一種高效溶磷菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種高效溶磷菌及其應(yīng)用，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明提供了一種泛菌Pantoea?sp.，命名為DDC?95，可作為溶磷菌輔助植物生長。該菌株分離自大豆根際，對促進大豆對土壤中難溶的無機磷素吸收利用效果明顯，具有廣闊的應(yīng)用前景和市場價值。
【專利說明】一種高效溶磷菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種高效溶磷菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磷是作物營養(yǎng)三要素之一，我國大部分土地磷元素缺乏，土壤中的磷一般不能滿足作物生長發(fā)育的需要，必須通過施磷肥來補充。但是，磷肥容易被土壤固定，并在土壤中累積，其主要原因是磷肥中的磷酸根離子與土壤中的鈣鎂等陽離子結(jié)合形成難溶性磷酸鹽。因此，長期大量施用磷肥會導(dǎo)致土壤中緩效磷的富集，造成土壤板結(jié)。此外，由于磷肥在土壤中移動性小，肥效轉(zhuǎn)化慢，如果施用方式方法不得當(dāng)，作物將難以及時吸收利用。
[0003]目前我國的磷肥利用率僅為10%-25%。有數(shù)據(jù)顯示,我國自從上個世紀(jì)50年代使用磷肥以來，土壤中累積的難溶性磷已高達6000萬噸，超過目前全國磷肥10年消費量的總和。這一現(xiàn)狀不僅代表了資源的巨大浪費，同時也會引起一系列的環(huán)境問題。因此從自然界中篩選高效溶解無機磷的細菌能夠有效開發(fā)和利用土壤中被固定的磷，提高土壤磷的有效性，減少磷肥的施用量。 [0004]但是現(xiàn)有溶磷菌普遍存在在田間應(yīng)用效果不顯著的問題，其主要原因是目前的研究缺乏針對某一作物種類進行與其相匹配的溶磷菌株的篩選工作。大豆是重要的糧食及油料作物，目前我國大豆生產(chǎn)普遍施用化肥(包括磷肥)，但是與發(fā)達國家相比單產(chǎn)較低，針對這一現(xiàn)狀，篩選出適宜大豆專用的溶磷菌菌株，提高大豆對土壤中磷素的利用率，從而減少磷肥的施用量，對于發(fā)展我國的大豆產(chǎn)業(yè)以及減少環(huán)境污染和能源浪費具有重要的戰(zhàn)略意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種高效溶磷菌。
[0006]所述高效溶磷菌保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCCN0.6302，經(jīng)16SrDNA序列測定及NCBI數(shù)據(jù)庫在線比對，鑒定為泛菌Pantoea sp.，該菌株可輔助植物生長；所述菌株16SrDNA如SEQ ID N0.1所示。
[0007]具體而言，是在土壤中添加0.l_5%Ca3(P04)2，其中優(yōu)選0.5_2%Ca3 (PO4) 2，采用土壤盆栽試驗，種植大豆品種黑河48，于初花期收集大豆根際土壤，通過無機磷培養(yǎng)基篩選出一株具有較強溶解無機磷功能的促生菌DDC 95。
[0008]所述黑河48為國審?fù)ㄟ^的早熟大豆品種，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黑河分院選育，該品種適宜在黑龍江省第三積溫帶下限和第四積溫帶春播種植。
[0009]該菌株分離方法為平板篩選法，將大豆根際土壤制成土壤懸液，稀釋成KT1-KT7濃度梯度，取100μ I KT5-1O-7稀釋度的土壤懸液涂于解無機磷培養(yǎng)基平板上，28°c培養(yǎng)4-5天后，觀察菌落周圍有無溶磷圈產(chǎn)生，并測量菌落及溶磷圈直徑。IL無機磷培養(yǎng)基的成分為:(NH4)2SO40.5g，MgSO4.7H20 0.3g，Ca3(PO4)2IOg, NaCl 0.3g，葡萄糖 10g，MnSO4 (1%)ImL, FeSO4 (1%) ImL,瓊脂 20g。[0010]從平板中挑選具有較強溶解無機磷能力的菌株，富集培養(yǎng)后，稀釋菌體并涂布于無機磷培養(yǎng)基平板上，其中Ca3(PO4)2為2%，觀察菌落周圍有無溶磷圈產(chǎn)生，并測量菌落及溶磷圈直徑，從中篩選具有較強溶解無機磷能力的菌株。
[0011]重復(fù)上述步驟直至Ca3(PO4)2濃度達到5%，最終篩選得到一株具有較強溶解無機磷能力的菌株，對該菌株進行16SrDNA測定，序列如SEQ ID N0.1所示，鑒定該菌株為泛菌Pantoeasp.0
[0012]上述菌株命名為DDC 95，已于2012年6月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6302，建議分類命名為泛菌Pantoea sp.地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，部分16SrDNA序列如SEQIDN0.1 所示。
[0013]該菌為革蘭氏陰性，顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，菌體平均長度3_4μπι，平均寬度0.4-0.5 μ m, DDC 95在解無機磷固體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上均生長良好，28°C培養(yǎng)4-5天，菌落直徑可達3-4mm，菌落呈圓形，邊緣整齊，顏色呈乳黃色，表面較干，菌落中心呈扁平圓形突起，略高于菌落邊緣。
[0014]該菌株在添加5%Ca3 (PO4) 2培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，菌落直徑為0.3~0.5cm,溶磷圈直徑為0.54~2.10cm，溶磷比為1.8~4.2。
[0015]為進一步確定菌株的溶解無機磷的能力，通過鑰銻抗比色法測定菌液的溶磷量。首先將一環(huán)菌體接種于5mL解無機磷液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)7天。通過鑰銻抗顯色法制做含磷量分別為0.0、0.3,0.6,0.9,1.2,1.5、1.8mg/L標(biāo)準(zhǔn)磷溶液系列，通過紫外分光光度計測定OD72tl的吸光度，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的二元一次方程為:Y=0.056IX-0.0527，R2=0.9995。將培養(yǎng)好的菌液超聲波破碎細胞20min, 4000rpm離心20min，取上清3mL，加2滴2，6- 二硝基酚作指示劑，加I滴50mL/L硫酸調(diào)節(jié)pH值，加5mL鑰銻抗顯色劑，定容到50mL，室溫下顯色30min。同時以不接菌的解無機磷液體培養(yǎng)基為空白對照，同樣方法制備顯色。由于測定的吸光度大于0.676，超出了測定范圍，因此將樣品稀釋10倍，再次測定吸光度在磷標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的吸光值范圍之內(nèi)，將結(jié)果代入方程，乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，并扣除空白對照中有效磷的含量，最終求得菌液的溶磷量為936.19mg/L。
[0016]為了獲得菌株的最佳生長條件，通過正交實驗得到了優(yōu)化培養(yǎng)基為麥芽糖6g/L、尿素 0.04g/L、NaCl 4g/L、pH 6，在 28。C 下培養(yǎng) 48h 菌落總數(shù)可達 7.23X 109CFU/mL。
[0017]本發(fā)明還提供了所述菌株在土壤治理中的應(yīng)用，將CGMCC N0.6302發(fā)酵液以
0.1%-10%的比例投放于添加0.1%_5%磷酸三鈣的土壤中。
[0018]優(yōu)選方法是:是將發(fā)酵液以1%的比例投放于添加1%磷酸三鈣的土壤中，定期澆水，保持土壤濕潤，經(jīng)過20天后，測定土壤中有效磷的含量從不接菌時的57.78mg/kg，增加到 383.89mg/kg。
[0019]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:該菌株為革蘭氏陰性細菌，培養(yǎng)條件及方法簡便易行。菌株溶磷量非常高，該菌株分離自大豆根際，對促進大豆對土壤中難溶的無機磷素吸收利用效果明顯。具有廣闊的應(yīng)用前景和市場價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1DDC 95在解無機磷培養(yǎng)基上的溶磷圈[0021]圖2革蘭氏染色后在100倍油鏡下觀察DDC 95菌體情況
【具體實施方式】
[0022]實施例1
[0023]在土壤中添加l%Ca3(P04)2，采用土壤盆栽試驗，種植大豆品種黑河48，于初花期收集大豆根際土壤，將大豆根際土壤制成土壤懸液，稀釋成KT1-KT7濃度梯度，取100 μ 110_5-10_7稀釋度的土壤懸液涂于無機磷培養(yǎng)基平板上，28 0C培養(yǎng)4-5天后，觀察菌落周圍有無溶磷圈產(chǎn)生，并測量菌落及溶磷圈直徑。IL解無機磷培養(yǎng)基的成分為:(NH4)2SO40.5g, MgS04.7Η200.3g, Ca3 (PO4)2IOg, NaCl 0.3g，葡萄糖 IOg, MnSO4 (1%) ImL,FeSO4 (1%) lmL，瓊脂 20g。
[0024]從平板中挑選具有較強溶解無機磷能力的菌株，富集培養(yǎng)后，稀釋菌體并涂布于無機磷培養(yǎng)基平板上，其中Ca3(PO4)2為2%，觀察菌落周圍有無溶磷圈產(chǎn)生，并測量菌落及溶磷圈直徑，從中篩選具有較強溶解無機磷能力的菌株。
[0025]重復(fù)上述步驟直至Ca3(PO4)2濃度達到5%，篩選到一株革蘭氏陰性菌。
[0026]實施例2
[0027]篩選到一株革蘭氏陰性菌，顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，菌體平均長度3-4 μ m,平均寬度0.4-0.5 μ m，命名為DDC 95，該菌在解無機磷固體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上均生長良好，28°C培養(yǎng)4-5天，菌落直徑可達3-4mm，菌落呈圓形，邊緣整齊，顏色呈乳黃色，表面較干，菌落中心呈扁平圓形突起，略高于菌落邊緣。
[0028]經(jīng)鑒定該菌株為泛菌Pantoea sp.,已于2012年6月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.6302，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，部分16SrDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0029]所述菌株部分16S rDNA序列擴增所用引物序列為(5’ to3’):799F(AACMGGATTAGATACCCKG)和 1492R (TACGGHTACCTTGTTACGACTT)。
[0030]實施例3
[0031]通過正交實驗得到了優(yōu)化培養(yǎng)基為麥芽糖6g/L、尿素0.04g/L、NaCl 4g/L、pH6，在 28。C 下培養(yǎng) 48h 待菌落數(shù)為達 7.23X 109CFU/mL，在 6X 109-8X 109CFU/mL 之間。
[0032]實施例4
[0033]將發(fā)酵液(菌落數(shù)為達7.23X 109CFU/mL)以1%的比例投放于添加1%磷酸三鈣的土壤中，定期澆水，保持土壤濕潤，經(jīng)過20天后，測定土壤中有效磷的含量從不接菌時的57.78mg/kg,增加至Ij 383.89mg/kg。
[0034]實施例5
[0035]通過土壤盆栽試驗對大豆品種黑河48接種1%的DDC 95菌體發(fā)酵液，苗期、初花期、結(jié)莢期分別取樣，接菌處理和不接菌處理各取5株，將其根、莖、葉分別在105°C下殺青30min, 75°C下烘干至恒重后稱重，計算植株生物量。根、莖、葉分別粉碎后用H2SO4-H2O2消煮，鑰銻抗比色法測定植株全磷含量。
[0036]試驗結(jié)果表明，接種DDC 95菌體發(fā)酵液后，大豆植株根、莖、葉的生物量較不接菌的對照都有明顯增加，且差異達到顯著水平(p〈0.05)。植株全磷含量為1.23%，較對照增加了 65.3%，且顯著高于對照(P〈0.05)。[0037]序列表
[0038]〈110〉黑龍江省大豆技術(shù)開發(fā)研究中心
[0039]〈120〉一種高效溶磷菌及其應(yīng)用
[0040]<160>1
[0041]<170>PatentIn version 3.3
[0042]<210>1
[0043]<211>678
[0044]<212>DNA
[0045]〈213〉泛菌 Pantoea sp.[0046]〈220〉
[0047]<223>16SrDNA
[0048]〈400〉I
[0049]ccttggaggt tgttcccttg aggagtggct tccggagcta acgcgttaag tcgaccgcct 60
[0050]ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg 120
[0051]gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctactcttga catccacgga 180
[0052]attcggcaga gatgccttag tgccttcggg aaccgtgaga caggtgctgc atggctgtcg 240
[0053]tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcctttg 300
[0054]ttgccagcga ttcggtcggg aactcaaagg agactgccgg tgataaaccg gaggaaggtg 360
[0055]gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gagtagggct acacacgtgc tacaatggcg 420
[0056]catacaaaga gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc acaaagtgcg tcgtagtccg 480
[0057]gatcggagtc tgcaactcga ctccgtgaag tcggaatcgc tagtaatcgt ggatcagaat 540
[0058]gccacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt 600
[0059]tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gagggcgctt accactttgt gattcatgac 660
[0060]tggggtgaag tcgtacgg678
【權(quán)利要求】
1.一種高效溶磷菌，其特征在于，所述菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC N0.6302。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶磷菌，其特征在于，所述菌株總DNA經(jīng)引物799F，1492R擴增后獲得16SrDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述溶磷菌，其特征在于，所述菌株為革蘭氏陰性，顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，菌體平均長度3-4 μ m,平均寬度0.4-0.5 μ m,在解無機磷固體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上均生長良好，28°C培養(yǎng)4-5天，菌落直徑可達3-4mm，菌落呈圓形，邊緣整齊，顏色呈乳黃色，表面較干，菌落中心呈扁平圓形突起，略高于菌落邊緣。
4.一種權(quán)利要求1所述溶磷菌的應(yīng)用方法，其特征在于，將CGMCC N0.6302發(fā)酵液以0.1%-10%的比例投放于添加0.1%-5%磷酸三鈣的土壤中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，CGMCCN0.6302的培養(yǎng)基成分如下:麥芽糖6g/L、尿素 0.04g/L、NaCl 4g/L、pH 6。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，CGMCCN0.6302的培養(yǎng)條件為:28。C下培養(yǎng) 48h。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，所述發(fā)酵液中菌落數(shù)為6X IO9-S X IO9CFU/mLo
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述方法，其特征在于，具體方法如下:
1)CGMCC N0.6302 在 28。C 下培養(yǎng) 48h 至菌落數(shù)達到 6 X 109-8 X 109CFU/mL ； 2)CGMCC N0.6302的發(fā)酵液以0.1%-10%的比例投放于添加0.1%_5%磷酸三鈣的土壤中。
【文檔編號】C12R1/01GK103834584SQ201210483143
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月23日
【發(fā)明者】王浩, 王紹東, 李遠明, 姜研, 劉偉, 李宏偉 申請人:黑龍江省大豆技術(shù)開發(fā)研究中心