通過乳液揮發(fā)包裹超順磁氧化鐵納米粒子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種核磁共振影像造影劑，其特征在于，所述基于上述適配體的寡核苷酸或多肽與超順磁氧化鐵納米顆粒在生物相容性嵌段共聚物中組合成為具有靶向功能的納米復(fù)合影像造影劑，利用 適配體的靶向識別靶分子。
6.一種如權(quán)利要求1所述的一種醫(yī)用納米復(fù)合物的應(yīng)用，是用于體內(nèi)、體外靶向定位微小病灶、病變的輔助治療。
【文檔編號】C12Q1/68GK103893783SQ201210579872
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】陳亞玲 申請人:上海長征富民金山制藥有限公司