培育標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種培育標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法、由該方法得到的轉(zhuǎn)基因魚的應(yīng)用及其專用質(zhì)粒。本發(fā)明提供一種培育轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法，包括以下步驟：(1)構(gòu)建lingo-1重組表達(dá)載體，所述lingo-1重組表達(dá)載體包含適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶酶切位點、斑馬魚lingo-1基因啟動子序列、熒光蛋白編碼框和poly?A片段；(2)用步驟(1)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化斑馬魚受精卵，得到F0代；和(3)將F0代與野生型的斑馬魚雜交，得到lingo-1特異性基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。本發(fā)明還鑒定了斑馬魚lingo-1基因啟動子，其核苷酸序列為SEQ?ID?No：1。
【專利說明】培育標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種培育標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的方法及由該方法得到的轉(zhuǎn)基因魚的應(yīng)用，本發(fā)明還涉及一種用于培育標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的專用質(zhì)粒。具體而言，本發(fā)明涉及一種培育Iing0-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法及由該方法得到的Iingo-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的應(yīng)用，以及用于培育Iingo-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的專用質(zhì)粒。本發(fā)明還鑒定了斑馬魚Iingo-1基因啟動子，其核苷酸序列為SEQ ID No:1。
【背景技術(shù)】
[0002]髓鞘化(myelination)即神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞辨識并附著到軸突合適位置而形成多層緊密包裹的髓鞘的過程(Simons，2006 ;Franklin et al.，2008)。目前對許多脊椎動物的髓鞘化過程有廣泛的研究。髓鞘功能是增加神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)速度并維持與軸突的完整性，如果發(fā)生損傷或缺陷會導(dǎo)致諸如多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS),視神經(jīng)炎等病癥。由髓鞘形成不正常所導(dǎo)致的疾病可分為兩大類:髓鞘缺失或脫髓鞘(demyelination)和髓鞘形成障礙(dysmyelination)。常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病為多發(fā)性硬化癥，是一種自身免疫性疾病(autoimmune disease)，中樞的髓鞘和少突膠質(zhì)細(xì)胞受到由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫攻擊(Trapp，1999)。該疾病的一個重要特征是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)生的炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)增生(gliosis)所導(dǎo)致的髓鞘丟失(Fawcett & Asher, 1999 ；Logan & Berry, 2002)。對這種髓鞘病變的起因有許多假說解釋(Franklin，2002，2008)，但至今仍是個迷。
[0003]目前已知有許多因子參與調(diào)控CNS的軸突和髓鞘再生，如促進(jìn)神經(jīng)生長的神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived NeurotrophicFactor, BDNF)等神經(jīng)營養(yǎng)`素(Neurotrophins, NT),以及一些抑制神經(jīng)再生的因子如髓鞘相關(guān)糖蛋白(Myelin-associated glycoprotein, MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)、髓鞘喊性蛋白(Myelin basic protein,MBP)和近年來被發(fā)現(xiàn)并大量研究的神經(jīng)抑制蛋白(Nogo)等(Filbin,2003 ；Grados-Munro& Fournier,2003)。
[0004]針對MS的基礎(chǔ)性研究中最有代表性使用的動物模型是實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)(Trapp, 1999 ；Franklin et al.,
2008)。人們已在小鼠、大鼠有限的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后髓鞘修復(fù)的模型(如EAE)上了解許多髓鞘丟失、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和成熟調(diào)控及再髓鞘的細(xì)胞分子機(jī)制(Bruce et al.，
2009)。盡管如此，少突膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘相關(guān)抑制因子在一個中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后本身就能很好再生的模式動物斑馬魚上的研究則起步較晚。成年斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有高度分化和完整的髓鞘，基因和蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)顯示其存在髓鞘相關(guān)抑制因子和類似于哺乳類少突膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控因子，它是一個非常適宜開展中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后髓鞘修復(fù)過程分子機(jī)理研究的模式動物。特別地，成年斑馬魚視神經(jīng)損傷后再生過程中再髓鞘機(jī)理未有報道，且髓鞘相關(guān)抑制因子除Nogo新近工作外(Abdesselem et al., 2009),其它少有研究。[0005]近期，Mi等人發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性跨膜蛋白LING0-1是少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的負(fù)調(diào)控因子(Mi et al.，2004 ；2005)，我們及合作者在EAE動物模型上研究結(jié)果提示LING0-1的拮抗劑或針對其信號通路上的分子調(diào)控物是富有前景的CNS脫髓鞘疾病治療的候選藥物(Mi and Hu et al.，2007)。
[0006]然而，Mi等前人的LING0-1研究都是在小鼠或大鼠上進(jìn)行的，建立的是Iingo-1基因敲除(knockout)的小鼠模型，著重研究該基因的表達(dá)和功能。進(jìn)一步地，當(dāng)時的研究工作針對的是拮抗該Iingo-1受體蛋白質(zhì)的藥物開發(fā)。這些與本發(fā)明人在本申請中構(gòu)建的特異性標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞可視化的斑馬魚模型是有本質(zhì)上的差別的。本發(fā)明是借助轉(zhuǎn)基因操作構(gòu)建在斑馬魚上特異性標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞，使之成為一種特定的工具，有可能應(yīng)用于篩選對少突膠質(zhì)細(xì)胞影響的小分子或藥物。如同以下羅列的幾種已經(jīng)申請專利或已被授權(quán)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系。
[0007]目前幾種少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因魚品系如:Tg(0lig2:egfp)(Shin J.& Park HC, Appel et al.2003) ； Tg (pip: egfp) (Yoshida M & Macklin 2005)；Tg(nkx2.2a:megfp)(Kirby B.B.& Takada N，Appel et al.2006) ；Tg(mbp:egfp)(Park &Kim et al.2009) ；Tg (claudin k: gfp) (Munzel et al.2011);上述轉(zhuǎn)基因魚品系多為標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(OPC)、pMN以及分化中或未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。而本發(fā)明中的Iingo-1基因調(diào)控序列具備啟動子性質(zhì)，整合熒光蛋白編碼框(如EGFP)后，可特異性的標(biāo)記后期成熟的和包裹形成髓鞘的少突膠質(zhì)細(xì)胞，為在位活體動態(tài)觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞行為和髓鞘再生過程提供了有力的工具。
[0008]轉(zhuǎn)基因技術(shù)(Transgene technology)是將人工分離和修飾過的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾。斑馬魚是一種理想的用于轉(zhuǎn)基因研究的新型模式動物，近年來發(fā)展起來的轉(zhuǎn)座酶Tol2或核酸內(nèi)切酶1-SceI介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法可促使轉(zhuǎn)移基因與宿主基因組更早的融合，極大的提高了斑馬魚轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)和穩(wěn)定性表達(dá)的效率。轉(zhuǎn)座酶Tol2可介導(dǎo)多位點的單拷貝基因與宿主基因組的整合，而核酸內(nèi)切酶1-SceI則可介導(dǎo)低拷貝的單一位點整合。
[0009]與內(nèi)源基因的表達(dá)類似，外源基因在受體動物中表達(dá)需要的轉(zhuǎn)基因構(gòu)件包括啟動子及相關(guān)調(diào)節(jié)序列、目的基因和終止信號3個基本結(jié)構(gòu)。外源基因的表達(dá)會受到構(gòu)建于表達(dá)載體中的啟動子的調(diào)控，由于啟動子的驅(qū)動強(qiáng)度受多個調(diào)控因子的影響，使用異源啟動子可能會導(dǎo)致外源基因表達(dá)量低下。轉(zhuǎn)錄終止子是轉(zhuǎn)基因構(gòu)件中的另一個元件。商品化的轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體常使用SV40 poly A終止信號序列，例如表達(dá)載體pEGFP-1 (Clontech)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明涉及一種培育標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的方法及由該方法得到的轉(zhuǎn)基因魚的應(yīng)用，本發(fā)明還涉及一種用于培育標(biāo)記中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因魚的專用質(zhì)粒。具體而言，本發(fā)明涉及一種培育Iing0-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法及由該方法得到的Iingo-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的應(yīng)用，以及用于培育Iingo-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的專用質(zhì)粒。本發(fā)明還鑒定了斑馬魚Iingo-1基因啟動子，其核苷酸序列為SEQ ID No:1。
[0011]本發(fā)明提供一種培育Iingo-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法，其包括以下步驟:
[0012](I)構(gòu)建Iingo-1重組表達(dá)載體,所述Iingo-1重組表達(dá)載體包含適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶酶切位點，斑馬魚Iingo-1基因啟動子序列，熒光蛋白編碼框和poly A片段；
[0013](2)用步驟⑴中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化斑馬魚受精卵，得到代；和
[0014](3)將R)代與野生型斑馬魚雜交，得到Iingo-1特異性基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
[0015]其中，步驟(3)中得到的轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以進(jìn)一步通過傳統(tǒng)的育種方法得到轉(zhuǎn)基因斑馬魚的純合體。
[0016]其中所述步驟(1)中所用的核酸內(nèi)切酶酶切位點為，例如，1-SceI限制酶酶切位點或Tol2轉(zhuǎn)座酶酶切位點，優(yōu)選1-SceI限制酶酶切位點；所述熒光蛋白選自EGFP、mCherry、RFP、YFP 或 DsRED ;所述 poly A 片段選自 SV40poly A 片段或 BGH poly A 片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際需要選擇適當(dāng)?shù)臒晒獾鞍缀蚿oly A片段。
[0017]其中所述步驟(1)中構(gòu)建的Iingo-1重組表達(dá)載體即為本發(fā)明所述的用于培育Iingo-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的專用質(zhì)粒。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述步驟
(I)中，將斑馬魚Iingo-1基因啟動子序列、熒光蛋白編碼框和poly A片段插入到載體p1-Scel-pBSI1-SK+中，得到所述Iingo-1重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體即為本發(fā)明所述的用于培育Iingo-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的優(yōu)選的專用質(zhì)粒。
[0018]利用本發(fā)明的上述方法，構(gòu)建得到lingo-1:熒光蛋白轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，構(gòu)建得到lingo-l:EGFP轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，所述突光蛋白除EGFP之外,也可以應(yīng)用其他合適的標(biāo)記蛋白，例如，mCherry、RFP、YFP或DsRED等。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇。
[0019]斑馬魚Iingo-1基因啟動子序列(核苷酸序列見SEQ ID No:1)通過生物信息學(xué)對斑馬魚Iingo-1基因組序列(Genbank:BX470207)預(yù)測并設(shè)計引物進(jìn)行基因組PCR獲得。并且，本發(fā)明人通過實驗驗證了所預(yù)測的核苷酸序列(SEQ ID No: I)具有啟動子功能，從而證實斑馬魚Iingo-1基因啟動子的核苷酸序列為SEQ ID No:1。
[0020]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，Iingo-1重組表達(dá)載體通過將斑馬魚Iingo-1基因啟動子序列、EGFP熒光蛋白編碼框(SEQ ID No:4)和SV40poly A (SEQ ID No:5)(pEGFP-1, clontech)插入載體 p1-Scel-pBSI1-SK+(Genbank:DQ836146,參見 Thermes, V.，et al 2002，其中 pBSI1-SK+可購自 Stratagene)中而得到。
[0021]本發(fā)明構(gòu)建的Iingo-1重組表達(dá)載體可通過多種方法導(dǎo)入斑馬魚受精卵，如顯微注射法、原生質(zhì)體融合法或高壓電穿孔法等，優(yōu)選為顯微注射法。同時，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，核酸內(nèi)切酶1-SceI (R0694,NEB)的使用可提高了斑馬魚轉(zhuǎn)基因瞬時表達(dá)和穩(wěn)定性表達(dá)的效率。
[0022]本發(fā)明的Iingo-1重組表達(dá)載體中包含lingo-1基因啟動子,而lingo-1可特異性標(biāo)記后期成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。因此，本發(fā)明的Iingo-1特異性基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚可活體實時的監(jiān)測熒光信號，從而快速直觀地反映zLINGO-1的表達(dá)水平，也可以在位活體動態(tài)觀察少突膠質(zhì)細(xì)胞行為和髓鞘再生過程。本發(fā)明為研究CNS損傷后髓鞘修復(fù)過程中少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘的動態(tài)變化過程奠定了基礎(chǔ)，對治療人類CNS脫髓鞘疾病具有積極意義。
[0023]因此，本發(fā)明還提供利用本發(fā)明的方法構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的應(yīng)用，其可以用于構(gòu)建篩選影響少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的藥物或化合物的模型和篩選影響少突膠質(zhì)細(xì)胞再髓鞘化的藥物或化合物的模型。
[0024]本發(fā)明還提供一種影響少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的藥物或化合物篩選模型，所述篩選模型包括野生型斑馬魚與利用本發(fā)明的方法構(gòu)建的lingo-1:熒光蛋白品系雜交得到的雜合斑馬魚幼魚。
[0025]本發(fā)明還提供一種影響少突膠質(zhì)細(xì)胞再髓鞘化的藥物或化合物篩選模型，所述篩選模型包括野生型斑馬魚與利用本發(fā)明的方法構(gòu)建的lingo-1:熒光蛋白品系雜交得到的雜合斑馬魚成魚。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，
[0027]其中:
[0028]圖1 為 Iingo-1 重組表達(dá)載體 p1-Scel-lingol-EGFP ；
[0029]圖2為4dpf的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tgdingol::EGFP)R)代；
[0030]圖3 為 Iingo-1 重組表達(dá)載體 pl-Scel-lingol-mCherry ；
[0031]圖4 為 4dpf 的雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚 Tg(olig2::EGFP)/pl-Scel-lingol-mCherry,
[0032]用于驗證斑馬魚Iingo-1基因啟動子特異性。
【具體實施方式】
[0033]以下通過具體實施例的方式詳細(xì)說明本發(fā)明，但是，本領(lǐng)技術(shù)人員應(yīng)該理解，本發(fā)明并不局限于這些具體的實施例，本發(fā)明的技術(shù)方案的任何等價替換、改進(jìn)和變化都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。`
[0034]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，除非另外說明，下述實施例中所用的試劑、質(zhì)粒均可商業(yè)獲得。
[0035]實施例1培育Iingo-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚
[0036](I)構(gòu)建Iingo-1重組表達(dá)載體
[0037]使用Hind III 和 Xho I 雙酶切質(zhì)粒 pEGFP-1 (購自 BD Biosciences Clontech)得到約IKb的EGFP熒光蛋白編碼框和SV40poly A片段；設(shè)計斑馬魚Iing0-1基因啟動子特異性引物(見下表1)并進(jìn)行基因組PCR后，回收純化目的片段使用BamH I和Hind III雙酶切得到約2Kb的Iingo-1基因啟動子序列(SEQ ID No:1);用BamH I和Xho I雙酶切質(zhì)粒 p1-Scel-pBSI1-SK+(Genbank:DQ836146，參見 Thermes，V., et al 2002，其中 pBSI1-SK+可購自 Stratagene)。
[0038]得到約3Kb片段；同時連接上述三個片段，得到重組載體p1-Sce1-lingol-EGFP(SEQ ID No:2)。
[0039]表1.斑馬魚Iingo-1基因啟動子特異性引物:
[0040]
引物名稱序列
正向引物:__5’ -GCggatccTGAAGAGCGGTTCCATAAAGC-3’_
反向引物:5’-CCaagcttCACCCGCTCACATACATGCC-3’
[0041]所構(gòu)建的Iingo-1重組表達(dá)載體p1-Scel-lingol-EGFP如圖1所示,其包含核酸內(nèi)切酶1-SceI限制酶切位點、斑馬魚Iingo-1基因啟動子序列、EGFP熒光蛋白編碼框和SV40poly A0該lingo-1重組表達(dá)載體進(jìn)一步用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
[0042](2)重組表達(dá)載體p1-Scel-lingol-EGFP轉(zhuǎn)化斑馬魚受精卵[0043]對斑馬魚受精卵(AB/WT野生型斑馬魚，飼養(yǎng)于本室的ESEN循環(huán)系統(tǒng)，斑馬魚最初購自國家斑馬魚模式動物中心)顯微共注射重組表達(dá)載體p1-Scel-lingol-EGFP和核酸內(nèi)切酶1-Scel，得到R)代，于受精后四天(4dpf)使用熒光體式顯微鏡(SZX-16，OLYMPUS)篩選熒光信號，如圖2所示。
[0044](3)斑馬魚Iingo-1基因啟動子特異性的驗證
[0045]針對質(zhì)粒pCDNA-mCherry中 mCherry 突光蛋白編碼框(SEQ ID No:6)和 BGH polyA片段(SEQ ID No:7)設(shè)計特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后使用Hind III和Xho I雙酶切得到約IKb的mCherry熒光蛋白編碼框和BGH poly A片段；設(shè)計斑馬魚Iing0-1基因啟動子特異性引物(見表1)并進(jìn)行基因組PCR后，回收純化目的片段使用BamH 1和Hind III雙酶切得到約2Kb的Iingo-1基因啟動子序列；用8&11111 1和Xho 1雙酶切質(zhì)粒p1-Scel-pBSI1-SK+得到約3Kb片段；連接上述三個片段,得到重組載體pl-Scel-lingo 1-mCherry (SEQ ID No:3)。
[0046]所構(gòu)建的Iingo-1重組表達(dá)載體pl-Scel-lingol-mCherry如圖3所示,其包含核酸內(nèi)切酶1-SceI限制酶切位點、斑馬魚Iingo-1基因啟動子序列、mCherry熒光蛋白編碼框和BGH poly A，用于驗證斑馬魚lingo-1基因啟動子特異性。
[0047]通過顯微注射將Iingo-1重組表達(dá)載體pl-Scel-lingol-mCherry導(dǎo)入轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(olig2::EGFP)(特異性標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞OPC的轉(zhuǎn)基因品系，該品系最初由美國Bruce Appel組構(gòu)建，獲自國家斑馬魚模式動物中心)得到代，于受精后四天(4dpf)使用激光共聚焦顯微鏡(FV-1000，OLYMPUS)檢測紅/綠色熒光信號是否共定位，從而來驗證斑馬魚Iingol基因啟動子的特異性，如圖4所示，圖4顯示在腦部與脊髓處有部分的紅/綠熒光信號共定位，說明在olig2陽性細(xì)胞上有mCherry的特異性表達(dá)，即Iingo-1啟動子可以調(diào)控目標(biāo)蛋白在少突膠質(zhì)細(xì)胞上特異性表達(dá)，從而驗證了斑馬魚Iingo-1基因啟動子序列的特異性。
[0048]實施例2.影響少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的藥物或化合物篩選
[0049]將AB野生型(購自國家斑馬魚模式動物中心)和按照實施例1的方法得到的Iingo-1iEGFP品系雜交獲得lingo-1:EGFP/AB雜合斑馬魚幼魚用于篩選。
[0050]例如利用已有的化學(xué)合成物文庫Prestwick Chemical Library(Prestwick-Chemical),選擇約一千種化合物進(jìn)行初步篩選(實驗室小規(guī)模篩選)。將所選的化合物借助IOmM的DMSO配制終濃度為IOuM的化合物工作液，將3條30hpflingo-1:EGFP/AB幼魚/孔(每種化合物9條)和200ul化合物工作液/孔置于96孔平板中并飼養(yǎng)至72hpf。首先檢測毒性作用，將沒有毒性作用的化合物組內(nèi)的幼魚用4% PFA固定，并于熒光體式顯微鏡(SZX-16，OLYMPUS)檢測熒光信號，并使用DP_72 (OLYMPUS)拍照，并統(tǒng)計1ingo-1+細(xì)胞的遷移數(shù)目。進(jìn)一步改變相應(yīng)化合物的濃度，若在濃度梯度實驗中出現(xiàn)同樣的效應(yīng)，則使用Q-PCR檢測mbp的RNA水平變化。
[0051]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，利用該lingo-1:EGFP/AB雜合斑馬魚幼魚篩選模型按上述操作步驟可以進(jìn)行高通量篩選，可以篩選得到影響少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的藥物或化合物。
[0052]實施例3.影響少突膠質(zhì)細(xì)胞再髓鞘化的藥物或化合物篩選
[0053]將AB野生型和lingo-1:EGFP品系雜交獲得lingo-1:EGFP/AB雜合斑馬魚成魚(> 6mpf)用于篩選。構(gòu)建成魚視神經(jīng)脫髓鞘模型(5號鑷CRUSH或者視神經(jīng)微注LPC)，將待篩選的化合物溶解并吸收到藥用海綿中并包裹視神經(jīng)。于手術(shù)7天后將成魚麻醉并取出視神經(jīng)，4% PFA固定后，冰凍切片并使用免疫組化技術(shù)研究少突膠質(zhì)細(xì)胞(EGFP+)和髓鞘化情況(使用斑馬魚MBP抗體，由Abmart合成)。
[0054]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，利用該lingo-1:EGFP/AB雜合斑馬魚成魚篩選模型按上述操作步驟可以進(jìn)行高通量篩選，可以篩選得到影響少突膠質(zhì)細(xì)胞再髓鞘化的藥物或化合物。
[0055]應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實施方案的任意組
入
口 o
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【權(quán)利要求】
1.斑馬魚lingo-1基因啟動子，其核苷酸序列為SEQID No:1。
2.一種包含斑馬魚Iingo-1基因啟動子、熒光蛋白編碼框和poly A片段的重組載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其中所述重組載體的核苷酸序列為SEQID No:2,其中所述熒光蛋白為EGFP，所述poly A片段為SV40polyA片段。
4.一種包含權(quán)利要求2或3所述的重組載體的宿主細(xì)胞。
5.一種培育Iingo-1轉(zhuǎn)基因斑馬魚的方法，所述方法包括以下步驟: (1)構(gòu)建Iingo-1重組表達(dá)載體,所述Iingo-1重組表達(dá)載體包含適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶酶切位點，斑馬魚Iingo-1基因啟動子序列，熒光蛋白編碼框和poly A片段； (2)用步驟(1)中的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化斑馬魚受精卵，得到代；和 (3)將R)代與野生型的斑馬魚雜交，得到Iingo-1特異性基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述步驟(1)中所用的核酸內(nèi)切酶酶切位點為1-SceI限制酶酶切位點或Tol2轉(zhuǎn)座酶酶切位點；所述熒光蛋白選自EGFP、mCherry, RFP、YFP或DsRED ;所述poly A片段選自SV40 polyA片段或BGH poly A片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)中，將斑馬魚Iingo-1基因啟動子序列、熒光蛋白編碼框和poly A片段插入到載體p1-Scel-pBSI1-SK+中，得到所述Iingo-1重組表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述Iingo-1重組表達(dá)載體通過顯微注射法、原生質(zhì)體融合法或高壓電穿孔法導(dǎo)入斑馬魚受精卵，得到代。
9.一種影響少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟的藥物或化合物篩選模型，所述篩選模型包括野生型斑馬魚與利用權(quán)利要求5的方法構(gòu)建的lingo-1:熒光蛋白品系雜交得到的雜合斑馬魚幼魚。
10.一種影響少突膠質(zhì)細(xì)胞再髓鞘化的藥物或化合物篩選模型，所述篩選模型包括野生型斑馬魚與利用權(quán)利要 求5的方法構(gòu)建的lingo-1:熒光蛋白品系雜交得到的雜合斑馬魚成魚。
【文檔編號】C12N15/63GK103805601SQ201210452397
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月12日
【發(fā)明者】殷梧, 胡兵 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)