專利名稱：一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)。
技術(shù)背景
實(shí)體瘤是腫瘤疾病中的主要種類，是威脅人類健康的一種重要疾病。關(guān)于實(shí)體瘤的起源，目前存在著兩種不同的模型。一種模型認(rèn)為腫瘤是一種多基因功能異常的疾病。 細(xì)胞/組織在病變過(guò)程中，隨著致癌基因以及表觀遺傳基因突變的增加，細(xì)胞/組織逐漸形成癌前病變，癌變細(xì)胞/組織以及惡性癌變細(xì)胞/組織。另一類模型認(rèn)為腫瘤是由腫瘤干細(xì)胞增殖分化出來(lái)的。腫瘤干細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞/組織中的含量非常少，但卻具有類似于胚胎干細(xì)胞的自我更新的能力。腫瘤干細(xì)胞是干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞以及成體干細(xì)胞)發(fā)生基因以及表觀遺傳基因突變后形成的具有惡性增殖特征的一類干細(xì)胞，是腫瘤細(xì)胞化、放療失敗的重要因素。腫瘤干細(xì)胞最初在白血病患者的腫瘤細(xì)胞中被分離出來(lái)，發(fā)現(xiàn)該腫瘤干細(xì)胞具有表面特征抗原CD96。隨后在實(shí)體瘤中也發(fā)現(xiàn)并鑒定了腫瘤干細(xì)胞的存在。如在乳腺癌中存在著一種ABCG2基因高表達(dá)的細(xì)胞亞群，具有腫瘤干細(xì)胞的特征。另外還發(fā)現(xiàn) ALDHl,⑶24，⑶44，⑶90，⑶133也是用來(lái)鑒定腫瘤干細(xì)胞常用的一些生物標(biāo)志物分子。腫瘤干細(xì)胞的分離主要是從新鮮的腫瘤組織中分離。分離方法主要是通過(guò)流式細(xì)胞分選技術(shù)以及免疫磁珠的方法進(jìn)行。采用流式細(xì)胞分選方法獲得的腫瘤干細(xì)胞純度較高，可達(dá)95%以上，但分選過(guò)程會(huì)對(duì)細(xì)胞有較大的損傷，磁珠分選方法雖然條件比較溫和，但是分選的干細(xì)胞純度較低，達(dá)到80%就是一個(gè)比較好的分離結(jié)果了。上述兩種方法面臨的一個(gè)共同問(wèn)題就是分離干細(xì)胞需要使用高質(zhì)量的單克隆抗體，分離成本非常高。另外分離出的腫瘤干細(xì)胞如何擴(kuò)增而不失去或改變其干細(xì)胞的特征仍然是一個(gè)當(dāng)前沒(méi)有解決的一個(gè)技術(shù)瓶徑，是制約腫瘤干細(xì)胞研究和發(fā)展新的腫瘤治療技術(shù)的技術(shù)障礙。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)，解決了現(xiàn)有技術(shù)中分離干細(xì)胞需要使用高質(zhì)量的單克隆抗體，分離成本非常高，分離出的腫瘤干細(xì)胞擴(kuò)增卻失去或改變其干細(xì)胞的特征的問(wèn)題。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)，在實(shí)體腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)中，以改性干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，腫瘤干細(xì)胞可以逐漸形成集落。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述改性干細(xì)胞培養(yǎng)基按體積比包括70 100%的DMEM/ F12 和 O 30% 的 RPMI-1640ο
作為對(duì)上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述改性干細(xì)胞培養(yǎng)基中還含有O lyg/ml的 EGF,O I μ g/ml 的 FGF_b、0 I μ g/ml 的 IGF、O I μ g/ml 的 PDGF、0 I μ g/ml 的 SCF、 O 1μ g/ml 的 TGF-β、 I μ g/ml 的 LIF、0 300ηΜ 的 CHIR99021、0 ImM 的 PD173074、 O ImM的PD0325901和O ImM的Υ27632，能有效篩選腫瘤干細(xì)胞，通過(guò)抑制GSK信號(hào)通路和酪氨酸激酶抑制劑達(dá)到有效抑制干細(xì)胞分化，提高血液腫瘤干細(xì)胞篩選的效率。
作為另一優(yōu)選的技術(shù)方案，所述改性干細(xì)胞培養(yǎng)基按體積比包括O 30%的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和70 100%的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基HEScGRO。
作為對(duì)上述技術(shù)方案的改進(jìn)，所述改性干細(xì)胞培養(yǎng)基中還含有O 1μ g/ml的 TGF-β、 I μ g/ml 的 SCF、0 I μ g/ml 的 bFGF、0 I μ g/ml 的 EGF、0 500nM 的 CHIR99021、0 ImM 的 PD173074、0 ImM 的 PD184352、0 ImM的 PD0325901 和O ΙΟΟμΜ 的Υ27632，能有效篩選腫瘤干細(xì)胞，通過(guò)抑制GSK信號(hào)通路和酪氨酸激酶抑制劑達(dá)到有效抑制干細(xì)胞分化，提高血液腫瘤干細(xì)胞篩選的效率。
由于采用了上述技術(shù)方案，一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)，在實(shí)體腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)中，以改性干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，腫瘤干細(xì)胞可以逐漸形成集落，該集落具有腫瘤干細(xì)胞的特征，，解決了現(xiàn)有技術(shù)中分離干細(xì)胞需要使用高質(zhì)量的單克隆抗體，分離成本非常高，分離出的腫瘤干細(xì)胞擴(kuò)增卻失去或改變其干細(xì)胞的特征的問(wèn)題。
下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明
實(shí)例I人乳腺癌MCF-7腫瘤干細(xì)胞的克隆培養(yǎng)與擴(kuò)增
人乳腺癌MCF-7購(gòu)自美國(guó)細(xì)胞庫(kù)ATCC，細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清(ΡΑΑ， FCS500)的DMEM培養(yǎng)基(北京鈕因華信科技有限公司，DM10140021)，在Coring公司生產(chǎn)的T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37° C，5%C02。細(xì)胞每?jī)商靷鞔淮?。在進(jìn)行 MCF-7的干細(xì)胞克隆培養(yǎng)時(shí)，首先將在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至90%的交匯度的細(xì)胞用胰酶消化，經(jīng)生理鹽水洗滌后，更換干細(xì)胞培養(yǎng)基(配方見(jiàn)表1，其中胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基HEScGRO 購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，貨號(hào)SCM02Q-100;CHIR99021購(gòu)自美國(guó)stemgent公司，貨號(hào) 04-0004;PD0325901 購(gòu)自美國(guó) stemgent 公司，貨號(hào)04-0006;Y27632,購(gòu)自美國(guó) stemgent 公司，貨號(hào)04-0012)重新懸浮MCF-7細(xì)胞，并以每孔5_10萬(wàn)個(gè)接種到24孔板的一個(gè)培養(yǎng)孔中，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)I天后發(fā)現(xiàn)有少量細(xì)胞增殖，其中的某些細(xì)胞呈不完整的球形結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)，培養(yǎng)至第3天，細(xì)胞進(jìn)一步增殖，呈球形的細(xì)胞圖進(jìn)一步增大，至14天時(shí)能呈球形生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)一步增殖，而不能呈球形增殖的細(xì)胞逐漸死亡，見(jiàn)圖I。該細(xì)胞克隆經(jīng)胰酶消化后，能夠在所用的干細(xì)胞培養(yǎng)基配方I中繼續(xù)生長(zhǎng)，并形成球型的細(xì)胞克隆。該細(xì)胞克隆具有腫瘤干細(xì)胞的特征，是一種MCF-7干細(xì)胞。
表I、配方I :乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的篩選、擴(kuò)增用培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1.一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)，其特征在于在實(shí)體腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)中，以改性干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，腫瘤干細(xì)胞可以逐漸形成集落。
2.如權(quán)利要求I所述的一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)，其特征在于所述改性干細(xì)胞培養(yǎng)基按體積比包括70 100%的DMEM/F12和O 30%的RPMI-1640。
3.如權(quán)利要求2所述的一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)，其特征在于所述改性干細(xì)胞培養(yǎng)基中還含有O I μ g/ml的EGF、0 I μ g/ml的FGF_b、0 I μ g/ml的 IGF、0 I μ g/ml 的 PDGF、0 I μ g/ml 的 SCF、0 I μ g/ml 的 TGF-β、0 I μ g/ml 的 LIF、0 300nM 的 CHIR99021、0 ImM 的 PD173074、0 ImM 的 PD0325901 和 O ImM 的 Y27632。
4.如權(quán)利要求I所述的一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)，其特征在于所述改性干細(xì)胞培養(yǎng)基按體積比包括O 30%的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和70 100%的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基HEScGRO。
5.如權(quán)利要求4所述的一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)，其特征在于所述改性干細(xì)胞培養(yǎng)基中還含有O I μ g/ml的TGF-β、0 I μ g/ml的SCF、0 I μ g/ml 的 bFGF、0 I μ g/ml 的 EGF、0 500nM 的 CHIR99021、0 ImM 的 PD173074、0 ImM 的 PD184352、0 ImM 的 PD0325901 和 O 100 μ M 的 Υ27632。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種富集和無(wú)分化擴(kuò)增貼壁干細(xì)胞的技術(shù)，在實(shí)體腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)中，以改性干細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，腫瘤干細(xì)胞可以逐漸形成集落，該集落具有腫瘤干細(xì)胞的特征，解決了現(xiàn)有技術(shù)中分離干細(xì)胞需要使用高質(zhì)量的單克隆抗體，分離成本非常高，分離出的腫瘤干細(xì)胞擴(kuò)增卻失去或改變其干細(xì)胞的特征的問(wèn)題。
文檔編號(hào)C12N5/095GK102978163SQ20121046641
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月17日
發(fā)明者殷勤偉, 黃兵 申請(qǐng)人:黃兵