一種鹵代修飾胞苷素的制備方法
【專利摘要】一種鹵代修飾胞苷素，為側鏈-C4H8ClO9的氮取代胞苷素，其制備方法包括：以不吸水鏈霉菌為出發(fā)菌，在培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，分離和純化后再經(jīng)化學修飾得到。該修飾胞苷素具有更高的生物抗性和結構穩(wěn)定性，該制備工藝化學選擇性好，工藝條件溫和，生產(chǎn)過程環(huán)境友好。
【專利說明】一種鹵代修飾胞苷素的制備方法
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明屬于微生物農(nóng)藥【技術領域】，涉及一種鹵代修飾胞苷素的制備方法。
【背景技術】:
[0002]農(nóng)用抗生素(agricultural antibiotics),簡稱農(nóng)抗,是指由微生物發(fā)酵產(chǎn)生、具有農(nóng)藥功能、用于農(nóng)業(yè)上防治病蟲草鼠等有害生物的次生代謝產(chǎn)物。與一般化學合成農(nóng)藥相比，農(nóng)用抗生素具有以下特點:①結構復雜活性高、用量小、選擇性好；③易被生物或自然因素所分解，不在環(huán)境中積累或殘留；④生產(chǎn)原料為淀粉、糖類等農(nóng)產(chǎn)品，屬于再生性能源采用發(fā)酵工程生產(chǎn)，同一套設備只要改變菌種即可生產(chǎn)不同的抗生素，生產(chǎn)菌大多是土壤中的放線菌，也有真菌和細菌。
[0003]核苷類抗生素為一類重要的抗生素，它們是一大類對核苷和核苷酸結構修飾的化合物，以核苷為其共同的母核，有抗細菌、抗真菌、抗錐蟲、抗腫瘤、鋤草、殺蟲、增強免疫力等較廣范圍的生物活性。不同的核苷類抗生素的差異在于母核以外的側鏈基團。農(nóng)業(yè)上應用的核苷類抗生素主要有殺稻痕菌素S (Blasticidin S)和多氧霉素(Polyoxins)。修飾胞苷素為側鏈為-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。
[0004]迄今為止，已經(jīng)從各種生物(包括細菌、真菌、各類植物)中分離出3800多種鹵化物，約95%的鹵化物為氯化和溴化物，氟化和碘化物很少，少數(shù)化合物既含氯也含碘。許多鹵化物，如氯霉素(chloramphenicol)、7_氯四環(huán)素(7-chlotetracycline)、萬古霉素(vancomycin)等都是重要的抗生素。雖然鹵素原子的類型、數(shù)量以及位置對化合物生物活性的影響沒有特定的規(guī)律， 但是某些鹵化物與相應的非鹵化物相比，鹵化可以增強其生物活性。如，2-氯硝吡咯菌素的抗真菌活性只有硝吡咯菌素(含有兩個氯原子)的10% ;與其含氯衍生物相比，不含氯的蝴蝶霉素沒有抗菌活性。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的是提供一種鹵代修飾胞苷素的制備方法。
[0006]本發(fā)明通過下述方法實現(xiàn)的:一種鹵代修飾胞苷素的制備方法，1、一種鹵代修飾胞苷素的制備方法，
[0007](I)以不吸水鏈霉菌為出發(fā)菌,在培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，
[0008](2)分離、純化發(fā)酵液，
[0009](3)發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)分離純化后通過FeCl3配位催化鹵代反應進行化學修飾得到側鏈為-C4H8ClO9的氮取代胞苷素；
[0010]菌株:以吸水鏈霉菌海南變種SlOl菌株經(jīng)自然分離后獲得的S510菌株為出發(fā)菌株。
[0011]培養(yǎng)基:玉米粉15~25g、豆餅粉20~35g、葡萄糖15~25g、淀粉8~12g、氯化銨I~5g、碳酸鈣I~5g，硫酸鎂0.1~0.5，硫酸亞鐵0.1~0.5，氯化鈉0.1~0.5g，磷酸氫二鈉0.1~0.5g,加自來水至1000mL。經(jīng)121 °C高壓濕熱滅菌20min。[0012]發(fā)酵培養(yǎng):搖床震蕩培養(yǎng)，轉速為150~250轉/分鐘，發(fā)酵溫度:25~35°C，罐壓
0.01~0.15MPa，通氣量1:0.5~I，發(fā)酵時間50~100h。
[0013]發(fā)酵產(chǎn)物分離和純化:發(fā)酵液萃取，用Sephadex G_25柱層析，水洗脫，洗脫液經(jīng)HPLC檢測后(C0SM0SILC18Econopak柱，流動相0.03三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min,紫外檢測波長220nm)，將其中保留時間約為5.5min的主要組分含量在75~85%和60~75%的部分分別合并，再經(jīng)真空冷凍干燥后即可得到初次分離物。含量在60~75%的初提物再經(jīng)一次常壓柱層析，即可將純度提高到80~85%，合并兩次所得的含量在75%以上的樣品，用HPLC半制備柱進彳丁制備,最后可得到純度為90.12%的精品。將精品溶液冷干后，所得微黃色粉末即為側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素。效價測定:管碟法。
[0014]化學修飾:發(fā)酵產(chǎn)物分離純化后和KCl反應，以正丁醇為溶劑，F(xiàn)eCl3為催化劑，通過配位催化鹵代反應來制備帶側鏈-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。效價測定:管碟法。
[0015]本發(fā)明的修飾胞苷素具有更高的生物抗性和結構穩(wěn)定性，該制備工藝化學選擇性好，工藝條件溫和，生產(chǎn)過程環(huán)境友好。所得側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素效價為2800 μ g/L，側鏈-C4H8ClO9的氮取代胞苷素效價為6418 μ g/L?；谏鲜鰞?yōu)點，本發(fā)明的帶側鏈-C4H8ClO9的氮取代胞苷素將在生物農(nóng)藥領域中發(fā)揮重要的作用，應用前景廣闊。
【具體實施方式】
[0016]下面結合具體的實施例，對本發(fā)明作進一步的闡述，但不限于這些具體的實施例，而所有的實施例均按上述的操作步驟操作。
[0017]實施例1 [0018]菌株:以吸水鏈霉菌海南變種SlOl菌株經(jīng)自然分離后獲得的S510菌株為出發(fā)菌株。
[0019]培養(yǎng)基:玉米粉20g、豆餅粉25g、葡萄糖18g、淀粉10g、氯化銨3g、碳酸鈣3g，硫酸鎂0.3，硫酸亞鐵0.3，氯化鈉0.3g，磷酸氫二鈉0.3g，加自來水至1000mL。經(jīng)121 °C高壓濕熱滅菌20min。
[0020]發(fā)酵培養(yǎng):搖床震蕩培養(yǎng)，轉速為220轉/分鐘，發(fā)酵溫度:28°C，罐壓0.12MPa，通氣量1:0.5，發(fā)酵時間72h。
[0021]發(fā)酵產(chǎn)物分離和純化:發(fā)酵液萃取，用S^hadex G_25柱層析，水洗脫，洗脫液經(jīng)HPLC檢測后(C0SM0SILC18Econopak柱，流動相0.03%三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min,紫外檢測波長220nm)，將其中保留時間約為5.5min的主要組分含量在75~85%和60~75%的部分分別合并，再經(jīng)真空冷凍干燥后即可得到初次分離物。含量在60~75%的初提物再經(jīng)一次常壓柱層析，即可將純度提高到80-85%，合并兩次所得的含量在75%以上的樣品，用HPLC半制備柱進行制備，最后可得到純度為90.12%的精品。將精品溶液冷干后，所得微黃色粉末即為側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素。效價測定:管碟法。
[0022]化學修飾:發(fā)酵產(chǎn)物分離純化后和KCl反應，以正丁醇為溶劑，F(xiàn)eCl3為催化劑，通過配位催化鹵代反應來制備帶側鏈-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。效價測定:管碟法。反應條件為:側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素:KCl:FeCl3(摩爾比)=20:40:3，溶劑正丁醇的用量為每摩爾側鏈-C4H9O9的氮取 代胞苷素40ml，反應溫度為120°C，收率為91%。
[0023]實施例2[0024]菌株:以吸水鏈霉菌海南變種SlOl菌株經(jīng)自然分離后獲得的S510菌株為出發(fā)菌株。
[0025]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉25g、豆餅粉35g、葡萄糖15g、淀粉12g、氯化銨5g、碳酸鈣5g，硫酸鎂0.1，硫酸亞鐵0.1，氯化鈉0.lg，磷酸氫二鈉0.5g，加自來水至1000mL。經(jīng)121°C高壓濕熱滅菌20min。
[0026]發(fā)酵培養(yǎng):搖床震蕩培養(yǎng)，轉速為250轉/分鐘，發(fā)酵溫度:25°C，罐壓0.15MPa，通氣量1:0.5，發(fā)酵時間64h。
[0027]發(fā)酵產(chǎn)物分離和純化:發(fā)酵液萃取，用S^hadex G_25柱層析，水洗脫，洗脫液經(jīng)HPLC檢測后(C0SM0SILC18Econopak柱，流動相0.03三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min,紫外檢測波長220nm)，將其中保留時間約為5.5min的主要組分含量在75~85%和60~75%的部分分別合并，再經(jīng)真空冷凍干燥后即可得到初次分離物。含量在60~75%的初提物再經(jīng)一次常壓柱層析，即可將純度提高到80-85%，合并兩次所得的含量在75%以上的樣品，用HPLC半制備柱進行制備，最后可得到純度為90.12%的精品。將精品溶液冷干后，所得微黃色粉末即為側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素。效價測定:管碟法。側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素效價2567 μ g/L。
[0028]化學修飾:發(fā)酵產(chǎn)物分離純化后和KCl反應，以正丁醇為溶劑，F(xiàn)eCl3為催化劑，通過配位催化鹵代反應來制備帶側鏈-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。效價測定:管碟法。反應條件為:側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素:KCl:FeCl3(摩爾比)=20:40:3，溶劑正丁醇的用量為每摩爾側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素40ml，反應溫度為105°C，收率為85.7%。
[0029]實施例3
[0030]菌株:以吸水鏈霉菌海南變種SlOl菌株經(jīng)自然分離后獲得的S510菌株為出發(fā)菌株。
[0031]發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉15g、豆餅粉35g、葡萄糖15g、淀粉Sg、氯化銨lg、碳酸鈣lg，硫酸鎂0.5，硫酸亞鐵0.5，氯化鈉0.5g，磷酸氫二鈉0.lg，加自來水至1000mL。經(jīng)121 °C高壓濕熱滅菌20min。
[0032]發(fā)酵培養(yǎng):搖床震蕩培養(yǎng)，轉速為250轉/分鐘，發(fā)酵溫度:35°C，罐壓0.01MPa,通氣量1:0.5，發(fā)酵時間84h。
[0033]發(fā)酵產(chǎn)物分離和純化:發(fā)酵液萃取，用S印hadex G_25柱層析，水洗脫，洗脫液經(jīng)HPLC檢測后(C0SM0SILC18Econopak柱，流動相0.03三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min,紫外檢測波長220nm)，將其中保留時間約為5.5min的主要組分含量在75~85%和60~75%的部分分別合并，再經(jīng)真空冷凍干燥后即可得到初次分離物。含量在60~75%的初提物再經(jīng)一次常壓柱層析，即可將純度提高到80-85%，合并兩次所得的含量在75%以上的樣品，用HPLC半制備柱進行制備，最后可得到純度為90.12%的精品。將精品溶液冷干后，所得微黃色粉末即為側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素。效價測定:管碟法。
[0034]化學修飾:發(fā)酵產(chǎn)物分離純化后和KCl反應，以正丁醇為溶劑，F(xiàn)eCl3為催化劑，通過配位催化鹵代反應來制備帶側鏈-C4H8ClO9的氮取代胞苷素。效價測定:管碟法。反應條件為:側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素:KCl:FeCl3(摩爾比)=20:40:3，溶劑正丁醇的用量為每摩爾側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素40ml，反應溫度為105°C，收率為82.2%。
【權利要求】
1.一種鹵代修飾胞苷素的制備方法，其制備方法包括: (1)以不吸水鏈霉菌為出發(fā)菌，在培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)， (2)分離、純化發(fā)酵液， (3)發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)分離純化后通過FeCl3配位催化鹵代反應進行化學修飾得到側鏈為-C4H8ClO9的氮取代胞苷素； 所述的菌株:以吸水鏈霉菌海南變種SlOl菌株經(jīng)自然分離后獲得的S510菌株為出發(fā)菌株； 所述的培養(yǎng)基為:玉米粉15~25g、豆餅粉20~35g、葡萄糖15~25g、淀粉8~12g、氯化銨I~5g、碳酸鈣I~5g,硫酸鎂0.1~0.5g,硫酸亞鐵0.1~0.5g,氯化鈉0.1~.0.5g,磷酸氫二鈉0.1~0.5g，加自來水至1000mL ； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:搖床震蕩培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵溫度:25~35°C,罐壓0.01~.0.15MPa，通氣量1:0.5 ~ I，發(fā)酵時間50~IOOh ； 所述的發(fā)酵產(chǎn)物分離和純化為:發(fā)酵液萃取，用Sephadex G_25柱層析，水洗脫，洗脫液經(jīng)HPLC檢測后(C0SM0SILC18Econopak柱，流動相0.03三氟醋酸水溶液，流速0.4mL/min，紫外檢測波長220nm)，將其中保留時間約為5.5min的主要組分含量在75~85%和60~75%的部分分別合并，再經(jīng)真空冷凍干燥后即可得到初次分離物。含量在60~75%的初提物再經(jīng)一次常壓柱 層析，即可將純度提高到80~85%，合并兩次所得的含量在75%以上的樣品，用HPLC半制備柱進行制備，最后可得到純度為90.12%的精品。將精品溶液冷干后，所得微黃色粉末即為側鏈-C4H9O9的氮取代胞苷素；效價測定:管碟法； 所述的化學修飾是以KCl為原料，以正丁醇為溶劑。
【文檔編號】C12R1/465GK103805655SQ201210442158
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月7日 優(yōu)先權日:2012年11月7日
【發(fā)明者】胡曉, 王理想, 王友志, 郭麥平, 胡丹紅, 胡曼曼 申請人:徐州瑞賽科技實業(yè)有限公司