專利名稱：一種離體萌發(fā)法測定石蒜屬植物花粉活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物花粉活力測定領(lǐng)域，尤其涉及一種離體萌發(fā)法測定石蒜屬植物花粉活力的方法。
背景技術(shù)：
石蒜屬植物是一類極具觀賞價值的植物，花朵碩大，色彩鮮艷，因其耐陰性強，在園林綠化中，多被種植于林下、林緣、草地邊緣等。我國的石蒜屬植物資源非常豐富，但絕大多數(shù)還處于野生狀態(tài)，人工種植品種仍然十分單一，因此選育石蒜的新品種，有助于推廣石蒜屬植物在園林綠化中的應(yīng)用。
在植物的常規(guī)育種中，為了進行人工輔助授粉或雜交授粉，需要早期采集和貯存花粉，尤其在雜交育種工作中，研究花粉的活力是必不可少的基礎(chǔ)性工作，通常在使用采集和貯存的花粉之前，需要做花粉活力的測定。測定花粉活力是傳統(tǒng)雜交育種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前對于花粉活力的測定主要有三類方法，第一類為花粉染色法，第二類方法為田間授粉法，第三類為花粉離體萌發(fā)法?；ǚ廴旧ㄊ峭ㄟ^使用化學(xué)試劑對花粉進行染色，根據(jù)染色后的花粉顏色的深淺判斷花粉的活力狀況，染色法主要有碘-碘化鉀染色法、醋酸洋紅染色法、TTC染色法等。這類方法快速、簡便，但由于不同植物花粉壁厚度、淀粉含量、有關(guān)酶含量不同，染色法在不同植物應(yīng)用的效果差異也較大。田間授粉法是通過人工采集花粉并對花絲授粉，果實成熟后計算授粉結(jié)實率，這是一種直接、可靠的方法，但是費時、費力，受季節(jié)、天氣影響較大?；ǚ鄣碾x體萌發(fā)法是將采集的花粉進行體外的萌發(fā)實驗，統(tǒng)計萌發(fā)率，此種方法快速、簡單，準確度也較高，但是由于不同種類植物的花粉體外萌發(fā)的條件會有區(qū)別，例如培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度等，需要對植物花粉的離體培養(yǎng)條件有比較好的把握。石蒜屬植物的花粉形態(tài)為兩側(cè)對稱，赤道面觀呈舟形或腎形，極面觀為橢圓形或長橢圓形。目前，國內(nèi)外對于石蒜屬花粉的研究大多集中在石蒜屬系統(tǒng)關(guān)系和種間分類方面，并未發(fā)現(xiàn)有效的鑒定石蒜屬花粉活力的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種離體萌發(fā)法測定石蒜屬植物花粉活力的方法，該方法可以快速、有效地測定石蒜屬植物的花粉活力。一種離體萌發(fā)法測定石蒜屬植物花粉活力的方法，包括收集花粉，將所述花粉置于培養(yǎng)液中進行離體培養(yǎng)，所述培養(yǎng)液的配方為鹿糖30 80g/L,硼酸15 25mg/L ；所述離體培養(yǎng)的溫度為25 35°C，時間為60 90min，相對濕度70 90%。花粉的離體萌發(fā)法是測定花粉活力的有效方法，結(jié)果可重復(fù)性高，一般包括如下步驟收集花粉，將花粉置于培養(yǎng)液中進行離體培養(yǎng)，顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，統(tǒng)計花粉萌發(fā)率?；ǚ鄣拿劝l(fā)能力是反映花粉活力的指標之一，因花粉只有萌發(fā)并長出花粉管，才能穿過花柱，進入子房，完成受精作用?；ǚ鄣拿劝l(fā)能力通常以花粉萌發(fā)率來表示，通過統(tǒng)計花粉的萌發(fā)率可以測定花粉的活力。離體培養(yǎng)的培養(yǎng)液、溫度、時間是影響測定準確率的主要因素，本發(fā)明對培養(yǎng)溫度、時間、培養(yǎng)液配方進行了優(yōu)化，能夠快速測定所述花粉的活力。本發(fā)明所述石蒜屬植物是指忽地笑、換錦花或中國石蒜。所述收集花粉的方法為采集即將開裂的花藥，置于干燥的器皿中干燥3 6天，直至花粉完全開裂，然后收集花粉。為了便于收集花粉，可在器皿中放入一層硫酸紙。當(dāng)然， 也可以直接在開裂的花藥上采集。離體培養(yǎng)時，可將花粉均勻散布在凹形載玻片上，滴加2 3滴培養(yǎng)液，輕輕混勻，靜置培養(yǎng)，過多培養(yǎng)液容易溢出載玻片。不同植物花粉離體萌發(fā)需要不同的培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的各組分影響花粉的萌發(fā)，本發(fā)明的離體培養(yǎng)的培養(yǎng)液由蔗糖、硼酸和水組成。蔗糖不僅是花粉萌發(fā)和花粉管伸長主要營養(yǎng)物質(zhì)來源，還維持著外界環(huán)境的滲透壓，蔗糖濃度過低，會導(dǎo)致外界蔗糖濃度低于花粉內(nèi)部的滲透壓，花粉壁破裂，內(nèi)容物析出，花粉失去生活力，而蔗糖濃度過高時，又會造成花粉的質(zhì)壁分離從而抑制萌發(fā)，本發(fā)明蔗糖濃度優(yōu)選為40 60g/L。硼酸能夠增加花粉對蔗糖的吸收、運轉(zhuǎn)和代謝，形成糖硼酸復(fù)合體，增加氧的吸收，并促進構(gòu)成花粉管的成分-果膠物的合成，從而促進花粉萌發(fā)和花粉管生長，所述硼酸的濃度優(yōu)選為20 25mg/L。花粉的萌發(fā)是花粉細胞內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)的結(jié)果，而生理生化反應(yīng)的有序進行必然需要適宜的溫度，離體培養(yǎng)一定時間后，花粉的萌發(fā)率和花粉管生長處于穩(wěn)定狀態(tài)，優(yōu)選的，所述離體培養(yǎng)的溫度為27 30°C。此外，在花粉的離體培養(yǎng)過程中，為了防止所述培養(yǎng)液的蒸發(fā)，離體培養(yǎng)時，保持環(huán)境的相對濕度為70% 90%?；ǚ垭x體培養(yǎng)一段時間后，將負載花粉的載玻片置于顯微鏡下觀察，以花粉管長度達到花粉粒本身長度的I倍及以上的花粉視為萌發(fā)，統(tǒng)計萌發(fā)率。本發(fā)明對石蒜屬植物花粉的離體培養(yǎng)條件進行了探索，為石蒜屬植物花粉活力的測定提供了一種簡單、快速、可行的方法，為石蒜屬植物的雜交育種提供基礎(chǔ)。


圖I為換錦花花粉離體培養(yǎng)60min的圖像；圖2為換錦花花粉離體培養(yǎng)80min的圖像；圖3為忽地笑花粉離體培養(yǎng)40min的圖像；圖4為忽地笑花粉離體培養(yǎng)60min的圖像；圖5為中國石蒜花粉離體培養(yǎng)60min的圖像；圖6為中國石蒜花粉離體培養(yǎng)90min的圖像。
具體實施例方式實施例I(I)將未開裂的換錦花花藥放入裝有硫酸紙的干燥培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于盛有變色硅膠的室內(nèi)干燥器中4天，至花粉散出。(2)用解剖針取適量花粉入凹形載玻片中，輕輕滴加含有蔗糖50g/L，硼酸20mg/L的培養(yǎng)液2 3滴，輕輕混勻。(3)將載玻片輕輕放入相對濕度80%的保濕盒中，置于27°C的環(huán)境中培養(yǎng)60min。(4)輕輕取出載玻片，防止劇烈震動，以防花粉管斷裂，置于60倍顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況，視野內(nèi)觀察到具有活力的花粉萌發(fā)出花粉管，長約花粉粒本身長度I 4倍，此時便于統(tǒng)計換錦花的花粉萌發(fā)率。
(5)若將載玻片繼續(xù)放入保濕盒培養(yǎng)，20min后于顯微鏡下觀察，可觀察到花粉管萌發(fā)更長，相互纏繞在一起?；ǚ勖劝l(fā)的標準是花粉管長度為花粉粒本身長度的I倍及以上。萌發(fā)率=萌發(fā)的花粉數(shù)/總花粉粒數(shù)挑選10個視野，每個視野中花粉粒數(shù)大于50粒，計算10個視野的萌發(fā)率平均值即為花粉的萌發(fā)率。表I換錦花花粉萌發(fā)率
權(quán)利要求
1.一種離體萌發(fā)法測定石蒜屬植物花粉活力的方法，包括收集花粉，將所述花粉置于培養(yǎng)液中進行離體培養(yǎng)，其特征在于， 所述培養(yǎng)液的配方為鹿糖30 80g/L,硼酸15 25mg/L ； 所述離體培養(yǎng)的溫度為25 35°C，時間為60 90min，相對濕度70% 90%。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述石蒜屬植物為忽地笑、換錦花或中國石蒜。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述蔗糖的濃度為40 60g/L，硼酸的濃度為 20 25mg/L。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述離體培養(yǎng)的溫度為27 30°C。
5.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述收集花粉的方法為采集即將開裂的花藥，置于干燥的器皿中干燥3 6天，直至花粉完全開裂，收集花粉。
6.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述石蒜屬植物為忽地笑；所述培養(yǎng)液配方為蔗糖40g/L，硼酸20mg/L ;所述離體培養(yǎng)的溫度為30°C，時間為60min，相對濕度80%。
7.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述石蒜屬植物為換錦花；所述培養(yǎng)液配方為鹿糖50g/L，硼酸20mg/L ;所述離體培養(yǎng)的溫度為27°C，時間為60min，相對濕度80%。
8.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述石蒜屬植物為中國石蒜；所述培養(yǎng)液配方為蔗糖60g/L，硼酸25mg/L ;所述離體培養(yǎng)的溫度為27°C，時間為90min，相對濕度75%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種離體萌發(fā)法測定石蒜屬植物花粉活力的方法，包括收集花粉，將所述花粉置于培養(yǎng)液中進行離體培養(yǎng)，所述培養(yǎng)液的配方為蔗糖30～80g/L，硼酸15～25mg/L；所述離體培養(yǎng)的溫度為25～35℃，時間為60～90min，相對濕度70％～90％。本發(fā)明對石蒜屬植物花粉的離體培養(yǎng)條件進行了探索，為石蒜屬植物花粉活力的測定提供了一種簡單、快速、可行的方法，為石蒜屬植物的雜交育種提供基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/06GK102876768SQ20121035231
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者肖郁綿, 夏宜平, 常樂, 佘琳芳 申請人:浙江大學(xué)