專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的制備死亡素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到用大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)制備死亡素，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
死亡素(thanatin)又稱(chēng)死亡肽，是在昆蟲(chóng)斑腹刺益蝽(Podisus maculiventris)中發(fā)現(xiàn)的，迄今為止在所有已知昆蟲(chóng)抗菌肽中，抗菌譜最廣、抗菌活性最強(qiáng)的抗菌蛋白，由21個(gè)氨基酸殘基組成，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，具有抗腫瘤活性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌和某些真菌都有抑制作用，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞不表現(xiàn)出溶血性。然而，天然抗菌肽在昆蟲(chóng)體內(nèi)含量甚微，分離提純難度大，得率低。而目前的相關(guān)研究表明，采用分子生物學(xué)和基因工程方法在微生物中直接表達(dá)抗菌肽基因，可能造成宿 主微生物自殺而不能獲得表達(dá)產(chǎn)物，且易被蛋白酶降解，近期尚不能直接進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。因此很有必要對(duì)已有的抗菌肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)的修飾加工，或探索一種新型的技術(shù)路線進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)快、遺傳背景清晰、表達(dá)水平高、產(chǎn)物易純化、穩(wěn)定性好、抗污染能力強(qiáng)、適用范圍廣以及成本低的特點(diǎn)，是理想的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明公開(kāi)了一種基于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的制備死亡素的方法。本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案
本發(fā)明提供一種重組基因，包括依次相連的融合伴侶基因序列、甲硫氨酸密碼子、死亡素重復(fù)序列和終止密碼子；死亡素重復(fù)序列由廣15個(gè)死亡素基因串聯(lián)而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而來(lái)。作為優(yōu)選，融合伴侶基因序列前還設(shè)有導(dǎo)肽序列，這樣翻譯出來(lái)的重組蛋白主要積累于宿主的周質(zhì)空間，不會(huì)對(duì)宿主造成傷害。作為優(yōu)選，所述融合伴侶基因序列為多角體蛋白基因從起始密碼子開(kāi)始的90個(gè)堿基序列；融合伴侶的作用是促進(jìn)死亡素的表達(dá)，有利于形成包涵體蛋白。本發(fā)明還提供包含上述重組基因的原核表達(dá)質(zhì)粒。本發(fā)明還提供包含上述原核表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌。本發(fā)明還提供了制備死亡素的方法，包括如下步驟
(1)誘導(dǎo)如上所述的大腸桿菌內(nèi)表達(dá)重組蛋白；
(2)分離純化重組蛋白；
(3)用溴化氰處理，將重組蛋白切割成多個(gè)獨(dú)立完整的死亡素；
(4)分離純化死亡素。本發(fā)明的原理如下
溴化氰具有專(zhuān)一性裂解甲硫氨酸殘基的羧基側(cè)肽鍵的性質(zhì)；由于死亡素C末端的最后一個(gè)氨基酸殘基為甲硫氨酸，內(nèi)部無(wú)甲硫氨酸，另外由于在死亡素重復(fù)序列的5端設(shè)有甲硫氨酸密碼子，故用溴化氰處理重組蛋白能得到多個(gè)獨(dú)立完整的死亡素；而融合伴侶內(nèi)含有甲硫氨酸，因此被切割成多個(gè)小片段，方便與死亡素進(jìn)行分離。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，通過(guò)溴化氰裂解，可一次性獲得多個(gè)獨(dú)立完整的死亡素；為了提高蛋白的表達(dá)量，將死亡素和融合伴侶融合表達(dá)，這為死亡素快速、有效、大量的制備提供了新思路、新途徑，同時(shí)為相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)研究和藥物開(kāi)發(fā)等方面奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)還避免了對(duì)宿主的毒性作用。


圖I為重組蛋白SDS-PAGE檢測(cè)圖，其中，Lane M :低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；Lane I 未誘導(dǎo)空載體；Lane 2 :誘導(dǎo)后空載體；Lane 3 :未誘導(dǎo)重組菌；Lane4 :誘導(dǎo)后重組菌，黑色箭頭所示為重組蛋白。圖2為重組基因全序列圖黑框表示的序列分別為甲硫氨酸密碼子和終止密碼 子，二者之間為5重序基因序列；單下劃線部分為導(dǎo)肽序列，雙下劃線部分為多角體蛋白基因從起始密碼子開(kāi)始的90個(gè)堿基序列。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的具體內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)例I構(gòu)建重組質(zhì)粒
化學(xué)合成重組基因，包括依次相連的導(dǎo)肽序列、多角體蛋白基因從起始密碼子開(kāi)始的90個(gè)堿基序列、甲硫氨酸密碼子、死亡素重復(fù)序列和終止密碼子；死亡素重復(fù)序列由5個(gè)死亡素基因串聯(lián)而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而來(lái)。重組基因序列見(jiàn)SEQID NO : I。將該重組基因裝載于表達(dá)載體，得到重組質(zhì)粒。用Sanger法測(cè)序，以驗(yàn)證重組基因序列的正確性。需要明確說(shuō)明的是，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒的方式有多種，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易做到的，化學(xué)合成重組基因后載入表達(dá)載體只是其中的一種方式而矣；另外，這里采用5個(gè)死亡素基因串聯(lián)，是為了操作、檢測(cè)的方便，以現(xiàn)有技術(shù)來(lái)看，廣15的死亡素基因串聯(lián)都是允許的。
實(shí)驗(yàn)例2誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)及SDS-PAGE檢測(cè)
用IPTG誘導(dǎo)含重組質(zhì)粒的大腸桿菌表達(dá)重組蛋白，分離純化重組蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的大小。如圖I所示，誘導(dǎo)后，重組蛋白表達(dá)非常明顯。分離純化的重組蛋白不包括導(dǎo)肽，導(dǎo)肽完成引導(dǎo)功能后，在大腸桿菌內(nèi)被切除。包含導(dǎo)肽的完整的重組蛋白氨基酸序列見(jiàn)SEQ ID NO 2。
實(shí)驗(yàn)例3用溴化氰處理重組蛋白
用溴化氰處理實(shí)驗(yàn)例2得到的重組蛋白，將重組蛋白切割成多個(gè)獨(dú)立完整的死亡素；分離純化死亡素。
實(shí)驗(yàn)例4檢測(cè)死亡素活性
大腸桿菌抑菌實(shí)驗(yàn)表明實(shí)驗(yàn)例3制備·的死亡素具有強(qiáng)抗菌活性。
權(quán)利要求
1.一種重組基因，其特征在于，包括依次相連的融合伴侶基因序列、甲硫氨酸密碼子、死亡素重復(fù)序列和終止密碼子；死亡素重復(fù)序列由廣15個(gè)死亡素基因串聯(lián)而成，死亡素基因序列由死亡素的氨基酸序列逆推而來(lái)。
2.如權(quán)利要求I所述的重組基因，其特征在于，融合伴侶基因序列前還設(shè)有導(dǎo)肽序列。
3.如權(quán)利要求I所述的重組基因，其特征在于，所述融合伴侶基因序列為多角體蛋白基因從起始密碼子開(kāi)始的90個(gè)堿基序列。
4.含權(quán)利要求f3任一項(xiàng)所述重組基因的原核表達(dá)質(zhì)粒。
5.含權(quán)利要求4所述重組基因的原核表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌。
6.一種制備死亡素的方法，包括如下步驟 (1)誘導(dǎo)如權(quán)利要求5所述的大腸桿菌內(nèi)表達(dá)重組蛋白； (2)分離純化重組蛋白； (3)用溴化氰處理，將重組蛋白切割成多個(gè)獨(dú)立完整的死亡素； (4)分離純化死亡素。
全文摘要
本發(fā)明涉及到用大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)制備死亡素，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明一種重組基因，包括依次相連的融合伴侶基因序列、甲硫氨酸密碼子、死亡素重復(fù)序列和終止密碼子。本發(fā)明還提供含上述重組基因的原核表達(dá)質(zhì)粒以及含該原核表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌。本發(fā)明還提供一種基于大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的制備死亡素的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)誘導(dǎo)上述大腸桿菌表達(dá)重組蛋白；(2)分離純化重組蛋白；(3)用溴化氰處理，將重組蛋白切割成多個(gè)獨(dú)立完整的死亡素；(4)分離純化死亡素。本發(fā)明的創(chuàng)新之處在于，通過(guò)溴化氰裂解，可一次性獲得多個(gè)獨(dú)立完整的死亡素；而且死亡素表達(dá)量高。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102943077SQ201210507640
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者陳利淼, 王濤, 劉云龍, 任飛, 呂正兵 申請(qǐng)人:杭州蠶寶生物技術(shù)有限公司