專利名稱：一種預(yù)測前列腺癌易感性的方法和檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測前列腺癌易感性的方法和檢測試劑盒，更具體的說是通過測定與前列腺癌相關(guān)基因RFX6的3’端附近rs617426位點多態(tài)性預(yù)測受試者對于前列腺癌的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷和新藥開發(fā)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
前列腺癌(prostate cancer, PCa)是發(fā)生在男性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。美國在對1975-2006癌癥發(fā)病率進行統(tǒng)計后，估算2010年P(guān)Ca新發(fā)病例為217，730例，位居男性好發(fā)腫瘤中第一位，PCa的死亡人數(shù)估計為32，050，在男性腫瘤死亡率中位居第二。年齡是PCa的一個重要風(fēng)險因素，年齡45歲以下的基本很少發(fā)病，隨年齡的增長而增加。美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，40歲以下的男性PCa發(fā)病率為1/8499,40-59歲男性中為1/38，60_69歲男性中為1/15，70歲以上男性中則為1/8。隨著我們國家人口老齡化，PCa的發(fā)病率在我國正逐年上升，上海標(biāo)化發(fā)病率從1973 1975年的1. 8/10萬上升至1997 1999年的
5.5/10萬，貴州省南部地區(qū)部分縣市PCa的發(fā)病率已從1994 1998年的1. 72/10萬上升到2004 2008年的4. 28/10萬，成為威脅我國男性健康的公共問題。目前進行PCa遺傳病因研究，多采用大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)研究和小樣本多人群中的驗證，并且GWAS鑒定的多個PCa易感SNPs已在多個不同人群中被復(fù)制確定，證明了 SNPs作為基因組標(biāo)志的關(guān)聯(lián)分析方法在PCa遺傳研究中的有效性。SNPs是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率需>1%，SNPs是雙等位基因標(biāo)記，這種單堿基變化中有 70. 1%為同型堿基之間的轉(zhuǎn)換如G/A或T/C，29. 1%為發(fā)生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。SNPs包含了已知多態(tài)性的80-90%，是最常見的遺傳變異。由于生存的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區(qū)的數(shù)量是編碼區(qū)的4倍，總數(shù)可達3百萬個。SNPs以其密度高(平均每Ikb就有I個)、代表性強(位于基因內(nèi)部的SNPs可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達水平)、遺傳穩(wěn)定性好(同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言)、易于自動化分析(因SNPs在人群中為雙等位基因標(biāo)記，可簡單以“+ / 一或1/0”直接分型)等特點成為很好的遺傳標(biāo)志。Rfx6(調(diào)節(jié)因子 X6)-屬于轉(zhuǎn)錄因子 RFX(regulatory factor X_box binding)
家族。位于chrl5 (54166958-54222377)，19個外顯子，編碼蛋白長度1281，一個亞型，有
B、C和D三個結(jié)構(gòu)域，主要在胰腺表達，與其他同家族RFX比表達水平較低，在胰腺的發(fā)展和功能的調(diào)節(jié)中是關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。RFX6與RFX2和RFX3直接作用，而后二者在胰腺表達并發(fā)揮作用。在胰腺中，Rfx6位于促內(nèi)分泌因子Neurog3下游,其他多種胰島轉(zhuǎn)錄因子的上游，在胰島細(xì)胞分化中發(fā)揮作用。這兩種基因的突變表現(xiàn)出相似而不同的表型。人類RFX6突變，會引起難治性腹瀉和糖尿病，腸閉鎖和膽道畸形，新生兒糖尿病。對Rfx6的充分理解有助于闡明胰島及P細(xì)胞的形成、糖尿病的發(fā)病過程。DNA-binding蛋白RFX6在新生血色沉著病的病理中發(fā)揮重要作用，血色沉著病HFE基因與前列腺癌的相關(guān)性突出了血色沉著病的病理學(xué)與前列腺癌的交互作用。GPRC6A和RFX6基因附近位點，縮窄到基因RFX6區(qū)域的SNPs與前列腺癌顯著相關(guān)，比最初的GWAS中與前列腺癌的相關(guān)位點GPRC6A/RFX6，RFX6基因變異可能是更優(yōu)先的敏感位點。2010年，Takata R等鑒定了位于RFX6基因上的rs339331和PCa風(fēng)險關(guān)聯(lián)，此后，此位點在歐洲人群和中國人群中復(fù)制驗證。rs339331位于RFX6基因第4內(nèi)含子，用59個tag SNPs覆蓋580kb區(qū)域(Chr. 6:117. 0 - 117. 6Mb)作圖分析其位于一個約200kb的關(guān)聯(lián)區(qū)段，此區(qū)域涵蓋有兩個基因GPRC6A，RFX6結(jié)合以上對RFX6功能的分析，我們推測RFX6基因為PCa易感基因并且選擇了位于其的rs617426，在273個PCa患者和606個對照人群中分型后進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果確定了 rs617426與中國人群PCa關(guān)聯(lián)。rs617426在染色體上位置為117，360，126，位于RFX6的3，端附近，rs617426是距離起始端501的SNP位點，此位點所在基因組位置可能會對基因轉(zhuǎn)錄有調(diào)節(jié)作用。經(jīng)查詢檢索，截至目前，RFX6基因rs617426與PCa風(fēng)險還未見有報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種檢測前列腺癌易感性基因的方法。本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測前列腺癌易感性基因的試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，為序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列為RFX6基因3’端附近的包含單苷酸多態(tài)性位點rs617426的核苷酸片段。圖1為RFX6基因結(jié)構(gòu)及rs617426多態(tài)性變異位點的示意圖，rs617426位點標(biāo)在RFX6基因圖中3’端附近的相應(yīng)位置。所述單苷酸多態(tài)性位點rs617426的基因型為GG時，前列腺癌易感性最高；基因型為TG或TT時，前列腺癌易感性較低。一組檢測前列腺癌易感性的引物，能擴增得到SEQ ID No.1所示的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列。所述引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。一種前列腺癌易感性基因的檢測方法，包括如下步驟(I)抽提樣品的基因組DNA，擴增RFX6基因3’端附近的包含單苷酸多態(tài)性位點rs617426的核苷酸片段；(2)檢測步驟(I)產(chǎn)物中單苷酸多態(tài)性位點rs617426的基因型，基因型為GG時，前列腺癌易感性最高；基因型為TG或TT時，前列腺癌易感性較低。所述步驟(I)中的核苷酸片段為序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rs617426位點位于該核苷酸序列的+501位。所述擴增RFX6基因3’端附近的包含單苷酸多態(tài)性位點rs617426的核苷酸片段，使用的一組引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。本發(fā)明提供了一種檢測前列腺癌易感性的診斷試劑盒，其中含有本發(fā)明特異性擴增RFX6基因3’端附近rs617426位點的引物對和用于PCR擴增檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些常規(guī)組件和檢測方法。本發(fā)明試劑盒中的全部組分、含量、來源和使用方法如下一種預(yù)測PCa的試劑盒，供10人份檢測應(yīng)用，由以下試劑組成IOu L 10XPCR 緩沖液(購自 Pharmacia)，2 U L IOmM dNTP 混合液(購自 Pharmacia),2 u L Taq DNA 聚合酶(2unit/U L)(購自 Takara),IuL Fl引物，為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/ii L ；IuL Rl引物，為SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/ii L ；8u L lOXLC-green PLUS飽和熒光染料；(購自美國Idaho公司)2L寡核苷酸內(nèi)參引物各0. 5 ii L，濃度為lOpmol/ii L，其中低溫內(nèi)參引物F為SEQID NO. 4所示的核苷酸序列，低溫內(nèi)參引物R為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫內(nèi)參引物F為SEQ ID NO. 6所示的序列，高溫內(nèi)參引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；64L 純水。使用方法DPCR擴增通過PCR擴增RFX6基因的3’端附近部分片段，制備混合液10XPCR反應(yīng)緩沖液 I U L，IO mmoI/L dNTPO. 2 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，IOpmoI/L 上游引物0. 11^，10 11101/1下游引物0.1uLjIOXLC Green PLUS飽和熒光染料0. 8 y L，寡核苷酸內(nèi)參0. 2 ii L (高、低溫寡核苷酸內(nèi)參上、下游引物各0. 05 ii L)(序列見表1)，基因組DNAl ii L，加去離子水至10 u L0 PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，總共45個循環(huán)，72°C總延伸7min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復(fù)性處理95°C 30s, 25 °C 2min，94°C 30s，24°C 4min。PCR 時于每一體系中加入 20 的石蠟油，以防止液體揮發(fā)。2)基因型判定將PCR產(chǎn)物移入HRM專用96孔板內(nèi)，在Light scanner TMHR-196上進行HRM分析,用Light Scanner Call IT軟件對采集后的曲線進行分析,根據(jù)熔解曲線的差異判定基因型。RFX6基因3’端附近單苷酸多態(tài)性位點rs617426在制備診斷或治療前列腺癌的試劑或藥物中的用途。本發(fā)明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品沒有限制，如體液(血液、腹水及尿液等)、組織細(xì)胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。調(diào)整基因組DNA的濃度，使其盡可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴增出含RFX63’端附近突變位點rs617426的核酸片段，以獲取測定的大量樣本。這種通過擴增含RFX63’端附近突變點的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測定材料。在進行基因輔助診斷時，本發(fā)明優(yōu)先適用于測定根據(jù)RFX63’端附近rs617426突變類型存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應(yīng)于用于測定rs617426基因突變類型的方法。按采用的測定方法來選擇適當(dāng)?shù)奶囟ㄔ噭?，如DNA片段和/或用于PCR擴增步驟的引物。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明首次闡明了 RFX63’端附近rs617426多態(tài)性位點與PCa的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測PCa易感性的方法和試劑盒，該方法可用于PCa的預(yù)防、輔助診斷，還可以用于新藥研發(fā)。
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步敘述，以便公眾對發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。


圖1為RFX6基因結(jié)構(gòu)及3’端附近多態(tài)性變異位點的示意2為RFX6基因3’端附近rs617426位點經(jīng)HRM分型溶解曲線3為RFX6基因3’端附近rs617426位點的測序圖
具體實施例方式用于下列實施例中表示試劑的英文縮寫如下10XPCR 緩沖液10mM Tris-HCI (pH=8. 3)，500mM 氯化鉀(KCI)，IOmM 氯化鎂(MgCI2),0. 01%(W/V)白明膠dNTP :脫氧核苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸二鈉

TE IOmM Tris-HCI (pH=7. 5)，ImM EDTA (pH=8. 0)實施例1 :血液樣本收集和基因組DNA的提取(I)PCa患者均經(jīng)組織病理學(xué)診斷，共選取來自北京和天津地區(qū)無血緣關(guān)系的PCa患者273例(年齡4693歲，平均72. 3歲)，同地區(qū)的年齡匹配的對照606例(年齡58-94歲，平均70. 4歲)，均為男性，無PCa家族史、DRE陰性并且PSA〈4ng/mL。所有受檢者均為漢族且簽署書面知情同意書，這項研究得到衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)研究所倫理審核委員會的認(rèn)可，符合世界醫(yī)學(xué)會赫爾辛基宣言人體醫(yī)學(xué)研究的倫理原則。(2)根據(jù)下列方法，制備人基因組DNA。①首先在已標(biāo)號的1.5mLEP管中加1000 y L紅細(xì)胞裂解液，后加入400 u LEDTA抗凝血(抗凝血加入前顛倒混勻3_5次)，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；②13000rpm離心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480 U I核酸裂解液，彈擊管壁，充分混勻后加入20 ii L蛋白酶K (用裂核液稀釋20倍稀釋蛋白酶K)，顛倒混勻，65°C孵箱10分鐘，(期間不時上下混勻，確保無凝塊);④取出后降至室溫，加300 UL蛋白沉淀液，充分顛倒混勻，靜置10分鐘，13000rpm離心2分鐘；⑤將上清液移至新EP管中，加入670 y L預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻(10次以上)，可見線狀DNA逐漸形成小團塊，13000rpm離心2分鐘；⑥棄上清液并確保沉淀留在EP中，加入670 u L70%乙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心2分鐘；⑦棄上清，使管內(nèi)乙醇揮發(fā)干凈；⑧加入TE溶解液(400 u L)，充分溶解，然后對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分析，吸取部分DNA溶液作為工作液，濃度校正至20ng/U L，放置于4°C備用，剩余基因組DNA置_20°C冰箱保存。 實施例2SNP的識別鑒定本發(fā)明采用PCR-高分辨率溶解曲線(HRM)分析法和PCR測序技術(shù)同時對RFX6的3’ near gene區(qū)的rs617426位點(其等位位點為T/G)的基因型進行檢測。I) PCR-HRM弓丨物的確定從Genebank中查取rs617426附近的DNA堿基序列(SEQ ID NO.1),引物設(shè)計在01igo6. 0和primer5. 0軟件下完成。目的片段定位在RFX6基因3’near gene區(qū)，全長70bp，確定了正義鏈Fl (+453bp—+470bp)與反義鏈Rl (+503bp—+572bp)，特異性引物序列如下Fl :5’ -AGGCATGGATATGATATG-3’ (SEQ ID NO. 2)Rl :5，-GAGATTAAGGAGTCAAGTAG-3’ (SEQ ID NO. 3)2 ) PCR-HRM反應(yīng)體系及條件通過PCR擴增RFX6的3’ near gene基因區(qū)的rs617426位點所在片段，PCR反應(yīng)體系為:10\ 0 反應(yīng)緩沖液11^，10臟01/1 dNTPO. 2 u L, Taq DNA聚合酶 0. 2 y L，IOpmol/L 上游引物 0. 11^，10 11101/1下游引物0.1uLjIOXLC Green PLUS 飽和熒光染料 0. 8 y L，寡核苷酸內(nèi)參0. 2 y L (高、低溫寡核苷酸內(nèi)參上、下游引物各0. 05 y L) 3’端C3封閉，阻止延伸，見表1)，基因組DNA I ii L，加去離子水至IOii L。PCR時于每一體系中加入20 ii I的石蠟油，防止液體揮發(fā)。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，總共45個循環(huán)，72°C總延伸7min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復(fù)性處理95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s，24。。4min。表I高、低溫寡核苷酸內(nèi)參引物序列、退火溫度及產(chǎn)物片段長度
權(quán)利要求
1.一種檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于為序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列為RFX6基因3’端附近的包含單苷酸多態(tài)性位點rs617426的核苷酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于所述單苷酸多態(tài)性位點rs617426的基因型為GG時，前列腺癌易感性最高；基因型為TG或TT時，前列腺癌易感性較低。
4.一組檢測前列腺癌易感性的引物，其特征在于能擴增得到權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一組檢測前列腺癌易感性的引物，其特征在于所述引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。
6.一種前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特征在于包括如下步驟 (1)抽提樣品的基因組DNA，擴增RFX6基因3’端附近的包含單苷酸多態(tài)性位點rs617426的核苷酸片段； (2)檢測步驟(I)產(chǎn)物中單苷酸多態(tài)性位點rs617426的基因型，基因型為GG時，前列腺癌易感性最高；基因型為TG或TT時，前列腺癌易感性較低。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特征在于所述步驟(I)中的核苷酸片段為序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rs617426位點位于該核苷酸序列的+501位。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特征在于所述擴增RFX6基因3’端附近的包含單苷酸多態(tài)性位點rs617426的核苷酸片段，使用的一組引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。
9.一種檢測前列腺癌易感基因的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成 IOu L 10 X PCR 緩沖液； 2u L IOmM dNTP 混合液； 2u L Taq DNA 聚合酶，2unit/ U L ； IuL Fl引物，為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/y L ; IuL Rl引物，為SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，濃度為IOpmol/u L ； 8u L lOXLC-green PLUS 飽和熒光染料； 2u L寡核苷酸內(nèi)參引物各0. 5 ii L，濃度為lOpmol/ u L，其中低溫內(nèi)參引物F為SEQ IDNO. 4所示的核苷酸序列，低溫內(nèi)參引物R為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫內(nèi)參引物F為SEQ ID NO. 6所示的序列，高溫內(nèi)參引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列； 64 ii L純水。
10.RFX6基因3’端附近單苷酸多態(tài)性位點rs617426在制備診斷或治療前列腺癌的試劑或藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)測前列腺癌易感性的方法和檢測試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過提取宿主細(xì)胞的基因組DNA，測定受試者的RFX6基因3’端附近rs617426位點的基因型，預(yù)測受試者對前列腺癌的易感性；RFX6基因3’端附近的rs617426的基因型為GG時，受試者的易感性最高；rs617426的基因型為TG或TT時，受試者的易感性較低。本發(fā)明的優(yōu)點是首次闡述了rs617426基因多態(tài)性位點與前列腺癌的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測前列腺癌易感性的方法，該方法可用于前列腺癌的早期預(yù)防診斷、輔助診斷，還可以用于新藥研發(fā)。
文檔編號C12N15/11GK103060432SQ20121039864
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者楊澤, 趙承孝, 劉銘, 王建業(yè), 史曉紅, 魏東, 朱小泉, 楊帆, 張耀光, 梁思穎, 王飛, 唐雷, 孫亮 申請人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院