專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，屬于工業(yè)生物技術(shù)，發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
阿維拉霉素又稱卑霉素、阿美拉霉素，是一種新型消化促進劑或代謝調(diào)節(jié)劑，是由產(chǎn)綠鏈霉菌(Sir<9/7 ο焊Ce1S viridocbromogene)發(fā)酵產(chǎn)生的Orthosomycin (寡糖類)抗生素二氯異扁枝衣酸酯，通過與細菌核糖體結(jié)合來抑制蛋白質(zhì)的合成，是一種特殊的蛋白質(zhì)合成抑制劑。阿維拉霉素為中性，呈無色針狀結(jié)晶，熔點為181 182°C，微溶于水，易溶于丙酮、丙醇、乙酸乙酯、苯和乙醚等有機溶劑中。阿維拉霉素約有A、A,、B、C、D1、D2、E、F、
G、H、I、J、K等十多個組分，其中A組分活性最高。 阿維拉霉素主要抑制革蘭陽性菌，對革蘭陰性菌效果較差，具有穩(wěn)定而良好的促生長和預(yù)防動物疾病的雙重效果，安全性高、殘留極低、無交叉耐藥性、對環(huán)境無影響等優(yōu)點，能夠提高豬和肉雞的平均日增重。眾多的國家和地區(qū)如拉丁美洲、亞洲和歐洲均允許將阿維拉霉素作為一種抗菌促生長劑添加于豬雞飼料中。目前，阿維拉霉素主要采用傳統(tǒng)的斜面培養(yǎng)，接種環(huán)挖塊接種搖瓶，搖瓶再接種子罐工藝，制種工藝繁瑣，菌種容易退化，發(fā)酵結(jié)果不穩(wěn)定，穩(wěn)定性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，通過對傳統(tǒng)工藝改進，優(yōu)化制種工藝，用液氮保存種子液，可以大量的保存一株高產(chǎn)菌種，省去了不斷制種過程，節(jié)約了成本，而且發(fā)酵穩(wěn)定性高，生產(chǎn)成本低，使阿維拉霉素產(chǎn)量高，效價可達到6500μ g/ml以上,且30天后效價保持更穩(wěn)定,效價活力較優(yōu)。一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，技術(shù)方案如下
(O制備斜面孢子
將在北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院購買的MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌，菌株保藏編號為1A01659，接種到斜面培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)得到斜面孢子，斜面表面充滿灰白色至微灰色孢子；
(2)制備凍存種子液
a、將上述斜面孢子接種到IOOml種子培養(yǎng)基中，接種量為O.2-0. 8 X IO7個孢子，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間24-36h，得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的20-30%V/V ；
b、在上述得到的種子液中加入等體積質(zhì)量分數(shù)為40%的甘油水溶液，混勻制成甘油種子液，分裝在凍存管中在液氣中保存、待用；
(3)種子培養(yǎng)將凍存種子液按O.02%V/V接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的20-30%V/V ；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾，菌絲體用甲醇浸提，浸提液濃縮后結(jié)晶得到阿維拉晶體。其中，斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉20.0，KNO3 I. O，K2HPO4O. 5，CaCl2 2. O,瓊脂30. O,培養(yǎng)基pH7. 0-7. 2 ;培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)周期6_8天。其中，種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :黃豆餅粉15. 0，酵母粉25. 0，葡萄糖5. 0，糊精 20. O, CaCl22. O, CaCO3L O, ρΗ7· 0-7. 2 ;培養(yǎng)溫度 28°C，通氣量 1:1-1:1, lvvm,轉(zhuǎn)速 150-200rpm，培養(yǎng)時間 24_36h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L:玉米淀粉40.0g/l，葡萄糖20.0g/l，黃豆餅粉 10. O g/1, CaCl2 2.0 g/1, CaCO3 4.0 g/1, NaCl 1.0 g/1，ρΗ7· 2_7· 4 ;培養(yǎng)溫度27. 5-28. 5°C，通氣比 1:0. 5-1:1. lvvm，罐壓 O. 05-0. lOMPa，轉(zhuǎn)速80_150rpm培養(yǎng)200_240h。MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌的信息來自于http://www. mum800. com/p_32/p_36632. html。 具體信息如下
菌株保藏編號* (2) 1A01659 中文名稱(3)產(chǎn)綠色鏈霉菌 屬名 * (4) Streptomyces 種名加詞(5) viridochromogenes 原產(chǎn)國(10)中國 模式菌株*(12)非模式菌株 主要用途*(13)分類，研究 生物危害程度*(16) 不清楚 培養(yǎng)基編號* (23) 0012 培養(yǎng)溫度* (24) 28 0C
機構(gòu)名稱* (28) 中國海洋微生物菌種保藏管理中心 機構(gòu)名稱縮寫(29) MCCC
隸屬單位名稱* (30)國家海洋局第三海洋研究所 資源保藏類型* (31)培養(yǎng)物
保存方法* (32) 液氮超低溫凍結(jié)法，-80°C冰箱凍結(jié)法，真空冷凍干燥法。本方法簡單易行，一次制備菌種，可長期使用，并且減少了染菌風險；接種量容易控制，發(fā)酵結(jié)果穩(wěn)定，大幅度提高了阿維拉霉素的生產(chǎn)水平，降低了生產(chǎn)成本；種子液在液氮中冷凍保存，降低了種子變異幾率，不用在頻繁的進行菌種分純復(fù)壯；生產(chǎn)過程綠色環(huán)保，產(chǎn)品生物活性高，無交叉耐藥性，無殘留，可有效的促進動物生長和預(yù)防動物疾病。
具體實施例方式 實施例I:
一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，技術(shù)方案如下
(O制備斜面孢子
將在北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院購買的MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌，菌株保藏編號為1A01659，接種到斜面培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)得到斜面孢子，斜面表面充滿灰白色至微灰色孢子；
(2)制備凍存種子液a、將上述斜面孢子接種到IOOml種子培養(yǎng)基中，接種量為O.2X IO7個孢子，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間24h，得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的20%V/V ；
b、在上述得到的種子液中加入等體積質(zhì)量分數(shù)為40%的甘油水溶液，混勻制成甘油種子液，分裝在凍存管中在液氣中保存、待用；
(3)種子培養(yǎng)將凍存種子液按O.02%V/V接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的20%V/V ；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾，菌絲體用甲醇浸提，浸提液濃縮后結(jié)晶得到阿維拉晶體。其中，斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉20.0，KNO3 I. O，K2HPO4 O. 5，CaCl2 2. O,瓊脂30. O,培養(yǎng)基pH7. O ;培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)周期6天。其中，種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :黃豆餅粉15. 0，酵母粉25. 0，葡萄糖5. 0，糊精 20. O, CaCl22. O, CaCO3L O, ρΗ7· O ;培養(yǎng)溫度 28°C，通氣量 l:lvvm，轉(zhuǎn)速 150rpm,培養(yǎng)時間24h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉40. 0，葡萄糖20. 0，黃豆餅粉 10. O, CaCl2 2. O, CaCO3 4. O, NaCl I. O, ρΗ7· 2 ;培養(yǎng)溫度 27. 5°C，通氣比 1:0. 5vvm，罐壓 O. 05MPa,轉(zhuǎn)速 80rpm 培養(yǎng) 200h。實施例2:
一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，技術(shù)方案如下
(O制備斜面孢子
將在北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院購買的MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌，菌株保藏編號為1A01659，接種到斜面培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)得到斜面孢子，斜面表面充滿灰白色至微灰色孢子；
(2)制備凍存種子液
a、將上述斜面孢子接種到IOOml種子培養(yǎng)基中，接種量為O.5X IO7個孢子，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間30h，得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的25%V/V ；
b、在上述得到的種子液中加入等體積質(zhì)量分數(shù)為40%的甘油水溶液，混勻制成甘油種子液，分裝在凍存管中在液氣中保存、待用；
(3)種子培養(yǎng)將凍存種子液按O.02%V/V接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的25%V/V ；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾，菌絲體用甲醇浸提，浸提液濃縮后結(jié)晶得到阿維拉晶體。其中，斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉20.0，KNO3 I. O，K2HPO4O. 5，CaCl2 2. O,瓊脂30. O,培養(yǎng)基pH7. I ;培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)周期7天。其中，種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :黃豆餅粉15.0，酵母粉25.0，葡萄糖 5. 0，糊精 20. O, CaCl22. O, CaCO3L O, ρΗ7· I ;培養(yǎng)溫度 28°C，通氣量 1:1. 05vvm，轉(zhuǎn)速175rpm，培養(yǎng)時間30h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉40. 0，葡萄糖20. 0，黃豆餅粉 10. O, CaCl2 2. O, CaCO3 4. O, NaCl I. O, ρΗ7· 3 ;培養(yǎng)溫度 28. 0°C，通氣比 1:0. 8vvm，罐壓 O. 07MPa,轉(zhuǎn)速 120rpm 培養(yǎng) 220h。實施例3
一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，技術(shù)方案如下
(O制備斜面孢子
將在北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院購買的MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌，菌株保藏編號為1A01659，接種到斜面培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)得到斜面孢子，斜面表面充滿灰白色至微灰色孢子；
(2)制備凍存種子液
a、將上述斜面孢子接種到IOOml種子培養(yǎng)基中，接種量為0.8X107個孢子，培養(yǎng)溫度 28°C，培養(yǎng)時間36h，得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的30%V/V ；
b、在上述得到的種子液中加入等體積質(zhì)量分數(shù)為40%的甘油水溶液，混勻制成甘油種子液，分裝在凍存管中在液氣中保存、待用；
(3)種子培養(yǎng)將凍存種子液按O.02%V/V接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的30%V/V ；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾，菌絲體用甲醇浸提，浸提液濃縮后結(jié)晶得到阿維拉晶體。其中，斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉20.0，KNO3 I. O，K2HPO4O. 5，CaCl2 2. O,瓊脂30. O,培養(yǎng)基pH7. 2 ;培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)周期8天。其中，種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :黃豆餅粉15. 0，酵母粉25. 0，葡萄糖
5.0，糊精 20. 0，CaCl22. 0，CaCO3L O, ρΗ7· 2 ;培養(yǎng)溫度 28°C，通氣量 I: I. lvvm,轉(zhuǎn)速 200rpm,培養(yǎng)時間36h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉40. 0，葡萄糖20. 0，黃豆餅粉 10. O, CaCl2 2. O, CaCO3 4. O, NaCl I. O, ρΗ7· 4 ;培養(yǎng)溫度 28. 5°C，通氣比 1:1. lvvm，罐壓 O. IOMPa,轉(zhuǎn)速 150rpm 培養(yǎng) 240h。實施例4
一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，技術(shù)方案如下
(O制備斜面孢子
將在北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院購買的MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌，菌株保藏編號為1A01659，接種到斜面培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)得到斜面孢子，斜面表面充滿灰白色至微灰色孢子；
(2)制備凍存種子液
a、將上述斜面孢子接種到IOOml種子培養(yǎng)基中，接種量為O.3X IO7個孢子，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間20h，得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的28%V/V ；
b、在上述得到的種子液中加入等體積質(zhì)量分數(shù)為40%的甘油水溶液，混勻制成甘油種子液，分裝在凍存管中在液氣中保存、待用；
(3)種子培養(yǎng)將凍存種子液按O.02%V/V接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的22%V/V ；(4)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾，菌絲體用甲醇浸提，浸提液濃縮后結(jié)晶得到阿維拉晶體。其中，斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉18.0，KNO3 I. O，K2HPO4O. 4，CaCl2 1.5，瓊脂25. O,培養(yǎng)基ρΗ6· 8 ;培養(yǎng)溫度25°C，培養(yǎng)周期5天。其中，種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :黃豆餅粉13. 0，酵母粉20. 0，葡萄糖
4.0，糊精 18. 0，CaCl22. 0，CaCO3L 0,ρΗ6· 8 ;培養(yǎng)溫度 25°C，通氣量 I: O. 8vvm，轉(zhuǎn)速 130rpm,培養(yǎng)時間20h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉38. 0，葡萄糖18. 0，黃豆餅粉 10. 0，CaCl2 2. O g/1, CaCO3 4. O g/1, NaCl I. O g/1, ρΗ7· O ;培養(yǎng)溫度 27°C，通氣比I: O. 3vvm,罐壓 O. 03MPa,轉(zhuǎn)速 50rpm 培養(yǎng) 180h。 實施例5
一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，技術(shù)方案如下
(O制備斜面孢子
將在北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院購買的MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌，菌株保藏編號為1A01659，接種到斜面培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)得到斜面孢子，斜面表面充滿灰白色至微灰色孢子；
(2)制備凍存種子液
a、將上述斜面孢子接種到IOOml種子培養(yǎng)基中，接種量為0.6X107個孢子，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間38h，得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的27%V/V ；
b、在上述得到的種子液中加入等體積質(zhì)量分數(shù)為40%的甘油水溶液，混勻制成甘油種子液，分裝在凍存管中在液氣中保存、待用；
(3)種子培養(yǎng)將凍存種子液按O.02%V/V接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的25%V/V ；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾，菌絲體用甲醇浸提，浸提液濃縮后結(jié)晶得到阿維拉晶體。其中，斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉25.0，KNO3 I. O，K2HPO4O. 8，CaCl2 2. 5，瓊脂35. O,培養(yǎng)基ρΗ7· 3 ;培養(yǎng)溫度30°C，培養(yǎng)周期9天。其中，種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :黃豆餅粉18. 0，酵母粉28. 0，葡萄糖
6.0，糊精 25. O, CaCl22. O, CaCO3L O, ρΗ7· 3 培養(yǎng)溫度 28°C，通氣量 I: I. 3vvm,轉(zhuǎn)速 220rpm,培養(yǎng)時間38h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉43. 0，葡萄糖23. 0，黃豆餅粉 12. 0，CaCl2 2. 5，CaCO3 5. O, NaCl I. O, ρΗ7· 5 ;培養(yǎng)溫度 30°C，通氣比 1:1. 3vvm，罐壓
O.15MPa，轉(zhuǎn)速 180rpm 培養(yǎng) 250h。實施例6
一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，技術(shù)方案如下
(O制備斜面孢子
將在北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院購買的MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌，菌株保藏編號為1A01659，接種到斜面培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)得到斜面孢子，斜面表面充滿灰白色至微灰色孢子；
(2)制備凍存種子液
a、將上述斜面孢子接種到IOOml種子培養(yǎng)基中，接種量為O.5X IO7個孢子，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間28h，得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的24%V/V ；
b、在上述得到的種子液中加入等體積質(zhì)量分數(shù)為40%的甘油水溶液，混勻制成甘油種子液，待用；
(3)種子培養(yǎng)將種子液按O.02%V/V接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的28%V/V ；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾，菌絲體用甲醇浸提，浸提液濃縮后結(jié)晶得到阿維拉晶體。其中，斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉20.0，KNO3 I. O，K2HPO4
O.5，CaCl2 2. O,瓊脂30. O,培養(yǎng)基pH7. O ;培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)周期7天。其中，種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :黃豆餅粉15. 0，酵母粉25. 0，葡萄糖
5.0，糊精 20. 0，CaCl22. 0，CaCO3L O, ρΗ7· 2 ;培養(yǎng)溫度 28°C，通氣量 I: I. lvvm,轉(zhuǎn)速 160rpm,培養(yǎng)時間32h。其中，發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉40. 0，葡萄糖20. 0，黃豆餅粉 10. O, CaCl2 2. O, CaCO3 4. O, NaCl I. O, ρΗ7· 3 ;培養(yǎng)溫度 27. 5°C，通氣比 1:0. 8vvm，罐壓 O. 07MPa,轉(zhuǎn)速 IOOrpm 培養(yǎng) 230h。實施例7
MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌的信息來自于http://www. mum800. com/p_32/p_36632.html。具體信息如下
菌株保藏編號* (2) 1A01659 中文名稱(3)產(chǎn)綠色鏈霉菌 屬名 * (4) Streptomyces 種名加詞(5) viridochromogenes 原產(chǎn)國(10)中國 模式菌株*(12)非模式菌株 主要用途*(13)分類，研究 生物危害程度*(16) 不清楚 培養(yǎng)基編號* (23) 0012 培養(yǎng)溫度* (24) 28 0C
機構(gòu)名稱* (28) 中國海洋微生物菌種保藏管理中心 機構(gòu)名稱縮寫(29) MCCC
隸屬單位名稱* (30)國家海洋局第三海洋研究所 資源保藏類型* (31)培養(yǎng)物
保存方法* (32) 液氮超低溫凍結(jié)法，-80°C冰箱凍結(jié)法，真空冷凍干燥法。
實施例1-6得到的發(fā)酵液用HPLC方法檢測，檢測條件如下
色譜柱5 μ m, 250X4.6 mm Hypersil GOLD C18 ；
進樣量20 ul ；
流動相乙腈0. 2% (g/ml)磷酸二氫銨溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0)=51:49 ；
檢測波長:214 nm ；
溫度35°C ；
流速1 ml/min ；
理論板數(shù)按阿維拉霉素A峰計算應(yīng)不低于2500，阿維拉霉素A峰和B峰的分離度應(yīng)大于6. 0，阿維拉霉素A峰的拖尾因子應(yīng)小于I. 4 ；
標準溶液的配制取60°C真空干燥3小時的阿維拉霉素標準品適量(約相當于阿維拉霉素40mg)，置IOOml容量瓶中，加丙酮IOml使溶解，用流動相稀釋至刻度，搖勻。樣品的處理量取5ml發(fā)酵液置于25ml容量瓶中，加入IOml丙酮,超聲處理25分鐘，冷卻，用流動相稀釋至刻度，搖勻，過濾進樣。檢測結(jié)果如下表所示
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，其特征為技術(shù)方案如下 (O制備斜面孢子； (2)制備凍存種子液； (3)種子培養(yǎng); (4)發(fā)酵培養(yǎng)。
2.一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，其特征為技術(shù)方案如下 (O制備斜面孢子 將在北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院購買的MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌，菌株保藏編號為1A01659，接種到斜面培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)得到斜面孢子，斜面表面充滿灰白色至微灰色孢子； (2)制備凍存種子液 a、將上述斜面孢子接種到IOOml種子培養(yǎng)基中，接種量為O.2-0. 8 X IO7個孢子，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間24-36h，得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的20-30%V/V ； b、在上述得到的種子液中加入等體積質(zhì)量分數(shù)為40%的甘油水溶液，混勻制成甘油種子液，分裝在凍存管中在液氣中保存、待用； (3)種子培養(yǎng)將凍存種子液按O.02%V/V接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的20-30%V/V ； (4)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)； 發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾，菌絲體用甲醇浸提，浸提液濃縮后結(jié)晶得到阿維拉晶體。
3.一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，其特征為技術(shù)方案如下 (O制備斜面孢子 將在北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院購買的MCCC1A01659-產(chǎn)綠色鏈霉菌，菌株保藏編號為1A01659，接種到斜面培養(yǎng)基中，進行斜面培養(yǎng)得到斜面孢子，斜面表面充滿灰白色至微灰色孢子； (2)制備凍存種子液 a、將上述斜面孢子接種到IOOml種子培養(yǎng)基中，接種量為O.5X IO7個孢子，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間30h，得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的25%V/V ； b、在上述得到的種子液中加入等體積質(zhì)量分數(shù)為40%的甘油水溶液，混勻制成甘油種子液，分裝在凍存管中在液氣中保存、待用； (3)種子培養(yǎng)將凍存種子液按O.02%V/V接到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到種子液，種子液中固形物占種子液總量的25%V/V ； (4)發(fā)酵培養(yǎng)按5%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)； 發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液過濾，菌絲體用甲醇浸提，浸提液濃縮后結(jié)晶得到阿維拉晶體。
4.如權(quán)利要求2所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，其特征為斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉20. O, KNO3 I. O, K2HPO4 O. 5，CaCl2 2. 0，瓊脂30. 0，培養(yǎng)基PH7. 0-7. 2 ;培養(yǎng)溫度28 °C，培養(yǎng)周期6-8天。
5.如權(quán)利要求2所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，其特征為種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :黃豆餅粉15. O,酵母粉25. O,葡萄糖5. 0，糊精20. O, CaCl22. 0，CaCO3L O, ρΗ7· 0-7. 2 ;培養(yǎng)溫度 28°C，通氣量 1:1-1:1. lvvm，轉(zhuǎn)速 150_200rpm，培養(yǎng)時間24-36h。
6.如權(quán)利要求2所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，其特征為發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L:玉米淀粉40. Og/Ι，葡萄糖20. Og/Ι，黃豆餅粉10. O g/1，CaCl22.O g/1，CaCO3 4. O g/1，NaCl I. O g/1，ρΗ7· 2_7· 4 ;培養(yǎng)溫度 27. 5-28. 5 °C，通氣比I: O. 5-1:1, lvvm,罐壓 O. 05-0. IOMPa,轉(zhuǎn)速 80_150rpm 培養(yǎng) 200_240h。
7.如權(quán)利要求3所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，其特征為斜面培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉20. O, KNO3 I. O, K2HPO4 O. 5，CaCl2 2. 0，瓊脂30. 0，培養(yǎng)基PH7. I ;培養(yǎng)溫度28 °C，培養(yǎng)周期7天。
8.如權(quán)利要求3所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，其特征為種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :黃豆餅粉15. O,酵母粉25. O,葡萄糖5. O,糊精20. O, CaCl22. 0，CaCO3L O, ρΗ7· I ;培養(yǎng)溫度 28°C，通氣量 I: I. 05vvm,轉(zhuǎn)速 175rpm,培養(yǎng)時間 30h。
9.如權(quán)利要求3所述的一種發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，其特征為發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件及成分為g/L :玉米淀粉40. O,葡萄糖20. 0，黃豆餅粉10. O, CaCl2 2. O, CaCO3 4. 0，NaCl I. O, ρΗ7· 3 ;培養(yǎng)溫度 28. (TC，通氣比 1:0. 8vvm,罐壓 O. 07MPa,轉(zhuǎn)速 120rpm 培養(yǎng)220h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)阿維拉霉素的方法，包括以下步驟制備,產(chǎn)綠鏈霉菌的帶孢子斜面，將斜面孢子接種子瓶培養(yǎng)得到種子液，種子液在液氮下保存；將凍存種子液接種到種子培養(yǎng)基中進行種子培養(yǎng)得到種子液；按5wt%的接種量將種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵后的發(fā)酵液進一步處理得到阿維拉霉素的晶體。本方法簡單易行，省去了繁瑣的制種過程，減少了菌種衰退，降低了染菌風險；接種量容易控制，重復(fù)性好，發(fā)酵結(jié)果穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低。發(fā)酵結(jié)果比傳統(tǒng)工藝有所提高，阿維拉霉素產(chǎn)量可以達到6500μg/ml以上。
文檔編號C12P19/60GK102936608SQ20121046914
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者韓風華, 李國棟, 鄒君彪, 鄧健, 黃苓 申請人:江西興鼎科技有限公司